2.2 Sàng lọc và thu nhận một số hợp chất có hoạt tính sinh học từ nguồn nguyên liệu in vitro của Drosera
2.2.1 Các phương pháp khảo sát hoạt tính sinh học được sử dụng để sàng lọc phân đoạn cao chứa hoạt chất
Dựa trên giá trị dược tính của dịch chiết Drosera đã được công bố (bảng 1.4) và nhu cầu trị liệu của hai căn bệnh hiểm nghèo của xã hội hiện nay là tim mạch và ung thư, chúng tôi đã chọn sàng lọc theo hai hướng khảo sát hoạt tính sinh học là: hoạt tính kháng oxy hóa và khả năng ức chế sự tăng sinh tế bào ung thư.
2.2.1.1 Sàng lọc theo hướng tìm hợp chất có hoạt tính kháng oxy hóa: thử nghiệm năng lực khử bằng phương pháp Yen và Duh (1993) [119]
Vật liệu: mẫu cần sàng lọc, đệm sodium phosphate 0,2M pH6,6; potassium ferricyanide 1%, acid tricloroacetic 10%, FeCl3 1%, α-tocopherol (vitamin E) với nồng độ 500àg/ml làm chứng dương và nước cất làm chứng õm.
Phương pháp: trong phương pháp Yen và Duh (1993), ion Fe3+ trong phân tử potassium ferricyanide (K3[Fe(CN)6]) bị khử thành ion Fe2+ trong phân tử potassium ferrocyanide (K4[Fe(CN)6]). Sau đó, bổ sung Fe3+ phản ứng với ion ferrocyanide tạo thành một phức hợp ferric ferrocyanide (Fe4[Fe(CN)6]3) màu xanh.
Luận án Tiến sĩ Sinh học Trang 39 Cường độ màu tỷ lệ với hàm lượng ion ferrocyanide, tức là tỷ lệ với khả năng khử
của hợp chất thử nghiệm.
X + K3[Fe(CN)6] K4[Fe(CN)6] hay X + [Fe(CN)6]3- [Fe(CN)6]4−
4Fe3+ + 3[Fe(CN)6]4- Fe4[Fe(CN)6]3 (màu xanh)
Các bước tiến hành thí nghiệm sàng lọc: mẫu cần sàng lọc được hòa trong 10ml ethanol tạo thành dung dịch thử nghiệm. Hút 1ml dung dịch thử nghiệm vào ống nghiệm, 1ml ethanol cho chứng âm. Sau đó thêm 2,5ml dung dịch đệm sodium phosphat 0,2M pH6,6, lắc đều rồi hút thêm 2,5ml dung dịch potassium ferricyanide 1%, hỗn hợp phản ứng được ổn định ở nhiệt độ 50oC trong thời gian 20 phút. Sau thời gian 20 phút, thêm vào hỗn hợp phản ứng 2,5ml acid tricloroacetic 10%, lắc đều các hỗn hợp phản ứng, sau đó ly tâm 2000 vòng/phút trong 10 phút để loại bỏ kết tủa, thu lấy dịch nổi. Hút 1ml dịch nổi vào ống nghiệm khác, thêm 2ml nước cất và 0,5ml dung dịch FeCl3 1%, lắc đều hỗn hợp trên rồi để yên trong thời gian 5 phút. Sau cùng, dịch phản ứng được đem đo độ hấp thu ở bước sóng 700nm.
Chỉ tiêu theo dõi: độ hấp thu của dung dịch ở bước sóng 700nm càng cao thể hiện năng lực khử của dung dịch thử nghiệm càng cao. So sánh năng lực khử giữa các mẫu để chọn mẫu có hoạt tính kháng oxy hóa cao nhất. Mỗi mẫu thử nghiệm là một nghiệm thức. Mỗi nghiệm thức được lặp lại 3 lần. Mỗi lần lặp lại là một ống nghiệm được tiến hành phản ứng độc lập.
2.2.1.2 Sàng lọc theo hướng tìm hợp chất có khả năng ức chế tăng sinh tế bào:
phương pháp Sulforhodamine B (SRB)
Vật liệu: mẫu cần sàng lọc được pha loãng bằng dung môi DMSO 0,25%, dòng tế bào ung thư ruột kết ở người DLD-1 được cung cấp bởi American Type Culture Collections, McCoy’s 5A media w. GlutaMaxTM (10% FBS), D-PBS, Gemtamicin và Trypsin của hãng Gibco, SRP 0,2%, TCA 50%, acid acetic 1%, Tris-base 10mM và hoạt chất resveratrol của hóng Sigma (60àM) pha trong DMSO 0,25% làm chứng dương [14], [17], [67].
Luận án Tiến sĩ Sinh học Trang 40 Phương pháp SRB: SRB là thuốc nhuộm aminoxanthene có màu hồng, tủa trong
môi trường acid nhẹ, tan trong môi trường kiềm. Thí nghiệm dựa vào khả năng SRB gắn vào protein tế bào nhờ lực tĩnh điện (hai nhóm sulfonic gắn tĩnh điện với base amino acid của tế bào) sau khi tế bào được cố định trên giếng bằng TCA. Do vậy, tổng lượng SRB từ các tế bào bắt màu hồng sẽ tỷ lệ với tổng lượng protein của tế bào [97].
Nuôi cấy tế bào ung thư ruột kết DLD-1: DLD-1 được nuôi cấy bằng môi trường McCoy’s 5A bổ sung 10% FBS; 0,1% gentamicin trong điều kiện nuôi được duy trì ở 370C, độ ẩm 95% và 5% CO2, cấy chuyền 2 lần một tuần. Tế bào sử dụng trong thí nghiệm phải đạt được độ phủ khoảng 70-80% bình nuôi và mật độ tế bào ban đầu trong một giếng của đĩa 96 giếng là 104tế bào/100àl/giếng. Tế bào được đếm bằng máy đếm tế bào CoulterR Partikle count & size analyser Z2 (Beckmann Coulter Inc.) với phần mềm hỗ trợ Multisizer program AccuComp [67].
Các bước tiến hành thí nghiệm sàng lọc: trải đều tế bào DLD-1 vào đáy mỗi giếng của đĩa (đĩa 96 giếng) theo mật độ 104tế bào/100àl/giếng trước 24 giờ để tế bào bỏm vào đỏy giếng. Cảm ứng cỏc mẫu thử nghiệm (cú nồng độ 100àg/ml pha trong DMSO 0,25%) với tế bào cựng với 1 chứng dương (resveratrol 60àM pha trong DMSO 0,25%) và 1 chứng âm (DMSO 0,25%), 1 giếng blank để so màu (gồm môi trường có mẫu cảm ứng ở mỗi nghiệm thức nhưng không có tế bào), tất cả được ủ trong 48 giờ. Tế bào sau khi cảm ứng mẫu thử nghiệm được cố định bằng TCA (50àl/giếng) ở nhiệt độ lạnh từ 1-3 giờ. Loại dịch TCA và rửa bằng nước cất 5 lần, sau đó để khô tại nhiệt độ phòng trong 12-24 giờ. Tế bào cố định sau khi phơi khô được đem nhuộm bằng SRB 0,2% (100àl/giếng) trong 20 phỳt ở nhiệt độ phũng.
Sau đú, tế bào nhuộm SRB được rửa 4 lần bằng acid acetic 1% (200àl/giếng) rồi để khụ trong 12-24 giờ. Thờm 200àl Tris 10mM vào mỗi giếng và đặt đĩa lờn mỏy lắc trong 10 phút để hòa tan hoàn toàn SRB cố định. Ghi nhận giá trị OD tại bước sóng 492nm và 620nm bằng máy đọc ELISA reader.
Luận án Tiến sĩ Sinh học Trang 41 Chỉ tiêu theo dõi: khả năng ức chế sự tăng sinh tế bào của mẫu thử nghiệm được
xác định bằng tỷ lệ ức chế I (%) được tính bằng công thức (1)
I (%) = (1− (OD(492-620)mẫu /OD(492-620)chứng âm ))×100% (1) Trong đó: OD(492-620)mẫu = OD(492-620)mẫu có tế bào− OD(492-620)mẫu blank
OD(492-620)chứng âm= OD(492-620)chứng âm có tế bào− OD(492-620)chứng âm blank
Mỗi mẫu cảm ứng lên tế bào DLD-1 là một nghiệm thức trong thí nghiệm sàng lọc.
Mỗi nghiệm thức được lặp lại 6 lần. Mỗi lần lặp lại là một giếng.