2.2 Sàng lọc và thu nhận một số hợp chất có hoạt tính sinh học từ nguồn nguyên liệu in vitro của Drosera
2.2.3 Kiểm tra hoạt tính sinh học của hợp chất cô lập được
2.2.3.1 Kiểm tra hoạt tính của hợp chất cô lập được theo định hướng có hoạt tính kháng oxy hóa: phương pháp TBA (thiobarbituric acid) và phương pháp FTC (ferric thyocyante)
Vật liệu: hợp chất cô lập được, ammonium thiocyanate 30%, FeCl2 0,02M (pha trong HCl 3,5%), TCA (20%), TBA (20%), ethanol, acid linoleic 2,51% (pha trong ethanol), đệm phosphate 0,05M với pH7, α-tocopherol (vitamin E) và butyl hydroxyl aldehyde (BHA) làm chứng dương.
ắ Phương phỏp TBA
Phương pháp này dựa theo phương pháp ức chế quá trình peroxide hóa lipid của Ottolenghi (1959) và nhóm tác giả Kikuzaki (1993), với cơ sở: trong suốt quá trình oxy hóa, peroxide được phân hủy dần thành các hợp chất có trọng lượng phân tử thấp hơn. Một trong những hợp chất như vậy là malonaldehyde, có thể được đo lường bằng phương pháp TBA vào ngày cuối của chu kỳ ủ (1 ngày sau khi mẫu đối chứng đạt cực đại). Malonaldehyde là sản phẩm chính khi lipid bị oxy hóa, nó phản ứng với TBA cho phức chất có màu đỏ, hấp thu cực đại ở 532nm. Do đó, phổ hấp thu càng thấp chứng tỏ hợp chất có khả năng kháng oxy hóa càng cao [114]
Các bước tiến hành: hòa tan 4mg mẫu thử trong 4ml ethanol 96%, thêm 4,1ml acid linoleic + 8ml đệm phosphate 0,05M với pH7 + 3,9ml nước cất; đem hỗn hợp ủ trong tối ở 400C. Cho vào một ống nghiệm: 1ml hỗn hợp + 2ml TCA 20% + 2ml TBA 20%, đặt ống nghiệm trong bể nước sôi trong 10 phút, sau đó làm lạnh, đem ly
Luận án Tiến sĩ Sinh học Trang 43 tâm 3000 vòng/phút trong 20 phút, dịch nổi sau ly tâm được đo độ hấp thu ở 532nm
sau mỗi 24 giờ. Đo đến sau khi mẫu chứng âm đạt cực đại một ngày.
Chỉ tiêu theo dõi: khảo sát đường cong biến thiên độ hấp thu quang phổ của mẫu thử ở bước sóng 532 nm để đánh giá khả năng kháng oxy hóa của hợp chất so với chứng âm và chứng dương. Đồng thời xác định tỷ lệ % hoạt tính kháng oxy hóa của hợp chất vào ngày cuối của chu kỳ ủ theo công thức (2). Thí nghiệm được lặp lại 2 lần. Mỗi lần lặp lại là một quy trình thực hiện phản ứng độc lập.
ắ Phương phỏp FTC
Phương pháp này dựa theo Osawa và Namiki (1981), cũng là một trong những phương pháp phổ biến được sử dụng để đo mức độ per-oxy hóa trong suốt giai đoạn đầu tiên của sự oxy hóa chất béo. Giá trị hấp thu càng thấp chứng tỏ hợp chất có hoạt tính kháng oxy hóa càng cao [114].
Các bước tiến hành: hòa tan 4mg mẫu thử trong 4ml ethanol 96%, thêm 4,1ml acid linoleic + 8ml đệm phosphate 0,05M với pH7 + 3,9ml nước cất; đem hỗn hợp ủ trong tối ở 400C. Cho vào một ống nghiệm: 0,1ml hỗn hợp + 9,7ml ethanol 75% + 0,1ml FeCl2 0,02M; để yên ống nghiệm trong 3 phút, đo độ hấp thu ở 500nm sau mỗi 24 giờ. Đo đến sau khi mẫu chứng âm đạt cực đại một ngày.
Chỉ tiêu theo dõi: khảo sát đường cong biến thiên độ hấp thu quang phổ của mẫu thử ở bước sóng 500nm để đánh giá khả năng kháng oxy hóa của hợp chất so với chứng âm và chứng dương. Đồng thời xác định % hoạt tính kháng oxy hóa của hợp chất bằng công thức (2). Thí nghiệm được lặp lại 2 lần. Mỗi lần lặp lại là một quy trình thực hiện phản ứng độc lập.
Công thức tính phần trăm hoạt tính kháng oxy hóa: AI (%) = 100 × (A0 – A)/ A0 (2) Trong đó, A0 là độ hấp thu của chứng âm (phản ứng không chứa chất kiểm tra) và A là độ hấp thu của mẫu cần kiểm tra hoạt tính chống oxy hóa
Luận án Tiến sĩ Sinh học Trang 44 2.2.3.2 Kiểm tra hoạt tính của hợp chất cô lập được theo định hướng có khả năng
ức chế sự tăng sinh của tế bào ung thư ruột kết ở người DLD-1
a. Phương pháp Coulter counter: ảnh hưởng của hoạt chất lên sự tăng sinh và phát triển tế bào DLD-1
Vật liệu: mẫu cần kiểm tra pha loãng bằng dung môi DMSO 0,25%, dòng tế bào ung thư ruột kết ở người DLD-1 được cung cấp bởi American Type Culture Collections, McCoy’s 5A media w. GlutaMaxTM (10% FBS), D-PBS, Gemtamicin và Trypsin của hãng Gibco.
Thiết bị: Máy đếm tế bào Coulter counter hiệu CoulterR Partikle count & size analyser Z2 (Beckmann Coulter Inc.) với phần mềm hỗ trợ Multisizer program AccuComp có thể ghi nhận thể tích và đường kính tế bào đo. Phần mềm ImageJ version 1,38x được sử dụng để đo diện tích tế bào. Kính hiển vi đối pha Leica DM IRA witLeica DC 300F cam.
Phương pháp: sự tăng sinh và phát triển của tế bào DLD-1 sau khi cảm ứng với hoạt chất cô lập được khảo sát trong 48 giờ. Trải đều tế bào vào mỗi giếng của đĩa 24 giếng với mật độ 3,5x104 tế bào/giếng 24 giờ trước khi cảm ứng hoạt chất để tế bào bám vào đáy giếng. Loại bỏ môi trường cũ, thay bằng môi trường mới có bổ sung hoạt chất cần kiểm tra với các nồng độ khác nhau. Ghi nhận sự tăng sinh và phát triển của tế bào sau 24, 48 giờ: tại thời điểm ghi nhận, môi trường có hoạt chất được loại bỏ, rửa tế bào với PBS, ủ tế bào đang bám ở đáy giếng bằng Trypsin 25%
trong 20 phút để tế bào rời khỏi đáy, tế bào sau khi tách khỏi đáy giếng được huyền phù trong PBS để tránh tế bào kết cụm trước khi pha loãng trong NaCl 0,9%, dịch tế bào được pha loãng này được đặt vào máy đếm Coulter counter. Máy đếm sẽ ghi nhận số lượng vật thể cú đường kớnh 9-30àm cú trong dịch đem đo cựng với thụng tin về đường kính và thể tích của từng vật thể đó.
Chỉ tiêu theo dõi: xác định nồng độ ức chế 50% sự tăng sinh tế bào (IC50). Giá trị này được xác định dựa trên sự ngoại suy từ biểu đồ thể hiện giá trị tỷ lệ ức chế sự tăng sinh (I%) tương ứng với các nồng độ khảo sát; đồng thời xác định ảnh hưởng
Luận án Tiến sĩ Sinh học Trang 45 của hoạt chất lên hình thái tế bào thông qua các thông số diện tích, đường kính và
thể tích tế bào Thí nghiệm được lặp lại 4 lần, mỗi lần là một giếng trong đĩa 24 giếng cho mỗi nồng độ.
b. Western blot : ảnh hưởng của hoạt chất lên sự sinh tổng hợp protein và biểu hiện của protein mTOR (mammalian target of rapamycin)
Hóa chất và thiết bị: ngoài những hóa chất cần thiết cho phương pháp Coulter counter assay, cần thêm: kháng thể của protein mTOR, pmTOR (Ser2448), pS6K của hãng Cell Signaling (USA), màng lai PVDF của hãng Amersham, GE Healthcare (United Kingdom), bảng gel chạy điện di Tris-HCl SDS (4-12%) có 10- 12 giếng 20àl của Bio-rad (USA); thiết bị đỏnh súng siờu õm, bồn chạy điện di Mini Protean II apparatus (Biorad), máy đo quang phổ UV/visible Spectrophotometer pharmacia LKB-Ultrospec II, máy ly tâm lạnh Ole Dick, phần mêm hỗ trợ cho phân tích tín hiệu phát quang trên màng lai Vision Words LS Acquisition & Analysis 6.4.3 software.
Phương pháp: mTOR là một protein kinase thiết yếu cho sự tăng sinh và phát triển tế bào động vật. Khi gen TOR bị hủy đi, lập tức tế bào sẽ không còn khả năng sống.
Trong cơ thể người, người ta nhận ra được rằng hầu hết những dạng ung thư đều do biểu hiện hơn mức bình thường của con đường truyền tín hiệu protein kinase mTOR [101]. Protein này được xác định và dòng hóa vào năm 1994 sau khi người ta khám phá ra hai gen TOR1 và TOR2 ở Streptopmyces hygroscopicus khi họ nghiên cứu về tính kháng của rapamycin trên chủng nấm này [44], [86]. Tuy nhiên, ở người, 2 gen này mã hóa nên một loại protein mTOR duy nhất gồm 2 phức hợp là mTORC1 và mTORC2 đều có vai trò thiết yếu trong con đường truyền tín hiệu (hình 2.3).
Quy trình nhiều bước trong Western Blot được sử dụng để phân tách protein và sau đó phát hiện protein đặc hiệu quan tâm (hình 2.4). Trong đó có hai loại kháng thể được sử dụng: (1) kháng thể đặc hiệu cho protein quan tâm, (2) kháng thể có khả năng gắn với kháng thể 1 và được gắn với enzyme hay phân tử khác cho mục đích phát hiện kháng thể 1 (nhờ đó phát hiện được protein quan tâm đã gắn vào kháng
Luận án Tiến sĩ Sinh học Trang 46 Hình 2.4. Phương pháp Western Blot
thể 1). Trong luận án này, chúng tôi đã sử dụng Western Blot để khảo sát sự biểu hiện của protein mTOR, hoạt tính phosphoryl hóa của mTOR (pmTOR), và phân tử downstream của mTOR trong con đường truyền tín hiệu (S6K) [86] (hình 2.3) ở dòng tế bào DLD-1 khi bị tác động bởi hoạt chất khảo sát. Thí nghiệm sử dụng chứng dương là rapamycin [16].
Hình 2.3. Con đường truyền tín hiệu mTOR và những cơ chất có liên quan [86]
Luận án Tiến sĩ Sinh học Trang 47 Các bước tiến hành:
Nuôi cấy tế bào DLD-1: tế bào DLD-1 ở vào giai đoạn tăng sinh được nuôi cấy như mục 2.2.1.2, có độ phủ khoảng 80%. Trên đĩa petri có đường kính 10cm, trải đều tế bào trong 10ml môi trường nuôi, với nồng độ 105 tế bào/ml, ủ trong 24 giờ để tế bào bám vào đáy đĩa. Cảm ứng tế bào với hoạt chất khảo sát và chứng âm là DMSO, chứng dương là rapamycin trong 5 khoảng thời gian khảo sát (0phút, 30phút, 120phút, 8giờ, 48giờ).
Thu nhận protein tổng: sau mỗi thời gian cảm ứng, ở mỗi đĩa có hoạt chất khác nhau, loại bỏ môi trường có hoạt chất cảm ứng, rửa nhẹ bằng 2ml PBS 2 lần để chắc chắn đã loại bỏ hoạt chất, thu nhận sinh khối tế bào bị cảm ứng bằng cách “scrap” tế bào với thanh scraper vô trùng trong 1ml PBS. Ly tâm 1ml huyền phù PBS chứa sinh khối tế bào đã thu nhận ở 40C với 15000 vòng/phút trong 15 giây, loại bỏ PBS ở trên, thêm lại 500μl PBS để huyền phù và trộn đều để rửa sinh khối. Ly tâm lần thứ 2, loại bỏ PBS ở trờn, thờm 150μl dung dịch ức chế protease PI gồm 240àl dung dịch mẹ 12,5X hỗn hợp (312,5 mM Tris + 2500 mM NaCl, chỉnh pH8,5 bằng HCl, + 12,5 mM DTT + nước cất cho đủ 4ml + 1 viờn Complete) và 2760àl nước cất vào huyền phù tế bào. Đánh sóng siêu âm trực tiếp vào sinh khối tế bào 3 lần, mỗi lần 5 giây trong đá. Ly tâm 15000 vòng/phút huyền phù tế bào sau khi đánh sóng siêu âm ở 40C trong 30 phút, phần dịch trong bên trên là protein tổng của tế bào. Lưu trữ protein ở -800C cho đến khi thu nhận đủ ở các mẫu đã cảm ứng.
Xác định hàm lượng protein tổng bằng phương pháp DC Protein Assay reagents (Bio-Rad, Denmark) (phụ lục 1.2): dựng đường chuẩn tuyến tính giữa nồng độ protein chuẩn BSA (0; 0,065; 0,125; 0,25; 0,375; 0,5; 0,75mg/l) và giá trị mật độ quang hấp thu ở bước sóng 750nm. Xác định giá trị OD của protein BSA ở các nồng độ khỏc nhau bằng cỏch thờm vào mỗi 100àl dung dịch protein BSA 100μl A/S reagent (*) và 800μl B reagent (**), trộn đều và để yên trong 15 phút trước khi đem đo, sử dụng nước cất là chuẩn 0. Tương tự, khi xác định giá trị OD của dung dịch protein tổng đã thu nhận, 100μl dung dịch protein tổng cần đo (được pha loãng
Luận án Tiến sĩ Sinh học Trang 48 sao cho giá trị OD nằm trong đường chuẩn đã có) được thay thế cho dung dịch
protein BSA đã dùng dựng đường chuẩn. Giá trị OD ghi nhận được của dung dịch mẫu được giống lên đường chuẩn để suy ra nồng độ protein tổng. Mỗi mẫu được lặp lại 3 lần, mỗi lần đo là một lần thực hiện phản ứng màu độc lập.
(**) dung dịch A/S: 20μl dung dịch S (*) + 1ml dung dịch A(*)
(*) các dung dịch trong bộ kit để định lượng protein của BioRad (phụ lục 1.2)
Điện di protein bằng phương pháp SDS PAGE: protein tổng sau khi được xác định hàm lượng sẽ được pha loãng sao cho có cùng hàm lượng trong các ependorph bằng nước cất, bổ sung vào mỗi ependorph 4μl bromphenol blue, ly tâm trong 5 giây với tốc độ khoảng 15000 vòng/phút để trộn mẫu, biến tính protein trong 2 phút ở 950C, ly tâm lại lần 2 cũng trong 5 giây trước khi bơm mẫu vào giếng trên bảng gel SDS Tris-HCl, đặt bảng gel vào bồn điện di Mini Protean II, châm đầy bồn bằng dung dịch điện di (thành phần được trỡnh bày trong phụ lục 1.3), bơm mẫu và 12àl marker vào các giếng, chạy điện di bằng dòng điện có điện thế 60V trong 30 phút đầu đủ cho mẫu chạy qua hết phần gel gom để tụ về cùng một điểm xuất phát, sau đó thay dòng điện có điện thế 100V trong khoảng 60 phút sao cho vệt đầu tiên của mẫu về đến đáy giếng.
Chuyển protein đã được phân tách sau điện di lên màng lai: cắt màng lai PVDF thành những kích thước thích hợp với bảng gel, ủ màng lai trong ethanol 20 phút, sau đó ủ màng lai trong dung dịch lai (phụ lục 1.3) cùng với giấy lọc và miếng đệm trong 20 phút, lấy bảng gel mang các protein phân tách ra và đem ủ trong dung dịch lai nhưng trong khoảng 5 phút. Tạo hệ thống lai gồm tuần tự các lớp theo thứ tự:
một mặt của khay kẹp để giữ − miếng bọt đệm − giấy lọc − gel − màng lai − giấy lọc − miếng bọt đệm − mặt còn lại của khay kẹp. Đặt hệ thống này vào bồn điện di tương tự bảng gel và chạy với dòng điện có điện thế 220V trong khoảng hơn 60 phút trong dung dịch điện di được làm lạnh với đá.
Khóa những vị trí không đặc hiệu: màng lai được ngâm trong dung dịch khóa (phụ lục 1.3) trong 60 phút trên máy lắc.
Luận án Tiến sĩ Sinh học Trang 49 Phát hiện kháng thể: màng lai được ủ qua đêm với dung dịch kháng thể thứ 1 (phụ
lục 1.3) của protein actin ở nhiệt độ phòng, protein mTOR và protein pmTOR ở 40C. Rửa màng lai trên máy lắc trong 5 phút × 3 lần để loại các kháng thể thứ 1 không gắn với protein đích trong TBS-T (phụ lục 1.3). Sau đó ủ màng lai với dung dịch kháng thể thứ 2 là dung dịch kháng thể thỏ DAKO P0127 (phụ lục 1.3) cho protein mTOR, pmTOR, S6K và dung dịch kháng thể chuột DAKO P260 (phụ lục 1.3) cho protein actin làm tín hiệu chuẩn.
Phát hiện tín hiệu: sau khi ủ với dung dịch kháng thể thứ 2, màng lai được rửa để loại các kháng thể thứ 2 thừa không gắn vào kháng thể thứ 1 đặc hiệu trong TBS-T (phụ lục 1.3) trên máy lắc trong 5 phút × 3 lần. Trải dung dịch phát quang tín hiệu (Super signal kit) lên bề mặt màng lai, ủ trong 5 phút trước khi đặt vào phòng tối để phát hiện tín hiệu của protein.