3.3 Khảo sát việc ứng dụng một số kỹ thuật làm tăng năng suất thu nhận hoạt chất lên hệ thống nuôi cấy cây con tái sinh
3.3.2 Khảo sát điều kiện nuôi cấy thích hợp cho sự tăng trưởng và sự tích lũy
plumbagin trong cây con tái sinh
3.3.2.1 Khảo sát ảnh hưởng của hàm lượng khoáng đa lượng
Kết quả sau 8 tuần nuôi cấy được trình bày trong bảng 3.23 và hình 3.29, 3.30.
Kết quả cho thấy trong khoảng thời gian nuôi cấy từ chồi con đến khi cây bước vào giai đoạn trưởng thành, rõ ràng khoáng đa lượng giữ vai trò vô cùng thiết yếu cho cây tăng trưởng và tích lũy hợp chất. Ở nghiệm thức MS không bổ sung khoáng đa lượng, hay MS 1/8, cây không có dấu hiệu tăng sinh và chết; ở nghiệm thức MS1/4 cây vẫn sống tuy nhiên phát triển kém và có lẽ đang phải bước sang giai đoạn tự đề
Hình 3.29. Biểu đồ thể hiện ảnh hưởng khoáng đa lượng lên sự tăng trưởng và sự
tích lũy plumbagin của cây
0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6
0 1 2 3 4
MS MS 1/2 MS
1/4 MS 1/8 MS 0
Hàm lượng Plumbagin (mg/g) khối lượng sinh khối tươi (g)
sinh khối tươi (g) Hàm lượng Plum (mg/g)
Bảng 3.23. Ảnh hưởng của hàm lượng khoáng đa lượng lên sự tăng trưởng và sự tích lũy
plumbagin của cây
Hàm lượng khoáng đa
lượng
Trọng lượng tươi 1 bình nuôi
cấy (g±SD)
Hàm lượng plumbagin (mg/g cây tươi±SD) MS (ĐC) 3,461 ± 0,386c 0,470 ± 0,011d
MS 1/2 3,375 ± 0,308c 0,469 ± 0,018d MS 1/4 1,069 ± 0,124b* 0,255 ± 0,019c* MS 1/8 0,246 ± 0,052a* 0,028 ± 0,009b* MS 0 0,258 ± 0,052a* 0,017 ± 0,007a* Các số trung bình trong cột với các mẫu tự khác nhau thì khác biệt nhau, * chỉ sự khác biệt giữa các nghiệm thức với đối chứng, sự khác biệt có ý nghĩa ở mức p=0,05
Số liệu được trích từ file phụ lục “Khoang đa lượng.exe”
Hình 3.30. Ảnh hưởng hàm lượng khoáng đa lượng lên sự tăng trưởng và sự tích lũy plumbagin của cây. Trong đó, ở MS1/8 và MS0 các chồi con không có dấu hiệu tăng
sinh và chết
Luận án Tiến sĩ Sinh học Trang 105 kháng bản thân chống lại sự thiếu hụt dinh dưỡng của môi trường nên toàn bộ cây
hóa đỏ do sắc tố đỏ được sản sinh hơn mức bình thường. Tuy nhiên, khi môi trường giảm 1/2 hàm lượng khoáng đa lượng, cây vẫn giữ nguyên tình trạng tăng trưởng như ở môi trường MS, thậm chí có khả năng nhân chồi bên nhiều hơn so với MS.
Kết quả này phù hợp với kết quả của Kim Kwang-Soo và cộng sự (2003) [61] khi nghiên cứu sự phát triển của cây con D. peltata. Kết quả phần nào giải thích được khả năng sống trong môi trường nghèo dinh dưỡng của các loài Drosera nhờ vào khả năng chuyển hóa nitrogen hữu cơ có từ côn trùng khi cây sống ngoài tự nhiên.
Trong điều kiện nuôi cấy in vitro, nitrogen hữu cơ được bổ sung dưới dạng casein hydrosylate (100mg/l), có lẽ nhờ đó, cây ở nghiệm thức MS 1/2 vẫn có thể tăng sinh và tích lũy hoạt chất như nghiệm thức MS.
Do đó, với D. burmanii, môi trường MS1/2 vừa giúp cây tăng trưởng và tích lũy hàm lượng hoạt chất không kém MS, vừa giảm giá thành kinh tế hơn so với MS.
3.3.2.2 Khảo sát ảnh hưởng của ánh sáng
Kết quả sau 8 tuần nuôi cấy được trình bày trong bảng 3.24 và hình 3.31, 3.32
Hình 3.31. Biểu đồ thể hiện ảnh hưởng của ánh sáng lên sự tăng trưởng và sự
tích lũy plumbagin của cây
0,4 0,41 0,42 0,43 0,44 0,45 0,46 0,47
0 1 2 3 4 5
ánh sáng
mạnh ánh sáng
yếu tối Hàm lượng Plumbagin (mg/g)
khối lượng sinh khối tươi (g)
Trọng lượng tươi (g) Hàm lượng Plum (mg/g)
Bảng 3.24. Ảnh hưởng của ánh sáng lên sự tăng trưởng và sự tích lũy plumbagin trong cây con
Điều kiện chiếu sáng (16giờ/ngày)
Khối lượng cây tươi của 1 bình nuôi cấy (g±SD)
Hàm lượng plumbagin (mg/g cây tươi±SD)
∼2800lux (ĐC) 3,773 ± 0,105c 0,422 ± 0,013a
∼800lux 2,518 ± 0,253b* 0,432 ± 0,012a ủ tối
hoàn toàn 1,992 ± 0,082a* 0,459 ± 0,001b* Các số trung bình trong cột với các mẫu tự khác nhau thì khác biệt nhau, * chỉ sự khác biệt giữa các nghiệm thức với đối chứng, sự khác biệt có ý nghĩa ở mức p=0,05
Số liệu được trích từ file phụ lục “anh sang.exe”
Luận án Tiến sĩ Sinh học Trang 106 Kết quả cho thấy có sự khác biệt cả về sự tăng trưởng lẫn sự tích lũy plumbagin
trong D. burmanii khi cây được nuôi trong các điều kiện ánh sáng khác nhau. Khi được nuôi trong điều kiện có chiếu sáng 16 giờ/ ngày: cây tăng trưởng mạnh, trọng lượng tươi nhiều hơn và phiến lá nở rộng hơn so với khi không được chiếu sáng. Rõ ràng, D. burmanii cũng như như đa số các loài thực vật khác chịu ảnh hưởng của ánh sáng theo đúng chương trình phát sinh hình thái sáng/ tối từng được chứng minh ở Arabidopsis thaliana: khi không có ánh sáng, thực vật sẽ phát triển theo hướng không có quang hợp xảy ra (không biệt hóa lục lạp, phiến lá không mở rộng, kéo dài thân và tăng trưởng kém) và ngược lại khi có chiếu sáng đầy đủ, thực vật sẽ biệt hóa lục lạp, tăng tích lũy chlorophyll, phiến lá mở rộng và tăng trưởng nhanh.
Tuy nhiên, sự tích lũy plumbagin lại trái ngược với sự tăng trưởng của cây dưới ảnh hưởng của ánh sáng. Kết quả cho thấy ánh sáng ức chế khả năng tích lũy plumbagin trong cây: khi cây được ủ tối hoàn toàn, hàm lượng plumbagin trong 1g sinh khối cây tăng lên cao hơn so với khi có chiếu sáng. Điều này có thể được lý giải là do plumbagin cũng như những hợp chất có nhóm chức hoạt động khác, chúng thường dễ tham gia phản ứng và không ổn định trong điều kiện nuôi có ánh sáng.
Tóm lại, để sử dụng điều kiện chiếu sáng thích hợp trong nuôi cấy cây con D.
burmanii cho mục tiêu thu nhận plumbagin, có thể cần tác động theo hai giai đoạn Hình 3.32. Ảnh hưởng của ánh sáng đến sự tăng trưởng của D. buramnii in vitro
A1: ánh sáng đầy đủ (2800 ± 200 lux) A2: ánh sáng yếu (800 ± 200 lux)
A3:ủtối hoàn toàn
Luận án Tiến sĩ Sinh học Trang 107 khác nhau: trong giai đoạn tăng trưởng, cây cần được chiếu sáng đầy đủ để có thể
nhân sinh khối tối đa dưới sự hỗ trợ của ánh sáng; nhưng sau đó khi cây bước vào giai đoạn trưởng thành, có thể cần ngắt nguồn cung cấp ánh sáng để hạn chế yếu tố làm chuyển hóa hợp chất plumbagin.
3.3.2.3 Khảo sát ảnh hưởng của pH môi trường
Kết quả sau 10 tuần nuôi cấy được trình bày trong bảng 3.25 và hình 3.33, 3.34
Hình 3.33. Biểu đồ thể hiện ảnh hưởng của pH môi trường lên sự
tăng trưởng và sự tích lũy plumbagin của cây
0,32 0,33 0,34 0,35 0,36 0,37 0,38 0,39 0,4 0,41 0,42
3,74 3,76 3,78 3,8 3,82 3,84 3,86
5,2 5,8 6,4 Hàm lượng Plumbagin (mg/g)
khối lượng sinh khối tươi (g)
Trọng lượng tươi (g) Hàm lượng Plum (mg/g)
Bảng 3.25. Ảnh hưởng của pH môi trường lên sự tăng trưởng và sự tích lũy plumbagin của cây
Gía trị pH
Trọng lượng tươi 1 bình nuôi cấy
(g±SD)
Hàm lượng plumbagin (mg/g cây tươi±SD) 5,2 3,826 ± 0,014b* 0,408 ± 0,005b 5,8 3,779 ± 0,028a 0,403 ± 0,013b 6,4 3,778 ± 0,016a 0,358 ± 0,004a* Các số trung bình trong cột với các mẫu tự khác nhau thì khác biệt nhau, * chỉ sự khác biệt giữa các nghiệm thức với đối chứng, sự khác biệt có ý nghĩa ở mức p=0,05
Số liệu được trích từ file phụ lục “pH.exe”
Hình 3.34. Ảnh hưởng của pH môi trường đến sự tăng trưởng của D. buramnii in vitro.
Từ trái sang phải: pH5,2; pH5,8; pH6,4
Luận án Tiến sĩ Sinh học Trang 108 Kết quả cho thấy pH môi trường nuôi cấy có tác động đến khả năng tăng trưởng và
sực tích lũy plumbagin trong D. burmanii. Trong đó, pH5,2 là thích hợp nhất cho việc cải thiện khả năng tăng trưởng của cây (số lượng lá và đường kính lá nhiều hơn một cách khác biệt) nhưng không có tác động nhiều lên sự tích lũy plumbagin so với pH thông thường của thành phần MS (pH5,8). Bên cạnh đó, pH6,4 không làm thay đổi nhiều về sự tăng trưởng của cây con nhưng lại gây ức chế khả năng tích lũy plumbagin hơn so với pH5,8. Kết quả cho thấy muốn thu nhận plumbagin từ hệ thống nuôi cấy cây con D. burmanii trên môi trường MS, giá trị pH5,2 sẽ thích hợp hơn so với giá trị pH5,8; với giá trị pH5,2; chúng tôi có thể cải thiện được hàm lượng plumbagin tích lũy trong cây lên 1,012 lần so với pH5,8.
3.3.2.4 Khảo sát ảnh hưởng của mật độ cá thể nuôi cấy
Kết quả sau 10 tuần nuôi cấy được trình bày trong bảng 3.26, hình 3.35
Kết quả cho thấy mật độ cá thể nuôi cấy ban đầu có ảnh hưởng đến sự tăng trưởng và sự tích lũy plumbagin như sau: với mật độ nuôi cấy thấp, cây có đầy đủ dưỡng chất để tăng trưởng và phát triển nên trọng lượng tươi trung bình của một cá thể tăng cao; song khi môi trường có đầy đủ dinh dưỡng để cung cấp cho quá trình Hình 3.35. Biểu đồ thể hiện ảnh hưởng của mật độ cá thể nuôi cấy
ban đầu lên sự tăng trưởng và sự tích lũy plumbagin của cây con
0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5
0 0,05 0,1 0,15 0,2 0,25 0,3 0,35 0,4
5 10 15 20 25 Hà
m lượng Plumbagin (mg/g)
khối lượngtươi trung bình 1 chồi ban đầu(g)
trong luong TB 1 mau ban dau Hàm lượng Plum (mg/g)
Bảng 3.26. Ảnh hưởng mật độ cá thể nuôi cấy ban đầu lên sự tăng trưởng và sự tích lũy plumbagin
của cây con
Mật độ cá thể (cá thể/100ml)
Khối lượng tươi trung bình của
cây từ 1 chồi ban đầu (g±SD)
Hàm lượng plumbagin (mg/g sinh khối tươi±SD)
5 0,367 ± 0,004d 0,282 ± 0,008a*
10 (ĐC) 0,371 ± 0,155d 0,392 ± 0,014b 15 0,316 ± 0,008c* 0,432 ± 0,009c*
20 0,211 ± 0,006b* 0,399 ± 0,007b 25 0,127 ± 0,002a* 0,385 ± 0,023b
Các số trung bình trong cột với các mẫu tự khác nhau thì khác biệt nhau, * chỉ sự khác biệt giữa các nghiệm thức với đối chứng, sự khác biệt có ý nghĩa ở mức p=0,05
Số liệu được trích từ file phụ lục “mat do ca the ban dau.exe”
Luận án Tiến sĩ Sinh học Trang 109 Bảng 3.27. Ảnh hưởng NAA lên sự tăng trưởng
và sự tích lũy plumbagin của cây con
Nồng độ NAA
(mg/l)
Khối lượng tươi 1 bình nuôi cấy
(g±SD)
Hàm lượng plumbagin (mg/g sinh khối
tươi±SD) 0 3,096 ± 0,029a 0,302 ± 0,008a 0,1 3,506 ± 0,081c* 0,332 ± 0,010b 0,5 3,617 ± 0,027d* 0,331 ± 0,003b 1 3,346 ± 0,114b* 0,430 ± 0,026d*
2 3,389 ± 0,110bc* 0,388 ± 0,122c*
3 3,304 ± 0,021b* 0,385 ± 0,132c*
Các số trung bình trong cột với các mẫu tự khác nhau thì khác biệt nhau, * chỉ sự khác biệt giữa các nghiệm thức với đối chứng, sự khác biệt có ý nghĩa ở mức p=0.05
Số liệu được trích từ file phụ lục “NAA.exe”
chuyển hóa tạo sản phẩm bậc 1 (cung cấp cho sự tăng trưởng và hoạt động phân chia của tế bào) thì các con đường sinh tổng hợp sản phẩm bậc 2 bị hạn chế [81]
nên ở nghiệm thức 5mẫu/100ml, 10mẫu/100ml mặc dù cây tăng trưởng mạnh nhưng sự tích lũy plumbagin lại thấp hơn so với các nghiệm thức có mật độ cá thể cao hơn. Với mật độ nuôi cấy cao (20mẫu/100ml, 25mẫu/100ml), có sự cạnh tranh dinh dưỡng xảy ra, cá thể nào đủ mạnh sẽ tăng trưởng và phát triển song sẽ ức chế sự tăng trưởng của cá thể yếu làm giảm trọng lượng tươi trung bình của một mẫu hơn so với các nghiệm thức còn lại, nhưng chính do sự thiếu dinh dưỡng mà những cá thể bị ức chế tăng trưởng có thể đã được cảm ứng con đường sinh tổng hợp sản phẩm thứ cấp làm gia tăng hàm lương plumbagin hơn so với các nghiệm thức có mật độ nuôi cấy ban đầu thấp.
Kết quả khảo sát cho thấy mật độ cá thể thích hợp nhất cho cả sự tăng trưởng lẫn tích lũy plumbagin ở D. burmanii trong loạt nghiệm thức đã tiến hành là 15mẫu/
100ml môi trường nuôi cấy. Với mật độ cá thể ban đầu này, sau 10 tuần nuôi cấy, sinh khối cây thu nhận có khối lượng không bằng mật độ cá thể 5 hay 10mẫu/100ml nhưng hàm lượng plumbagin thu nhận được có thể tăng cao hơn.