BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC VINH HOÀNG VĂN TRUNG NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN DINH DƯỠNG VÀ HỢP CHẤT CÓ HOẠT TÍNH SINH HỌC TỪ MỘT SỐ... Ngày nay các nhà khoa học đang nghiên cứu dinh
Trang 1BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC VINH
HOÀNG VĂN TRUNG
NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN DINH DƯỠNG VÀ HỢP CHẤT CÓ HOẠT TÍNH SINH HỌC TỪ MỘT SỐ
Trang 2Công tri ̀nh đươ ̣c hoàn thành ta ̣i:
Phò ng thí nghiê ̣m Chuyên đề Hữu cơ, khoa Hóa ho ̣c,
Trường Đa ̣i ho ̣c Vinh
Người hướng dẫn khoa ho ̣c:
1 GS TS Trần Đi ̀nh Thắng
2 PGS TS Đinh Thị Trường Giang Pha ̉ n biê ̣n 1: PGS.TS Đặng Ngọc Quang
Pha ̉ n biê ̣n 2: PGS.TS Đỗ Quang Huy
Pha ̉ n biê ̣n 3: PGS.TS Hoàng Văn Lựu
Luận án được bảo vê ̣ ta ̣i Hô ̣i đồng đánh giá luâ ̣n án cấp Trường ho ̣p ta ̣i: Phòng bảo vệ, tầng 6, Nhà Công nghệ cao Trường Đại học Vinh
vào hồi giờ phút, ngày tháng năm 2019
Có thể tìm hiểu luâ ̣n án ta ̣i thư viê ̣n:
1 Thư viê ̣n Quốc gia Viê ̣t Nam
2 Trung tâm Thông tin & Thư viê ̣n Nguyễn Thúc Hào – Trường Đa ̣i ho ̣c Vinh
Trang 3ra, trong nấm còn chứa nhiều hoạt chất có tính sinh học, góp phần tăng cường hệ miễn dịch, tăng cường sức khỏe, hỗ trợ phòng và điều trị bệnh cho con người Ngày nay các nhà khoa học đang nghiên cứu dinh dưỡng, thành phần hóa học
và hoạt tính sinh học của một số loài nấm và phát hiện nhiều hợp chất có hoạt tính sinh học cao như tăng cường hệ miễn dịch, điều trị viêm gan, ung thư, HIV… Trong khi đó, Việt Nam là một trong những quốc gia có đa dạng sinh học cao trên thế giới với cấu trúc địa chất độc đáo, địa lý thủy văn đa dạng, khí hậu nhiệt đới gió mùa, những kiểu sinh thái khác nhau… đã góp phần tạo nên sự đa dạng của khu hệ nấm Việt Nam Đến năm 2015, có hơn 2500 loài nấm đã được ghi nhận, trong số đó khoảng 1400 loài thuộc 120 chi là những loài nấm lớn
Các loài nấm lớn của Việt Nam có giá trị tài nguyên, có hơn 50 loài là nấm
ăn như: các loài mộc nhĩ, ngân nhĩ, nấm hương (Lentinula edodes), nấm rơm, nấm mối, nấm thông (Boletus edulis), nấm chàm (Boletus aff felleus), nấm bào ngư (Pleurotus spp.), nấm mào gà (Cantherellus cibarius), nấm ngọc châm (Hypsizigus marmoreus), nấm kim châm (Flammulina velutipes) Có khoảng
hơn 200 loài nấm dùng làm dược liệu, trong đó có rất nhiều loài là dược liệu quý
như: linh chi (G.lucidum), linh chi sò (G.capense), cổ linh chi (G.applanatum), nấm vân chi (Tramethers versicolor), nấm phiến chi (Schizophyllum commune), nấm hương (Lentinula edode), nấm kim châm (Flammulina velutipes), đông trùng
hạ thảo (Cordycep sinensis, Cordycep militaris) Những nghiên cứu bước đầu về
các hợp chất có hoạt tính sinh học của một số nấm lớn Việt Nam cho thấy chúng rất giàu các hợp chất có trọng lượng phân tử lớn như polysaccharide, polysaccharide-peptide, lectin, các chất có trọng lượng phân tử nhỏ như: flavonoid, steroid, terpenoid… có tác dụng chống viêm, tăng cường đáp ứng miễn dịch, hỗ trợ điều trị các bệnh hiểm nghèo như: ung thư, tim mạch… Khoảng 50 loài nấm có khả năng sinh enzym và một số hoạt chất quý có thể được ứng dụng trong công nghệ sinh học và bảo vệ môi trường
Nghệ An là tỉnh có nhiều vườn quốc gia như: vườn Quốc gia Pù Mát, khu bảo tồn thiên nhiên Pù Huống và khu bảo tồn thiên nhiên Pù Hoạt Đây là những vùng được đánh giá là có tính đa dạng sinh học rất cao, tại đây có chứa đựng nguồn lợi rất lớn về đa dạng sinh học, trong đó có nguồn lợi lớn về nấm và có thể
sử dụng chúng làm nguyên liệu tốt cho ngành công nghiệp thực phẩm, dược phẩm…
Trang 4Các nghiên cứu về nấm ở Việt Nam vẫn còn là một vấn đề khá mới, chưa nhận được sự quan tâm đúng mức của các nhà khoa học Do vậy, việc nghiên cứu
về nấm là một yêu cầu bức thiết, có ý nghĩa lý luận và thực tiễn, góp phần quan trọng trong việc tìm hiểu nguồn tài nguyên thiên nhiên, về giá trị kinh tế và tầm quan trọng của nguồn dược liệu thiên nhiên Vì lý do đó chúng tôi đã chọn đề tài:
“Nghiên cứu thành phần dinh dưỡng và hợp chất có hoạt tính sinh học từ một số loài nấm lớn ở vùng Bắc Trung bộ”
2 Đối tượng nghiên cứu
Đối tượng nghiên cứu của luận án là dịch chiết các loài nấm: Ganoderma
applanatum (Mush 01), Daldinia concentrica (Mush 02), Ganoderma lucidum
(Mush 03), Ganoderma lobatum (Mush 04), Ganoderma philippii (Mush 05),
Ganoderma multiplicatum (Mush 06), Fomitopsis dochmius (Mush 07) và
Trametes gibbosa (Mush 08) ở vùng Bắc Trung Bộ của Việt Nam
3 Nhiệm vụ nghiên cứu
- Chiết chọn lọc với các dung môi thích hợp để thu được hỗn hợp các hợp
chất từ các loài dịch chiết của loài nấm Ganoderma applanatum (Mush 01),
Daldinia concentrica (Mush 02), Ganoderma lucidum (Mush 03), Ganoderma lobatum (Mush 04), Ganoderma philippii (Mush 05), Ganoderma multiplicatum
(Mush 06), Fomitopsis dochmius (Mush 07) và Trametes gibbosa (Mush 08)
- Xác định thành phần dinh dưỡng như: thành phần khoáng và nguyên tố vi
lượng, acid amin, vitamin A, vitamin E
- Xác định hàm lượng ergosterol và ergosterol peroxide
- Phân lập và xác định cấu trúc một số hợp chất từ hai quả thể nấm
Ganoderma applanatum (Mush 01), Daldinia concentrica (Mush 02)
- Thử hoạt tính sinh học của một số hợp chất phân lập được
4 Phương pháp nghiên cứu
- Phương pháp lấy mẫu: mẫu sau khi lấy về được rửa sạch, sấy khô ở 400C Việc xử lý các mẫu bằng phương pháp chiết chọn lọc với các dung môi thích hợp
để thu được hỗn hợp các hợp chất dùng cho nghiên cứu được nêu ở phần thực nghiệm
- Phân tích thành phần dinh dưỡng: đã sử dụng các phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) với các detector khác nhau và phương pháp phổ khối lượng plasma cảm ứng (ICP – MS), phương pháp quang phổ hấp thụ nguyên tử với kỹ thuật nguyên tử hóa hỉđrua (HG - AAS), phương pháp quang phổ hấp thụ nguyên tử với kỹ thuật nguyên tử hóa bằng ngọn lửa (F - AAS)
- Phương pháp phân tích, tách các hỗn hợp và phân lập các chất: đã sử dụng
các phương pháp sắc ký cột thường (CC), sắc ký lớp mỏng (TLC), sắc ký cột nhanh (FC) với các pha tĩnh khác nhau như silica gel, sephadex LH-20, RP18, sắc
ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) trên các pha đảo và pha thường
- Phương pháp khảo sát cấu trúc các hợp chất: cấu trúc hoá học các hợp chất phân lập, được xác định bằng các phương pháp vật lý hiện đại như phổ tử ngoại
Trang 5(UV), phổ hồng ngoại (IR), phổ khối lượng va chạm electron (EI-MS), phổ khối lượng phun mù electron (ESI-MS), phổ khối lượng phân giải cao (HR-MS), phổ cộng hưởng từ hạt nhân một chiều (1D-NMR) và hai chiều (2D-NMR) với các kỹ thuật khác nhau như 1H-NMR, 13C-NMR, DEPT, 1H-1H COSY, HSQC và HMBC
đã được sử dụng
- Phương pháp thăm dò các hoạt tính sinh học gây độc tế bào ung thư và kháng viêm
5 Những đóng góp mới của luận án
- Lần đầu tiên ở Việt Nam đã tiến hành nghiên cứu thành phần dinh dưỡng
của 08 loài nấm lớn: Ganoderma applanatum (Mush 01), Daldinia concentrica (Mush 02), Ganoderma lucidum (Mush 03), Ganoderma lobatum (Mush 04),
Ganoderma philippii (Mush 05), Ganoderma multiplicatum (Mush 06), Fomitopsis dochmius (Mush 07) và Trametes gibbosa (Mush 08) ở vùng Bắc
D Từ dịch chiết quả thể nấm cổ linh chi Ganoderma applanatum thu được 05
hợp chất bao gồm: Ergosterol (GAM1), 3β-ol (GAM2), ergosta-7,22-dien-3β-ol (GAM3), lanosta-7,9(11),24-triene-3,26- diol (GAM4), 3β-hydroxy-5α-lanosta-7,9,24(E)-trien-26-oic acid (GAM5).Trong
5α,8α-epidioxy-22E-ergosta-6,22-dien-đó các hợp chất GAM3, GAM4, GAM5 lần đầu tiên phân lập từ loài nấm này
- Lần đầu tiên tiến hành thử hoạt tính gây độc tế bào ung thư với các dòng
tế bào ung thư khác nhau của 5 hợp chất (DCM1, DCM2, DCM3, DCM4, DCM5) Các hợp chất DCM2 và DCM3 cho thấy độc tính tế bào yếu đối với tất
cả các dòng tế bào khối u được thử nghiệm với các giá trị IC50 nằm trong khoảng
23,0 ± 1,1 và 58,2 ± 2,3 M Các hợp chất DCM4 và DCM5 cho thấy độc tính tế
bào yếu đối với các tế bào HepG2 và Hep3B với các giá trị IC50 nằm trong khoảng 21,5 ± 5,1 và 46,9 ± 3,7 μM và chúng không có hoạt tính đáng kể đối với nồng độ thử nghiệm cao nhất đối với SK-LU-1 và dòng tế bào SW480
6 Cấu trúc của luận án
Luận án bao gồm 120 trang với 23 bảng số liệu, 62 hình và 5 sơ đồ với 130 tài liệu tham khảo Kết cấu của luận án gồm: mở đầu (4 trang), tổng quan (25
Trang 6trang), phương pháp và thực nghiệm (21 trang), kết quả và thảo luận (55 trang), kết luận (2 trang), danh mục công trình công bố (1 trang), tài liệu tham khảo (12 trang) Ngoài ra còn có phần phụ lục gồm 76 phổ của một số hợp chất chọn lọc
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN
Luận án đã tiến hành tổng quan tài liệu các nội dung:
1 Thành phần dinh dưỡng của nấm
- Giới thiệu về hàm lượng chất khô; Protein và acid amin; carbohydrate, Lipid; Vitamin và Khoáng chất trong nấm
2 Chi Daldinia
- Giới thiệu đặc điểm chung về hình thái chi Daldinia
- Thành phần hóa học chi Daldinia
3 Nấm than (Daldinia concentrica)
4 Chi linh chi (Ganoderma)
- Giới thiệu về đặc điềm hình thái
- Thành phần hóa học và hoạt tính sinh học
5 Nấm cổ linh chi (
Ganoderma applanatum)
- Giới thiệu về đặc điểm và sự phân bố loài nấm Ganoderma applanatum
- Thành phần hóa học của Ganoderma applanatum
- Hoạt tính sinh học của Ganoderma applanatum
CHƯƠNG 2: PHƯƠNG PHÁP VÀ THỰC NGHIỆM 2.1 Phương pháp nghiên cứu
2.1.1 Phương pháp lấy mẫu:
Các mẫu nấm bao gồm: Ganoderma applanatum (Mush 01), Daldinia
concentrica (Mush 02), Ganoderma lucidum (Mush 03), Ganoderma lobatum
(Mush 04), Ganoderma philippii (Mush 05), Ganoderma multiplicatum (Mush 06), Fomitopsis dochmius (Mush 07) và Trametes gibbosa (Mush 08) được thu
hái ở vườn quốc gia Pù Huống, Pù Mát- Nghệ An, Việt Nam vào tháng 08 năm
2015 Mẫu được định danh bởi PGS.TS Ngô Anh, khoa Sinh, Trường Đại học khoa học Huế Tiêu bản (Vinh-TSWu-20150815) được lưu giữ tại Viện Công nghệ Hóa, Sinh và Môi trường, Trường Đại học Vinh
2.1.2 Phương pháp chiết xuất, phân lập, xác định cấu trúc các chất phân lập được:
Sắc ký lớp mỏng (TLC); sắc ký cột thường (CC); sắc ký cột nhanh (FC); sắc
ký lỏng hiệu năng cao (HPLC); Sắc ký lỏng siêu hiệu năng (UPLC)
2.1.3 Phương pháp khảo sát cấu trúc các hợp chất:
Phổ tử ngoại (UV); phổ hồng ngoại (IR); phổ khối lượng (ESI-MS), ESI-MS); phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H-NMR; phổ cộng hưởng từ hạt nhân 13C-
Trang 7(HR-NMR; phổ cộng hưởng từ hạt nhân DEPT, HMBC, HSQC; cấu trúc lập thể tương của các hợp chất này được xác định các phương pháp phổ NMR
2.1.4 Phuơng pháp thử hoạt tính sinh học
Quá trình thử hoạt tính ở Viện Hóa học các hợp chất thiên nhiên được thực hiện theo phương pháp Skehan, Likhitwitayawuid, Vander, Vlietlinck, McKane
2.2 Hóa chất và thiết bị
2.2.1 Hoá chất: Các dung môi để ngâm chiết mẫu nấm đều dùng loại tinh khiết
(pure), khi dùng cho các loại sắc ký lớp mỏng, sắc ký cột nhanh sử dụng loại tinh khiết phân tích (PA)
2.2.2 Thiết bị: sắc ký lớp mỏng (TLC); sắc ký cột (CC); sắc ký lỏng hiệu năng
cao (HPLC); phổ tử ngoại (UV); phổ hồng ngoại (FT-IR); phổ khối lượng (MS); phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR); điểm nóng chảy; độ quay cực riêng
2.3 Nghiên cứu thành phần các chất dinh dưỡng có trong các loài nấm lớn vùng Bắc Trung Bộ
2.3.1 Xác định thành phần khoáng và các nguyên tố vi lượng
2.3.1.1 Xử lý mẫu phân tích
Các mẫu xác định hàm lượng khoáng, nguyên tố vi lượng được tiến hành theo quy trình AOAC
2.3.1.2 Điều kiện đo để định lượng khoáng và các nguyên tố vi lượng
Chúng tôi lựa chọn các điều kiện và thông số máy đo ICP-MS Agilent 7500
để xác định Ge Selen được xác định bằng phương pháp AAS sử dụng kỹ thuật nguyên tử hóa bằng hơi hiđrua (HG-AAS) Na, K, Ca, Mg, Fe, Cu, Zn được xác định bằng phương pháp quang phổ hấp thụ nguyên tử dùng kỹ thuật nguyên tử
hóa bằng ngọn lửa (F-AAS)
2.3.2 Xác định hàm lượng acid amin
2.3.2.1 Chuẩn bị và xử lí mẫu phân tích acid amin
Mẫu nấm xay nhỏ và được bảo quản trong điều kiện thích hợp Quy trình xử
lý mẫu và phân tích theo Agilent
2.3.2.2 Tiến hành phân tích trên máy HPLC
Pha động B: Cân 1,36 0,025 g NaCH3COO.3H2O + 100 ml H2O Điều chỉnh pH về pH = 7,2 0,05 bằng acid acetic 2% Thêm hỗn hợp gồm 200 ml acetonitrin và 200 ml methanol
Detector: huỳnh quang (FLD) từ bước sóng λEx= 340, λEm= 455 nm
Trang 82.3.3.1 Chuẩn bị và xử lí mẫu phân tích vitamin A và vitamin E
Quy trình xử lý mẫu xác định vitamin A và vitamin E được thực hiện theo AOAC
2.3.3.2 Tiến hành phân tích vitamin A trên máy HPLC
- Detector: Đo huỳnh quang (FLD) bước sóng λEx= 292nm, λEm= 330 nm
2.4 Xác định hàm lượng ergosterol và ergosterol peroxide
Trang 92.5 Nghiên cứu các hợp chất từ loài nấm than (D concentrica)
2.5.1 Chiết xuất, phân lập, xác định cấu trúc các hợp chất phân lập được
Quả thể nấm than (D concentrica) (8,6 kg) được phơi khô, nghiền nhỏ, ngâm chiết 3 lần bằng dung môi methanol (10L x 3) ở nhiệt độ phòng, thu được dịch chiết được cất giảm áp suất bằng thiết bị quay cất chân không thu được cao methanol (180g) Cao methanol được hòa tan trong nước và chiết phân bố với dung môi ethylacetate, chưng cất chân không thu được hai phần: cao ethylacetate (105g) và dịch chiết nước
Cao ethylacetate được tiến hành sắc ký cột silica gel với hệ dung môi acetone (100:0; 25:1; 15:1; 10:1; 7:1; 5:1) và hệ dung môi CHCl3:CH3OH (100:0; 6:1; 3:1; 2:1; 1:1) thu được 7 phân đoạn chính (kí hiệu từ F1 đến F7) (sơ đồ 2.1) Phân đoạn F1 (8,6 g) được tiến hành sắc ký cột silica gel (200 gam, 60 x 5 cm) rửa giải bằng hệ dung môi hexane:acetone (100:0; 25:1; 15:1; 10:1; 4:1), mỗi
hexane-hệ dung môi sử dụng 250 ml, thu được 7 phân đoạn (kí hiệu từ F1.1 đến F1.7) Phân đoạn F1.4 (1,0 g) đã được sắc ký trên cột silica gel (200 gam, 60 x 5 cm) với
hệ dung môi rửa giải hexane:acetone (100:0; 25:1; 15:1; 10:1; 4:1, mỗi hệ dung môi sử dụng 250 ml) thu được hợp chất DCM7 (153 mg) Phân đoạn F1.6 (0,3g) được tiến hành sắc ký cột với hệ dung môi rửa giải hexane:acetone (100:0; 25:1; 15:1; 10:1; 4:1) thu được hợp chất DCM3 (5mg) Phân đoạn F1.7 (0,5 g) được tiến hành sắc ký cột pha đảo RP-18 (100 gam, 60x3cm) với hệ dung môi giải hấp
CH3OH:H2O thu được DCM1 (134 mg)
Phân đoạn F2 (2,3 g) tiếp tục sắc ký cột silica gel (200 gam, 60x3 cm) với hệ dung môi rủa giải hexane:acetone (9:1 ; 6:1, mỗi hệ dung môi sử dụng 200 ml) thu được sáu phân đoạn nhỏ (ký hiệu từ F2.1 đến F2.6) Phân đoạn F2.6 (0,5 g) được tiến hành sắc ký cột Sephadex LH-20 (50 gam, 60x3cm) được giải hấp với
hệ dung môi CH3OH:H2O thu được hợp chất DCM6 (41 mg)
Phân đoạn F3 (2,7 g) được sắc ký cột silica gel (200 gam, 60×3,2 cm) được rửa giải bằng hệ dung môi hexane:acetone (9:1; 6:1; 4:1; 1:1, mỗi hệ dung sử dụng 250ml) để thu được bốn phân đoạn nhỏ (ký hiệu từ F3.1 đến F3.4) Phân đoạn F3.2 (0,5 g) tiếp tục được sắc ký cột pha đảo RP -18 (100 gam, 60 x 3 cm) giải hấp bằng hệ dung môi CH3OH:H2O thu được hợp chất DCM2 (31 mg)
Phân đoạn F4 (4,7 g) được phân lập bằng sắc ký cột silica gel (200 gam, 60
x 5cm) được rửa giải với hệ dung môi CHCl3:CH3OH (20:1; 10:1; 6:1; 4:1; 2:1, mỗi hệ sử dụng 200 ml) thu được 5 phân đoạn (ký hiệu từ F4.1 đến F4.5) Phân đoạn F4.1 tiếp tục được sắc ký cột silica gel (200 gam, 60 x 3 cm) rửa giải bằng
hệ dung môi CHCl3:CH3OH (19:1; 16:1, mỗi hệ dung môi sử dụng 200 ml) thu được hợp chất DCM4 (10 mg) và hợp chất DCM8 (21 mg)
Phân đoạn F5 (1,5 g) được phân lập bằng sắc ký cột silica gel (200 gam, 60
x 3cm) được rửa giải bằng hệ dung môi CHCl3:CH3OH (9:1; 6:1, mỗi hệ dung môi sử dụng 200 ml) thu được hợp chất DCM9 (43 mg)
Trang 10Phân đoạn F6 (1,2 g) được tiến hành sắc ký cột silica gel (200 gam, 60x3 cm)
rửa giải bằng hệ dung môi CHCl3:CH3OH (9:1; 6:1, mỗi hệ sử dụng 200 ml) thu
được hợp chất DCM6 (13 mg)
Sơ đồ 2.1 Phân lập các hợp chất từ quả thể nấm linh chi (D concentrica)
2.5.2 Các dữ liệu vật lý
2.5.2.1 Hợp chất DCM1
Tinh thể không màu (CHCl3), đ.n.c.216-217 °C; HR-ESI-MS m/z 546.2834
[M+Na]+ (C31H41O6NNa, cal m/z 546.2832); 1H-NMR (700MHz, Pyridine-d5)
Trang 11(ppm)
2.5.2.6 Hợp chất DCM6
Chất bột màu nâu nhạt, đ.n.c 310-3110C ;
1H-NMR (DMSO-d6, 500 MHz) ( ppm): 10,98 (1H, br s), 10,81 (1H, br s), 7,37 (1H, d, J = 7,5 Hz, H-6), 5,44 (1H, d, J = 7,5 Hz, H-5)
2.5.2.7 Hợp chất DCM7
Chất bột không màu, đ.n.c 166-1680C;
1H-NMR (DMSO-d6, 500 MHz) ( ppm): 4,40 (2H, d, J = 5,0 Hz, 2,5-OH), 4,31 (2H, t, J = 5,5 Hz, 1,6-OH), 4,12 (2H, d, J = 7,0 Hz, 3,5-OH), 3,61 (2H, m, H-1b, -6b), 3,53 (1H, t, J = 7,5 Hz, H-3,-4), 3,45 (1H, m, H-2,-5), 3,37 (2H, dd, J
= 6,0, 11,5 Hz, H-1a, -6a);
2.5.2.8 Hợp chất Ergosterol DCM8
Chất bột màu trắng; đ.n.c: 165-1670C; Phổ UV (MeOH) max nm: 211, 285;
IR (KBr) max (cm-1): 3433, 2959, 1726, 1090; EI-MS m/z 396 [M]+; Phổ 1H-NMR (500MHz, CDCl3) ( ppm); Phổ 13C-NMR (125MHz, CDCl3) ( ppm): bảng 3.17
2.5.2.9 Hợp chất Ergosterol peroxide DCM9
Bột màu trắng (CHCl3); đ.n.c: 172-174°C; [α]D25 -14.4 (c = 0.08, CHCl3); EI-MS (rel int.): m/z396 ([M]+, 100); IR (KBr) νmax: 3417, 2954, 1458 cm-1; 1H-NMR (400 MHz, CDCl3) (δ ppm); bảng 3.18
2.6 Nghiên cứu các hợp chất từ nấm cổ linh chi (Ganoderma applanatum) 2.6.1 Chiết xuất và phân lập các hợp chất
Quả thể nấm linh chi (G applanatum) (3,0 kg) được phơi khô, nghiền nhỏ, ngâm chiết 3 lần bằng dung môi methanol (10Lx3) ở nhiệt độ phòng, sau đó lọc
và dịch lọc được cất giảm áp suất bằng thiết bị quay cất chân không thu được cao methanol (128,0g) Sau đó cao thô được hòa tan trong nước và chiết phân bố với dung môi, chưng cất chân không thu được: ethyl acetate (32g), butanol (33g) và dịch chiết nước (55g)
Cao chiết ethyl acetate được tiến hành trên sắc ký cột silica gel rửa giải gradient với hệ dung môi hexane và acetone tăng dần độ phân cực (từ 100:0 đến 2:1) thu được các phân đoạn nhỏ, sử dụng TLC gộp được 10 phân đoạn (Frs G1-G10) Tinh chế phân đoạn G1 (1.2g) bằng sắc ký cột silica gel rửa giải với hexane
và acetone (15:1) thu được hợp chất 1 (123 mg) Phân đoạn G3 (2.6g) cũng được tiến hành trên silica gel với hệ dung môi hexane và ethyl acetate (15:1) thu được chất 4 (38 mg) Phân đoạn G4 (2,5g) đã được sắc ký cột silica gel rửa giải với hỗn hợp hexane và acetone (9: 1) thu được hợp chất 2 (10 mg) và 3 (31 mg) G6 (2,9g) đã được sắc ký cột silica gel giải hấp với cloroform và hỗn hợp dung môi methanol (10: 1) và tiếp tục kết tinh lại để thu được hợp chất 5 (30 mg)
Trang 12Sơ đồ 2.2 Phân lập các hợp chất từ quả thể nấm linh chi (G applanatum)
2.6.2 Các dữ kiện vật lý và phổ
2.6.2.1 Ergosterol (GAM1)
Hợp chất GAM1 có cấu trúc giống với hợp chất DCM8 số liệu phổ và biện
luận cấu trúc như trình bày ở mục 2.5.2.8 đã chứng minh được đây là ergosterol
2.6.2.2 Ergosterol peroxide (GAM2)
Hợp chất GAM2 có cấu trúc giống với hợp chất DCM9 số liệu phổ và biện
luận cấu trúc như trình bày ở mục 2.5.2.9 đã chứng minh được đây là ergosterol
peroxide
2.6.2.3 Ergosta-7,22-dien-3β-ol (GAM3)
Tinh thể không màu; (CHCl3); [α]D20 -5 (c = 0.85, CHCl3); đ.n.c.185.5-187°C
; EI-MS (rel int.): m/z398([M]+, 4), 217(8), 255(9), 107(15), 69(24), 43(100); IR
Thử hoạt tính sinh học gây độc tế bào với SW480: Ung thư đại tràng ở người
(human colon adenocarcinoma), SK-LU-1: ung thư phổi ở người (human lung
carcinoma); Hep3B: ung thư tế bào gan ở người (human hepatocellular
Trang 13carcinoma); HepG2: Ung thư tế bào gan ở người (human hepatocellular carcinoma); MCF7: Ung thư vú ở người (human breast carcinoma)
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Kết quả xác định hàm lượng các chất dinh dưỡng của một số loài nấm 3.1.1 Thành phần khoáng và các nguyên tố vi lượng
3.1.1.1 Xây dựng đường chuẩn
Để định lượng các thành phần khoáng và các nguyên tố vi lượng, chúng tôi
đã sử dụng phương pháp ICP – MS để đo Ge, phương pháp AAS-HG để đo Se, phương pháp quang phổ hấp thụ nguyên tử dùng kỹ thuật nguyên tử hóa bằng ngọn lửa (F-AAS) để đo Na, K, Ca, Mg, Fe, Cu, Zn Các thông số của máy ICP –
MS, AAS thể hiện trong bảng 2.2 và 2.3
Các phương trình đường chuẩn thể hiện mối quan hệ tuyến tính giữa tín hiệu
đo với nồng độ các ion kim loại đã được xây dựng Kết quả thể hiện trong bảng 3.1
Bảng 3.1 Phương trình đường chuẩn
Chất chuẩn Phương trình hồi quy R 2
3.1.1.2 Kết quả xác định hàm lượng Ge, Na, K, Ca, Mg trong các mẫu nấm lớn
Sử dụng quy trình chuẩn bị mẫu như mục 2.3.1.1, các điều kiện ghi đo thể hiện trong bảng 2.2, bảng 2.3 và đường chuẩn xây dựng được trong mục 3.1.1.1, chúng tôi tiến hành định lượng các nguyên tố nghiên cứu trong 08 mẫu nấm lớn Kết quả phân tích và tính toán được thể hiện trong bảng 3.2, bảng 3.3
Bảng 3.2 Kết quả xác định hàm lượng Ge, Na, K, Ca, Mg trong 08 mẫu nấm
ST
T
Mẫu nấm (kí hiệu)
Hàm lượng Ge (µg/g) ICP-MS
Hàm lượng Na, K, Ca, Mg (µg/g) theo