Khảo sát quy trình thu nhận các hợp chất có hoạt tính sinh học từ việc nuôi cấy tế bào hai loài drosera

LỜI CAM ĐOAN LỜI CAM ĐOAN Tơi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu riêng tơi Những kết nghiên cứu hồn tồn chưa cơng bố tác giả khác NCS Qch Ngơ Diễm Phương Luận án Tiến sĩ Sinh học Trang i LỜI CẢM ƠN Lời cảm ơn Công trình kết năm học tập nghiên cứu Bộ môn Công nghệ Sinh học Thực vật Chuyển hoá Sinh học thuộc Khoa Sinh, trường Đại học Khoa học Tự nhiên với nhiều dạy bảo, quan tâm giúp đỡ Đầu tiên, xin bày tỏ lòng kính trọng biết ơn sâu sắc đến PGS TS Bùi Văn Lệ, người đề hướng nghiên cứu thu nhận hợp chất thứ cấp đối tượng bắt ruồi Việt Nam công nghệ nuôi cấy tế bào thực vật tận tình dạy tạo điều kiện thuận lợi để thực hiện, hoàn thành luận án Đồng thời, xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành đến GS TS Nguyễn Kim Phi Phụng – Khoa Hóa, trường ĐH Khoa học Tự nhiên Cô người đặt móng cho khối kiến thức Hóa học mà có để ứng dụng luận án Mặc dù không người hướng dẫn, Cô bên cạnh, đốc thúc, hỗ trợ tinh thần cho lúc thực luận án Thời gian làm thực tập sinh nước giúp trưởng thành chuyên môn, tác phong học tập nghiên cứu Xin chân thành cám ơn Bộ Giáo dục Đào tạo Chương trình trao đổi hợp tác Danida (ENREKA) Bên cạnh đó, cho phép đặc biệt bày tỏ lòng biết ơn chân thành đến PGS TS Ole Luận án Tiến sĩ Sinh học Trang ii LỜI CẢM ƠN Vang, người hướng dẫn, dạy bảo tôi, tạo điều kiện cho học tập nghiên cứu suốt quãng thời gian Đan Mạch Cho nói lời cám ơn đến tất Thầy Cô, bạn bè Lab Molecular Mechanisms of Dietary Components; Khoa Science, Systems and Models; Trường ĐH Roskilde, Đan Mạch hướng dẫn thao tác vàoLab tạo nên tình cảm ấm áp, thân thiện Tôi xin gửi lời cám ơn đến bạn du học sinh Việt Nam Roskilde; đặc biệt chị Thảo Trân, Tuyết Phương, Thu An, Như Ngọc, Thành Tâm chia sống giúp đỡ gia đình nơi xa xứ Cho gửi lời cám ơn đến Thầy Cơ GS Trần Thanh Vân học bổng Odon Vallet Cám ơn Thầy Cơ Bộ mơn Sinh hóa quan tâm tìm hiểu xét duyệt ý tưởng luận án hình thành Trân trọng cám ơn Thầy Cơ tham gia Hội đồng, Thầy Cơ tham gia phản biện kín dành thời gian xem xét, đánh góp ý để luận án chỉnh chu, hoàn thiện Cám ơn toàn thể Thầy Cơ đồng nghiệp Khoa Sinh, Trường ĐH Khoa học Tự nhiên, TP HCM dạy dỗ từ ngày chập chững bước vào giảng đường đại học ngày hôm cổ vũ tinh thần hỗ trợ cần thiết để hoàn thành luận án Đặc biệt xin cám ơn Cơ Phượng, anh Huy, KPNam góp ý sữa chữa giúp Luận án Tiến sĩ Sinh học Trang iii LỜI CẢM ƠN Cám ơn toàn thể em học tập làm việc phòng Công nghệ Sinh học Thực vật B23 Cho đặc biệt cám ơn: Lan Anh, Cẩm Tú, Vòng BínhLong, Lưu Ly, Xuân Sơn, Hữu Hoàng, Minh Tuấn, Thanh Minh, Hiền hỗ trợ lúc cần Gửi lời cám ơn đến: Bích Chiêu, Bích Tuyền, Hoàng Thò Thu, Phương Thy, Thanh Minh, Bích Thùy, Phi Yến, “người bạn học trò” Cô dốc hết tâm huyết để Cô nghiên cứu luận án Gửi lời cám ơn đến bạn khóa Cao học Sinh hóa K13 thường xuyên quan tâm động viên phút Đặc biệt, cho nói lời cám ơn đến Thiên Hoàng, chò Như, anh Nhứt Cuối cùng, xin phép dâng tặng thành công trình cho gia đình tôi, chỗ dựa vững năm qua Cám ơn Ba Mẹ tạo điều kiện tốt vật chất tinh thần để học tập, nghiên cứu khoa học đạt kết Cám ơn anh chò hai vợ chồng út bên cạnh, giúp đỡ, cổ vũ Gia đình thực giúp toàn tâm toàn ý với luận án Chân thành cám ơn Quách Ngô Diễm Phương Luận án Tiến sĩ Sinh học Trang iv DANH MỤC MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN i Lời cảm ơn ii MỤC LỤC v DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT VÀ KÝ HIỆU x DANH MỤC BẢNG xiii DANH MỤC HÌNH xvi MỞ ĐẦU 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Đặc điểm giống thực vật Drosera 1.1.1 Đặc điểm phân loại 1.1.2 Đặc điểm phân bố 1.1.3 Đặc điểm hình thái 1.1.4 Đặc tính sinh học 11 1.1.5 Hiện trạng Drosera giới [112] 13 1.1.6 Thành phần hóa học .14 1.1.7 Giá trị tầm quan trọng .17 1.1.8 Tình hình nghiên cứu .20 1.2 Tăng suất thu nhận hợp chất ni cấy tế bào thực vật 22 1.2.1 Ni cấy tế bào thực vật (plant cell cultures) 22 1.2.2 Tối ưu khả tích lũy hợp chất tế bào thực vật 24 Luận án Tiến sĩ Sinh học Trang v DANH MỤC 1.2.3 Can thiệp vào đường sinh tổng hợp hoạt chất 29 VẬT LIỆU PHƯƠNG PHÁP 35 2.1 Ni cấy in vitro hai lồi Drosera để tạo nguồn ngun liệu khởi đầu 35 2.1.1 Vật liệu 35 2.1.2 Phương pháp 35 2.2 Sàng lọc thu nhận số hợp chất có hoạt tính sinh học từ nguồn ngun liệu in vitro Drosera 38 2.2.1 Các phương pháp khảo sát hoạt tính sinh học sử dụng để sàng lọc phân đoạn cao chứa hoạt chất 38 2.2.2 Các bước tiến hành sàng lọc để lập hoạt chất từ nguồn ngun liệu in vitro hai lồi Drosera .41 2.2.3 Kiểm tra hoạt tính sinh học hợp chất lập 42 2.2.4 Xác định cấu trúc hàm lượng hợp chất 49 2.2.5 Lựa chọn hợp chất có tiềm làm hợp chất đích cho mục tiêu nghiên cứu tăng suất thu nhận đối tượng 51 2.3 Khảo sát việc ứng dụng số kỹ thuật làm tăng suất thu nhận hoạt chất lên hệ thống ni cấy tái sinh 51 Vật liệu 51 Phương pháp 52 2.3.1 Khảo sát vòng đời in vitro để xác định giai đoạn tăng trưởng Drosera 52 2.3.2 Khảo sát điều kiện ni cấy thích hợp cho tăng trưởng tích lũy hoạt chất .52 2.3.3 Khảo sát tác động NAA lên tăng trưởng tích lũy hoạt chất 53 Luận án Tiến sĩ Sinh học Trang vi DANH MỤC 2.3.4 Khảo sát tác động việc bổ sung tiền chất lên tăng trưởng tích lũy hoạt chất .54 2.3.5 Khảo sát tác động việc sử dụng chất cảm ứng (elicitor) lên tăng trưởng tích lũy hoạt chất .54 2.3.6 Khảo sát tác động cảm ứng việc gây stress nitrogen lên tăng trưởng tích lũy hoạt chất 55 2.3.7 Kiểm chứng hiệu làm tăng suất thu nhận hoạt chất lên hệ thống ni cấy tái sinh kỹ thuật khảo sát 55 2.4 Khảo sát ứng dụng số kỹ thuật làm tăng suất thu nhận hoạt chất lên hệ thống ni cấy dịch huyền phù tế bào 56 Vật liệu 56 Phương pháp 56 2.4.1 Tạo dịch huyền phù tế bào .56 2.4.2 Ứng dụng số kỹ thuật tăng suất thu nhận hoạt chất lên hệ thống ni cấy dịch huyền phù tế bào 59 2.5 Xử lý thống kê 62 KẾT QUẢ -THẢO LUẬN 63 3.1 Ni cấy in vitro hai lồi Drosera để tạo nguồn ngun liệu khởi đầu 63 3.1.1 Khử trùng ngun liệu ni cấy .63 3.1.2 Nhân giống chồi bên 63 3.1.3 Nhân giống tạo chồi bất định từ lớp mỏng tế bào 66 3.1.4 Thử nghiệm quy trình ni cấy hai bước (Improved 2-step Liquid Culture System) việc cải thiện khả nhân chồi phát triển thành hồn chỉnh [24] 69 3.1.5 Tạo rễ phát triển hồn chỉnh 72 Luận án Tiến sĩ Sinh học Trang vii DANH MỤC 3.2 Sàng lọc thu nhận số hợp chất có hoạt tính sinh học từ nguồn ngun liệu in vitro Drosera 72 3.2.1 Xử lý mẫu điều chế loại cao chiết .72 3.2.2 Sàng lọc lập hợp chất có hoạt tính kháng oxy hóa .74 3.2.3 Sàng lọc lập hợp chất có khả ức chế tăng sinh tế bào in vitro .84 3.2.4 Lựa chọn hợp chất có tiềm làm hợp chất đích cho mục tiêu nghiên cứu tăng suất thu nhận đối tượng 100 3.3 Khảo sát việc ứng dụng số kỹ thuật làm tăng suất thu nhận hoạt chất lên hệ thống ni cấy tái sinh 101 3.3.1 Khảo sát vòng đời in vitro để xác định giai đoạn tăng trưởng D burmanii .102 3.3.2 Khảo sát điều kiện ni cấy thích hợp cho tăng trưởng tích lũy plumbagin tái sinh 104 3.3.3 Khảo sát tác động NAA lên tăng trưởng tích lũy hoạt chất 109 3.3.4 Khảo sát tác động việc bổ sung tiền chất (phenylalanine tyrosine) lên tăng trưởng tích lũy plumbagin 111 3.3.5 Khảo sát tác động việc sử dụng chất cảm ứng (elicitor) lên tăng trưởng tích lũy hoạt chất 113 3.3.6 Khảo sát tác động cảm ứng việc gây stress nitrogen lên tăng trưởng tích lũy hoạt chất 120 3.3.7 Kiểm chứng hiệu làm tăng suất thu nhận hoạt chất lên hệ thống ni cấy tái sinh kỹ thuật khảo sát 122 3.4 Khảo sát việc ứng dụng số kỹ thuật làm tăng suất thu nhận hoạt chất lên hệ thống ni cấy dịch huyền phù tế bào 123 3.4.1 Tạo dịch huyền phù tế bào 123 Luận án Tiến sĩ Sinh học Trang viii DANH MỤC 3.4.2 Ứng dụng số kỹ thuật tăng suất thu nhận hoạt chất lên hệ thống ni cấy dịch huyền phù tế bào 134 KẾT LUẬN – ĐỀ NGHỊ 14 4.1 Kết luận 14 4.2 Đề nghị 1 DANH MỤC CƠNG TRÌNH LIÊN QUAN 15 TÀI LIỆU THAM KHẢO 15 PHỤ LỤC a Luận án Tiến sĩ Sinh học Trang ix DANH MỤC DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT VÀ KÝ HIỆU CHỮ VIẾT TẮT 2,4-D : 2,4-dichlorophenoxy acetic acid 4E-BP1 : the Eukaryotic initiation factor 4E (eIF4E) Binding Protein ABS : Absorbent AFM : Atomic Force Microscopy AI : hoạt tính kháng oxy hóa hợp chất (%) AOS : Active oxide species BA : 6-benzylaminopurine BHA : butylate hydroxy aldehyde BSA : Bovine Serum Albumine COSY : COrelation SpectroscopY DEPT : Distortionless Enhancement by Polarization Transfer DLD-1 : dòng tế bào ung thư ruột kết người DMSO : Dimethyl sulphoxide DTT : 1, 4-DiThioTreitol DW : Dry weight (trọng lượng khơ) FBS : Fetal Bovine Serum FTC : Ferric thyociante FW : Fresh weight (trọng lượng tươi) GB5 : Gamborg B5 HMBC : Heteronuclear Multiple Quantum Correlation HMQC : Heteronuclear Multiple Bond Correlation HPLC : High Performane Liquid Chromatography (Sắc ký lỏng cao áp) I : tỷ lệ ức chế tăng sinh tế bào (%) IAA : indoleacetic acid IBA : 3-indolebutyric acid IC50 : Inhibitory Concentration of 50% growth Luận án Tiến sĩ Sinh học Trang x PHỤ LỤC Phụ lục 2.10 Kết định lượng plumbagin mơ mơ rễ D burmanii HPLC Phụ lục 2.10.1 Kết định lượng plumbagin mơ mơ rễ D burmanii HPLC Luận án Tiến sĩ Sinh học Trang kk PHỤ LỤC Phụ lục 2.10 Kết định lượng plumbagin mơ mơ rễ D burmanii HPLC Phụ lục 2.10.2 Sắc ký đồ plumbagin chuẩn Luận án Tiến sĩ Sinh học Trang ll PHỤ LỤC Phụ lục 2.10 Kết định lượng plumbagin mơ mơ rễ D burmanii HPLC Phụ lục 2.10.3 Sắc ký đồ plumbagin diện mơ D burmanii in vitro Luận án Tiến sĩ Sinh học Trang mm PHỤ LỤC Phụ lục 2.10 Kết định lượng plumbagin mơ mơ rễ D burmanii HPLC Phụ lục 2.10.4 Sắc ký đồ plumbagin diện mơ rễ D burmanii in vitro Luận án Tiến sĩ Sinh học Trang nn PHỤ LỤC Phụ lục 2.11 Kết định lượng plumbagin dịch huyền phù tế bào D burmanii HPLC Phụ lục 2.11.1 Kết định lượng plumbagin dịch huyền phù tế bào D burmanii ứng dụng kỹ thuật làm tăng suất thu nhận hoạt chất Luận án Tiến sĩ Sinh học Trang oo PHỤ LỤC Phụ lục 2.11 Kết định lượng plumbagin dịch huyền phù tế bào D burmanii HPLC Phụ lục 2.11.2 Sắc ký đồ plumbagin chuẩn Luận án Tiến sĩ Sinh học Trang pp PHỤ LỤC Phụ lục 2.11 Kết định lượng plumbagin dịch huyền phù tế bào D burmanii HPLC Phụ lục 2.11.3 Sắc ký đồ plumbagin diện dịch ngoại bào huyền phù D burmanii ni điều kiện thích hợp (NT1) Luận án Tiến sĩ Sinh học Trang qq PHỤ LỤC Phụ lục 2.11 Kết định lượng plumbagin dịch huyền phù tế bào D burmanii HPLC Phụ lục 2.11.4 Sắc ký đồ plumbagin diện sinh khối tế bào D burmanii ni cấy điều kiện thích hợp (NT1) Luận án Tiến sĩ Sinh học Trang rr PHỤ LỤC Phụ lục 2.11 Kết định lượng plumbagin dịch huyền phù tế bào D burmanii HPLC Phụ lục 2.11.5 Sắc ký đồ plumbagin diện dịch ngoại bào huyền phù D burmanii ni cấy điều kiện thích hợp loại bỏ 2,4-D (NT2) Luận án Tiến sĩ Sinh học Trang ss PHỤ LỤC Phụ lục 2.11 Kết định lượng plumbagin dịch huyền phù tế bào D burmanii HPLC Phụ lục 2.11.6 Sắc ký đồ plumbagin diện sinh khối tế bào D burmanii ni cấy điều kiện thích hợp loại bỏ 2,4-D (NT2) Luận án Tiến sĩ Sinh học Trang tt PHỤ LỤC Phụ lục 2.11 Kết định lượng plumbagin dịch huyền phù tế bào D burmanii HPLC Phụ lục 2.11.7 Sắc ký đồ plumbagin diện dịch ngoại bào huyền phù D burmanii ni cấy điều kiện thích hợp bổ sung phenyalanine 0,3M (NT3) Luận án Tiến sĩ Sinh học Trang uu PHỤ LỤC Phụ lục 2.11 Kết định lượng plumbagin dịch huyền phù tế bào D burmanii HPLC Phụ lục 2.11.8 Sắc ký đồ plumbagin diện sinh khối tế bào D burmanii ni cấy điều kiện thích hợp bổ sung phenyalanine 0,3M (NT3) Luận án Tiến sĩ Sinh học Trang vv PHỤ LỤC Phụ lục 2.11 Kết định lượng plumbagin dịch huyền phù tế bào D burmanii HPLC Phụ lục 2.11.9 Sắc ký đồ plumbagin diện dịch ngoại bào huyền phù D burmanii ni cấy điều kiện thích hợp vàcảm ứng acid salicylic 1,5mg/l ngày (NT4) Luận án Tiến sĩ Sinh học Trang ww PHỤ LỤC Phụ lục 2.11 Kết định lượng plumbagin dịch huyền phù tế bào D burmanii HPLC Phụ lục 2.11.10 Sắc ký đồ plumbagin diện sinh khối tế bào D burmanii ni cấy điều kiện thích hợp vàcảm ứng acid salicylic 1,5mg/l ngày (NT4) Luận án Tiến sĩ Sinh học Trang xx PHỤ LỤC Phụ lục 2.12: Kết xử lý số liệu SPSS thí nghiệm (Xem CD đính kèm) Luận án Tiến sĩ Sinh học Trang yy [...]... cấp hoạt chất có giá trị trị liệu cho ngành dược, luận án: KHẢO SÁT QUY TRÌNH THU NHẬN CÁC HỢP CHẤT CÓ HOẠT TÍNH SINH HỌC TỪ VIỆC NUÔI CẤY TẾ BÀO HAI LOÀI DROSERA Đã được hình thành với 3 nội dung chính: ¾ Thiết lập quy trình vi nhân giống 2 loài Drosera thu hái ở Việt Nam ¾ Sàng lọc, thu nhận và xác định một số hợp chất có hoạt tính sinh học từ nguồn nguyên liệu nuôi cấy in vitro của hai loài Drosera. .. hai loài Drosera ¾ Khảo sát việc ứng dụng một số kỹ thu t làm tăng năng suất thu nhận hoạt chất có tiềm năng trên hệ thống nuôi cấy tế bào in vitro Drosera: Lựa chọn điều kiện nuôi cấy thích hợp Bổ sung tiền chất Sử dụng những nhân tố cảm ứng con đường sinh tổng hợp (elicitor, stress) Luận án Tiến sĩ Sinh học Trang 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Đặc điểm giống thực vật Drosera 1.1.1 Đặc... burmanii 19 Bảng 1.6 Những nghiên cứu về nhân giống in vitro giống Drosera .20 Bảng 1.7 Những nghiên cứu ứng dụng công nghệ nuôi cấy tế bào thực vật trong thu nhận hoạt chất từ các loài thực vật cùng họ với Drosera .21 Bảng 2.1 Thử nghiệm quy trình nuôi cấy 2 bước với 2 kiểu nuôi cấy rắn và lỏng 37 Bảng 2.2 Các nghiệm thức được bố trí việc bổ sung hay không bổ sung 2,4-D .61 Bảng 3.1 Ảnh hưởng của... 700nm của các phân đoạn theo phương pháp Yen và Duh (1993) 77 Bảng 3.9 Hoạt tính kháng oxy hóa của hợp chất theo phương pháp FTC 80 Bảng 3.10 Hoạt tính kháng oxy hóa của hợp chất theo phương pháp TBA 81 Bảng 3.11 Tỷ lệ % hoạt tính kháng oxy hóa AI (%) của các hoạt chất khảo sát 82 Bảng 3.12 Tỷ lệ (%) ức chế sự tăng sinh dòng tế bào ung thư ruột kết DLD-1 sau khi cảm ứng 48 giờ của các cao chiết... Luận án Tiến sĩ Sinh học Trang xii DANH MỤC DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1 Các loài Drosera thiên nhiên chứa plumbagin và 7-methyljuglone .15 Bảng 1.2 Các loài Drosera in vitro chứa plumbagin và 7-methyljuglone .15 Bảng 1.3 Các naphthoquinone vi lượng được tách chiết từ Drosera .15 Bảng 1.4 Dược tính và các hoạt tính ứng dụng khác của dịch chiết Drosera 18 Bảng 1.5 Hoạt tính chống thụ thai công bố gần đây... tác động kết hợp của 3 loại hormone 129 Hình 3.50 Dịch huyền phù tế bào được tạo thành từ mô sẹo 131 Hình 3.51 Dịch huyền phù tế bào được tạo thành trực tiếp từ lớp mỏng tế bào 132 Hình 3.52 Tế bào D burmanii bắt màu hồng khi nhuộm TTC .133 Hình 3.53 Đường cong tăng trưởng của các dịch huyền phù tế bào D burmanii có mật độ tế bào ban đầu khác nhau 135 Luận án Tiến sĩ Sinh học Trang xix... cả hai phương pháp FTC và TBA 82 Hình 3.17 Biều đồ thể hiện tỷ lệ % ức chế tăng sinh tế bào DLD-1 của các loại cao chiết 85 Hình 3.18 Biểu đồ biểu diễn tỷ lệ (%) ức chế tăng sinh dòng tế bào DLD-1sau khi cảm ứng 48 giờ của các phân đoạn .86 Hình 3.19 Cô lập và thu nhận hoạt chất B 88 Hình 3.20 Đường cong tăng sinh tế bào DLD-1 theo thời gian dưới ảnh hưởng của hợp chất. .. dược phẩm tổng hợp thường gây ra không ít những tác dụng phụ như giảm khả năng trị liệu, gây độc tố…Do đó, việc nghiên cứu cây cỏ thiên nhiên nhằm tìm ra các hợp chất có giá trị trị liệu để cung cấp thêm nguồn khai thác dược liệu là việc làm hết sức cần thiết Hơn nữa, nghiên cứu áp dụng các kỹ thu t công nghệ sinh học dựa trên các phương pháp nuôi cấy tế bào in vitro nhằm đảm bảo được một cách chủ động... hợp chất B ở các nồng độ khác nhau .89 Hình 3.21 Biểu đồ thể hiện tỷ lệ ức chế tăng sinh tế bào của hợp chất ở các nồng độ khác nhau (trái: sau 24 giờ cảm ứng, phải: sau 48 giờ cảm ứng) 89 Luận án Tiến sĩ Sinh học Trang xvii DANH MỤC Hình 3.22 Biểu đồ thể hiện ảnh hưởng của hoạt chất lên kích thước của tế bào DLD-1 92 Hình 3.23 Tế bào DLD-1 dưới ảnh hưởng của hợp chất B sau 48... thiết các hợp chất có giá trị trị liệu là điều mà các nhà khoa học luôn đề cao hàng đầu và đang tích cực hướng đến Drosera, một loài thực vật bắt mồi mang nhiều đặc điểm khác lạ so với các loài thực vật khác: có khả năng cảm ứng; có khả năng tiết ra nhiều loại hợp chất thơm, ngọt ngào để thu hút côn trùng; có nhiều loại enzyme thủy phân để tiêu hóa côn trùng làm nguồn dinh dưỡng…Đặc biệt, chúng có một