1.2 Tăng năng suất thu nhận hợp chất trong nuôi cấy tế bào thực vật
1.2.3 Can thiệp vào con đường sinh tổng hợp hoạt chất
Dựa trên kiến thức về con đường sinh tổng hợp, vài hợp chất hữu cơ được bổ sung vào môi trường nuôi cấy có thể cảm ứng sự tổng hợp hợp chất thứ cấp nhằm tăng hàm lượng [85]. Sự bổ sung các tiền chất hữu cơ xuất phát từ quan niệm cho rằng những hợp chất này có thể là chất trung gian hoặc là chất khởi đầu của một con đường sinh tổng hợp các sản phẩm thứ cấp. Bổ sung vào môi trường nuôi cấy các tiền chất thích hợp hoặc các hợp chất có liên quan sẽ giúp kích thích sự sản xuất các hợp chất thứ cấp [7], nâng cao hiệu quả sản xuất của tế bào trong một số trường hợp xác định. Những yếu tố như nồng độ và thời gian bổ sung tiền chất có ảnh hưởng
Luận án Tiến sĩ Sinh học Trang 30 lớn đến việc tăng hàm lượng trong hệ thống nuôi cấy. Trong nhiều trường hợp,
amino acid được sử dụng như những tiền chất với giá thành thấp và khá hữu hiệu trong việc tăng năng suất thu nhận hợp chất thứ cấp, chẳng hạn như:
− L-phenylalanine và L-tyrosine, amino acid có cấu trúc cơ bản là C6C3, là tiền chất để sinh tổng hợp nên nhiều hợp chất tự nhiên nhờ khả năng khử amin dưới sự xúc tác của enzyme phenylamin ammonia lyase (PAL) và tyrosine amoni lyase (TAL) của hầu hết thực vật [3].
− Bổ sung loganin, tryptophan, tryptamine đã cảm ứng sự tổng hợp secologanin và indole alkaloid trong nuôi cấy huyền phù tế bào Catharanthus roseus.
− Hàm lượng paclitaxel trong nuôi cấy huyền phù Taxus cuspidate đã tăng 6 lần bằng cách bổ sung phenylalanine và những tiền chất khác trong chu trình tổng hợp paclitaxel (benzoic acid, N-benzoylglycine và serine) [62].
− Flavonoid có cấu trúc cơ bản gồm 15 carbon với 2 vòng thơm được nối với nhau thông qua cầu nối có 3 carbon. Cầu nối và vòng thơm thứ nhất được tổng hợp từ phenylalanine thông qua con đường skikimic acid [99]. Vì vậy, khi bổ sung L- phenylanine vào môi trường nuôi cấy D. capensis và Dionaea muscipula thì quercetin tăng từ 1,6-2 lần và myricetin tăng từ 1,6-2 lần [68].
Bổ sung tiền chất là một phương pháp đầy hứa hẹn và có tính khả thi.
1.2.3.2 Sử dụng những nhân tố cảm ứng con đường sinh tổng hợp
Tác nhân cảm ứng (elicitor) là các tác nhân sinh học hay phi sinh học từ các nguồn khác nhau có thể dẫn đến sự biến đổi hình thái của thực vật. Theo nghĩa rộng, elicitor từ các nguồn khác nhau có thể khởi động các đáp ứng hình thái và sinh lý dẫn đến sự tích tụ các phytoalexin, đóng vai trò quan trọng trong con đường sinh tổng hợp để sản xuất các hợp chất có giá trị thương mại cao [15].
Tùy thuộc vào cơ sở phân loại mà elicitor có thể được chia làm các loại elicitor khác nhau như elicitor nội sinh và elicitor ngoại sinh (dựa trên nguồn gốc), elicitor sinh học và elicitor phi sinh học (dựa trên tính chất),…
Luận án Tiến sĩ Sinh học Trang 31 Elicitor sinh học (biotic elicitor): là những phân tử có nguồn gốc từ mầm bệnh hay
chính cơ thể chủ có thể cảm ứng phản ứng đối kháng (như sự tích lũy phytoalexin hay phản ứng siêu nhạy cảm). Trước đây, cấu trúc phân tử của elicitor sinh học thường không được biết rõ (các elicitor được dùng là cao nấm men, vách tế bào vi khuẩn). Trong những năm gần đây, cấu trúc phân tử chính xác của các elicitor đã được hiểu rõ hơn, bao gồm các loại polysaccharide khác nhau, oligosaccharide, protein, glycoprotein và các acid béo. Protein và enzyme là một lớp elicitor khác mà kích hoạt các phản ứng đối kháng trong nuôi cấy tế bào thực vật (như cellulase sẽ tích lũy nhanh hàm lượng phytoalexin trong nuôi cấy tế bào N. tabacum, elicitin là một elicitor được tạo ra từ nấm Phytophtora drechleri cảm ứng hoại tử ở lá cây thuốc lá). Protein elicitor được dùng để cảm ứng vai trò của các kênh ion trong màng tế bào thực vật bằng chuỗi truyền tín hiệu - được kích hoạt bằng sự tích lũy ngoại bào [38]. Glycoprotein cũng được coi là có khả năng cảm ứng phytoalexin trong nuôi cấy tế bào thực vật (như glycoprotein được chuẩn bị từ dịch chiết men bánh mì cảm ứng sự hình thành benzophenantridine alkaloids trong nuôi cấy tế bào Eschscholzia californica). Hormone thực vật cũng được xem như là elicitor [52].
Acid salicylic (SA) và acid jasmonic (JA) được coi là tín hiệu chìa khóa cho gen kháng của thực vật. Có ý kiến cho rằng SA điều hòa việc ngăn chặn nấm, vi khuẩn và các mầm bệnh có nguồn gốc virus, còn JA cảm ứng sự tạo thành các protein khác nhau qua con đường octadecanoid- cung cấp cho thực vật khả năng đối kháng với côn trùng [48].
Elicitor phi sinh học (abiotic elicitor): elicitor phi sinh học là những hợp chất có bản chất phi sinh học, chúng có thể ở dạng các muối vô cơ và các yếu tố vật lý hoạt động giống elicitor như ion Cu, Cd và tác nhân gây stress điều kiện sống của tế bào.Việc sử dụng elicitor phi sinh học nhận được ít sự quan tâm hơn so với elicitor sinh học. Một vài muối kim loại nặng được dùng để cảm ứng tạo phytoalexin, thí dụ như AgNO3, CdCl2 kích thích sự sản xuất vượt mức hai tropane alkaloid là scopolamine và hyoscyamine bằng nuôi cấy rễ tơ của Brugmansia candida [15].
Luận án Tiến sĩ Sinh học Trang 32 Đặc điểm của elicitor: elicitor tác động lên quá trình tích luỹ hợp chất trong nuôi
cấy tế bào mang rất nhiều chỉ tiêu có liên quan như khả năng chịu đựng của vật liệu màng tế bào, dòng tế bào, sự hiện diện của chất điều hoà tăng trưởng, thành phần dinh dưỡng của môi trường, quan trọng nhất là nồng độ elicitor, thời gian tác động elicitor, và thời điểm tác động elicitor
− Nồng độ elicitor: mỗi dòng tế bào sẽ có một mức chịu đựng trước những cảm ứng bên ngoài khác nhau do đó sẽ thích hợp với một nồng độ elicitor tối ưu khác nhau cho sự tích luỹ hợp chất. Nồng độ elicitor sử dụng quá thấp sẽ không đủ kích ứng sản xuất tối đa lượng hợp chất mà tế bào có thể. Nồng độ elicitor quá cao sẽ gây ra những đáp ứng quá ngưỡng cho phép, thường dẫn đến tế bào chết.
Chẳng hạn, khi nuôi cấy tế bào Catharanthus roseus nhằm thu nhận ajmalicine, nồng độ elicitor (dịch chiết Aspergillum niger) ở 5,0% sẽ cho hàm lượng ajmalicine cao hơn khi sử dụng nồng độ 0,5%, nhưng nếu sử dụng lượng cao hơn (10%) sẽ gây chết tế bào [84].
− Thời gian tác động elicitor: thử nghiệm trên tế bào Catharanthus roseus để thu nhận ajmalicine thì thấy rằng, thời gian thích hợp để cảm ứng elicitor (dịch chiết Tricoderma viride) là 48 giờ, ít hơn hay nhiều hơn thời lượng này, hàm lượng ajmalicine đều giảm rõ rệt.
− Thời điểm tác động elicitor: độ tuổi của tế bào nuôi cấy sẽ phản ánh khả năng chịu tác động và khả năng đáp ứng trước những tác động đó. Do vậy, thời điểm tác động elicitor vô cùng quan trọng. Thông thường, tuỳ vào hợp chất đích, người ta sẽ chọn thời điểm tế bào có khả năng can thiệp vào quá trình biến dưỡng của hợp chất đích này nhiều nhất nhưng cũng phải có khả năng chịu đựng tác động elicitor nhiều nhất. Như trường hợp Catharathus roseus, thời điểm thích hợp nhất để tác động dịch chiết Trichoderma viride cho mục tiêu thu nhận ajmalicine là khi tế bào được 20 ngày tuổi từ khi bắt đầu quá trình nuôi cấy [84].
Cơ chế tác động của elicitor: elicitor không chỉ cảm ứng sự hình thành phytoalexin de novo mà còn hoạt hóa sự sinh tổng hợp nhiều hợp chất chủ yếu trong tế bào nuôi cấy. Sự tổng hợp sesquiterpene gossypol ở Gossypium arboretum tăng lên
Luận án Tiến sĩ Sinh học Trang 33 hơn 100 lần khi dùng elicitor có nguồn gốc từ Verticillum dablia, hay sự tăng
sinh tổng hợp của benzopheanthridine alkaloid sanguinarine lên 26 lần khi sử dụng elicitor trong nuôi cấy huyền phù tế bào Papaver somniferum. Sự cảm ứng sinh tổng hợp isoflavonoid ở huyền phù tế bào Pueraria lobata bằng biotic elicitor (cao nấm men) hay abiotic elicitor (CuCl2) đã được nghiên cứu, đặc biệt ở mức độ phân tử. Elicitor tạo điều kiện để nghiên cứu ở mức phân tử của con đường truyền tín hiệu thông qua những tín hiệu ngoại bào dẫn đến sự sinh tổng hợp hợp chất thứ cấp, liên quan tới chất truyền tín hiệu thứ hai như nhóm oxygen hoạt hóa (reative oxygen species (ROS)), Ca2+ và phosphinositide [84].
Những nghiên cứu chuyên sâu đã góp phần hình thành cơ chế cho quá trình cảm ứng bằng elicitor ở thực vật. Các nghiên cứu chủ yếu tập trung về các elicitor sinh học và carbohydrate thông thường, còn sự hiểu biết về tác động của các elicitor phi sinh học trong việc gia tăng vượt mức các hợp chất thứ cấp ở thực vật vẫn còn rất sơ sài, quá trình cảm ứng bằng elicitor được giả thuyết là bao gồm tín hiệu Ca2+, các nhân tố đảm bảo tính nguyên vẹn của tế bào, sự ngăn cản hay hoạt hóa các con đường nội bào và thay đổi áp suất thẩm thấu hoạt động như một tác nhân gây stress.
Những nghiên cứu bước đầu về sự tác động của các elicitor sinh học ở hệ thống thực vật được nghiên cứu dựa vào cơ chế kháng trên tế bào động vật. Ở tế bào động vật, các receptor định vị ở màng tế bào sẽ hoạt hóa kênh ion và protein kinase.
Tương tự như thế, các bằng chứng chứng minh sự hiện diện của các receptor ở màng tế bào thực vật đã được ghi nhận. Cơ chế cảm ứng này dựa trên sự tương tác giữa elicitor- receptor. Khi tế bào thực vật được xử lý với elicitor thì một loạt các phản ứng sinh hóa xảy ra, bao gồm:
− Elicitor gắn vào thụ quan (receptor) ở màng tế bào
− Thay đổi dòng ion vào thông qua màng tế bào thực vật như kênh Cl-, K+, …, ở thực vật, Ca2+ hoạt động như chất truyền tin thứ hai với các đáp ứng khác nhau từ tín hiệu của môi trường kể cả mầm bệnh. Thí dụ, ở tế bào cây ngò tây, người ta từng phát hiện ra kênh calci đáp ứng elicitor và một kênh vận chuyển vào của calci được tìm thấy trong vòng vài phút sau khi thêm vào elicitor từ nấm
Luận án Tiến sĩ Sinh học Trang 34
− Gia tăng hoạt tính của phospholipase thực vật được tìm thấy ở một vài mô thực vật và nuôi cấy tế bào thực vật sau khi xử lý với elicitor, tổng hợp các tín hiệu thứ cấp như InsP3 và deacylglycerol (DAG), giải phóng tín hiệu nội bào trung gian Ca2+, nitric oxyde và con đường tín hiệu octadecanoid
− Sự thay đổi nhanh trong việc phosphoryl hóa protein được quan sát dựa trên việc bổ sung elicitor của các nuôi cấy tế bào khác nhau. Những nghiên cứu gần đây đã chứng minh rằng sự phosphoryl hóa đóng một vai trò quan trọng trong sự chuyển tín hiệu thực vật chống lại mầm bệnh và stress, hoạt hóa protein kinase
− Hoạt hóa protein G (là một phần trong việc đáp ứng tín hiệu với elicitor)
− Hoạt hóa NADPH oxydase đáp ứng AOS (active oxide species), acid hóa cytosol
− Tái sắp xếp lại bộ xương tế bào
− Tạo các oxy hoạt động
− Tích lũy các protein có liên quan đến mầm bệnh như chitinase và glucanase, endopolygalacturonases… các nhân tố ngăn cản protease
− Sự chết tế bào ở vị trí bị xâm nhiễm
− Sự thay đổi cấu trúc ở màng tế bào (lignin hóa màng tế bào, tích tụ mô sẹo)
− Hoạt hóa phiên mã các gen đáp ứng kháng
− Các phân tử đề kháng của thực vật như tannin, phytoalexin được phát hiện 2-4 giờ sau khi xử lý với elicitor
− Tổng hợp jasmonic và acid salicylic như một thông tin thứ cấp
− Đáp ứng tập nhiễm SAR (systemic acquired resistance)
Không phải tất cả các elicitor đều diễn ra theo chuỗi sự kiện phía trên, những nghiên cứu về trật tự thời gian của những sự kiện này và sự kết nối bên trong giữa chúng còn nhiều phức tạp và vẫn đang được nghiên cứu [15].
Luận án Tiến sĩ Sinh học Trang 35 2 VẬT LIỆU PHƯƠNG PHÁP