3.4 Khảo sát việc ứng dụng một số kỹ thuật làm tăng năng suất thu nhận hoạt chất lên hệ thống nuôi cấy dịch huyền phù tế bào
3.4.1 Tạo dịch huyền phù tế bào
3.4.1.1 Ảnh hưởng của nền khoáng và nồng độ đường lên khả năng sống của lớp mỏng tế bào
Sau 14 ngày mẫu lớp mỏng tế bào được tiếp xúc với môi trường nuôi cấy, tỷ lệ % số mẫu còn xanh và tươi được xác định và trình bày trong bảng 3.35 và hình 3.45.
Bảng 3.35. Ảnh hưởng của nền khoáng, nồng độ đường lên khả năng sống của lớp mỏng tế bào
Loại môi trường
Tỷ lệ lớp mỏng tế bào còn sống (%±SD)
10g đường 20g đường 30g đường 40g đường
MS 8,889 ± 3,849ab 11,111 ± 3,849abc 11,111 ± 3,849abc 17,778 ± 3,849cd MS1/2 8,889 ± 3,849ab 11,111 ± 3,849abc 17,778 ± 3,849cd 4,444 ± 3,849a Gamborg’s B5 11,111 ± 3,849abc 37,778 ± 3,849e 22,222 ± 3,849d 13,333 ± 0,000bc Các số trung bình trong cột với các mẫu tự khác nhau thì khác biệt nhau, sự khác biệt có ý nghĩa ở mức p=0,05
Luận án Tiến sĩ Sinh học Trang 124 Kết quả giúp chúng tôi chọn được nền khoáng thích hợp cho mẫu cấy lớp mỏng là
Gamborg’s B5 và nồng độ đường thích hợp là 20g/l. Kết quả cũng phù hợp với nghiên cứu trên thế giới đã thành công trong tạo sẹo từ lớp mỏng tế bào Dionaea muscipula, 1 loài cây cùng họ với Drosera, bằng môi trường Gamborg’s B5 [50].
Ghi nhận thực tế cho thấy, khi sử dụng nồng độ đường cao hơn 20g/l, các mẫu mô tế bào đều có xu hướng co lại rồi chết; nồng độ đường thấp hơn 20g/l, các mẫu mô hóa đen nhanh hơn và chết sớm nhất. Do vậy, môi trường Garmborg’s B5 được chọn làm môi trường cơ bản để nuôi cấy lớp mỏng tế bào cho mục tiêu tạo mô sẹo với nồng độ đường succrose thích hợp là 20g/l.
3.4.1.2 Ảnh hưởng của sự kết hợp hai loại hormone tăng trưởng (2,4-D và NAA) lên sự cảm ứng tạo mô sẹo từ lớp mỏng tế bào lá và tế bào rễ Drosera Lớp mỏng tế bào có độ dày khoảng 1-2mm của hai bộ phận thông dụng là lá và rễ của cây con D. burmanii hoàn chỉnh được tái sinh bằng phương pháp nhân giống in vitro ở mục 3.1 có nguồn gốc từ một cây trưởng thành ban đầu được đặt vào các môi trường bán rắn Garmborg’s B5, nồng độ đường 20g/l bổ sung 5 nồng độ NAA khác nhau (0; 0,1; 0,2; 0,3; 0,4mg/l) và 5 nồng độ 2,4-D khác nhau (0; 0,1; 0,2; 0,3;
0,4mg/l). Sau 5 tuần nuôi cấy, tỷ lệ mẫu tạo mô sẹo (%) và hình thái mô sẹo được ghi nhận trong bảng 3.36.
Trong môi trường bổ sung 2,4-D và NAA, mô sẹo chủ yếu được tạo thành từ các nghiệm thức NAA và 2,4-D có nồng độ (0,1; 0,2mg/l), nhưng đa số mô sẹo tạo ra Hình 3.45. Biều đồ thể hiện ảnh hưởng của nền khoáng và nồng độ đường lên khả năng
sống của lớp mỏng tế bào
0 10 20 30 40
Tỷ lệ lớp mỏng tế bào còn sống (%)
Luận án Tiến sĩ Sinh học Trang 125 đều rất nhỏ và không xốp, không đảm bảo yêu cầu trong nuôi cấy huyền phù (hình
3.46 và 3.47). Mô sẹo được tạo ra ở các nghiệm thức này chủ yếu do kích thích của 2 loại auxin 2,4-D và NAA cùng với ảnh hưởng của cytokinine nội sinh trong mẫu.
Tuy nhiên, có thể nồng độ cytokinine nội sinh thấp nên sự kết hợp các hormone chưa đạt được yêu cầu cảm ứng tạo sẹo của mẫu. Do đó, sự kết hợp thêm KN đã được thử nghiệm với hy vọng có được 100% mẫu nuôi cấy đều tạo mô sẹo và mô sẹo có được trạng thái tơi xốp hơn.
Bảng 3.36 . Tỷ lệ mẫu tạo mô sẹo từ lá và rễ D. burmanii dưới ảnh hưởng của 2,4-D kết hợp NAA
2,4-D (mg/l) NAA (mg/l) Tỷ lệ mẫu tạo mô sẹo từ lá (%±SD)
Tỷ lệ mẫu tạo mô sẹo từ rễ (%±SD)
0
0 - -
0,1 - -
0,2 - -
0,3 - -
0,4 - -
0,1
0 - -
0,1 55,00 ± 5,00 (7) 73,00 ± 3,00 (7) 0,2 31,67 ± 1,67 (12) 100,00 ± 0,00 (12)
0,3 - -
0,4 - -
0,2
0 - -
0,1 81,25 ± 18,75 (8) 83,33 ± 16,67 (8) 0,2 82,50 ± 17,50 (13) 9,50 ± 0,50 (13) 0,3 12,14 ± 2,14 (18) -
0,4 - -
0,3
0 - -
0,1 - -
0,2 - -
0,3 15,83 ± 0,83 (19) - 0,4 63,93 ± 21,08 (24) -
0,4
0 - -
0,1 30,67 ± 2,67 (10) - 0,2 26,79 ± 1,79 (15) - 0,3 71,67 ± 11,67 (20) -
0,4 - -
Luận án Tiến sĩ Sinh học Trang 126 3.4.1.3 Ảnh hưởng của sự kết hợp 3 loại hormone tăng trưởng (2,4-D: NAA: KN)
lên sự cảm ứng tạo mô sẹo từ lớp mỏng tế bào lá và tế bào rễ Drosera Lớp mỏng tế bào có độ dày khoảng 1-2mm của hai bộ phận thông dụng là lá và rễ của cây con D. burmanii hoàn chỉnh được tái sinh bằng phương pháp nhân giống in vitro ở mục 3.1 có nguồn gốc từ một cây trưởng thành ban đầu được đặt vào các môi trường bán rắn Garmborg’s B5, nồng độ đường 20g/l bổ sung 4 nồng độ KN
Hình 3.46. Hình thái mô sẹo được tạo thành từ lá D.burmanii
NT8 (NAA: 0,1mg/l; 2,4-D: 0,2mg/l), NT13 (NAA: 0,2mg/l, 2,4-D: 0,2mg/l)
NT8 NT13
Hình 3.47. Hình thái mô sẹo được tạo thành từ rễ D.burmanii
NT8 (NAA: 0,2mg/l, 2,4-D: 0,1mg/l), NT12 (NAA: 0,2mg/l, 2,4-D: 0,1mg/l)
NT8 NT12
Luận án Tiến sĩ Sinh học Trang 127 khác nhau (0,1; 0,2; 0,3; 0,4mg/l) kết hợp với 2,4-D (0,1; 0,2mg/l) và NAA (0,1;
0,2mg/l). Sau 5 tuần nuôi cấy, tỷ lệ mẫu tạo mô sẹo và hình thái mô sẹo được ghi nhận ở bảng 3.37, 3.38 và hình 3.48, 3.49.
Bảng 3.37. Tỷ lệ mẫu tạo mô sẹo từ lá dưới ảnh hưởng của 2,4-D, KN, NAA
Nghiệm thức
Nồng độ (mg/l) % tạo sẹo từ
lá±SD Hình thái Khả năng tăng sinh KN 2,4-D NAA
L1
0,1
0,1 0,1 90,00 ± 10,00a Màu vàng, đỏ hơi xốp Ít tăng sinh L2 0,2 0,1 82,14 ± 17,86a Màu vàng, xốp Tăng sinh nhanh L3 0,1 0,2 78,89 ± 1,11a Màu vàng, hơi xốp Ít tăng sinh L4 0,2 0,2 76,62 ± 11,62a Màu vàng, đỏ hơi xốp Ít tăng sinh L5
0,2
0,1 0,1 86,84 ± 13,16a Màu vàng, hơi xốp ít tăng sinh L6 0,2 0,1 85,64 ± 3,83a Màu vàng, xanh, xốp Tăng sinh nhanh L7 0,1 0,2 86,70 ± 7,75a Màu vàng, bán rắn Ít tăng sinh L8 0,2 0,2 95,65 ± 4,35a sẹo vàng, hơi đỏ Ít tăng sinh L9
0,3
0,1 0,1 90,55 ± 3,89a Màu đỏ Ít tăng sinh L10 0,2 0,1 91,96 ± 2,48a Màu vàng nhạt Ít tăng sinh L11 0,1 0,2 88,56 ± 0,32a Màu vàng nhạt Ít tăng sinh L12 0,2 0,2 76,39 ± 1,39a Màu vàng, rắn Ít tăng sinh L13
0,4
0,1 0,1 84,23 ± 3,27a Màu trắng nhạt Ít tăng sinh L14 0,2 0,1 78,90 ± 9,34a Màu vàng nhạt, bán rắn Ít tăng sinh L15 0,1 0,2 76,24 ± 0,23a Vàng xanh, bán rắn Tăng sinh nhanh L16 0,2 0,2 80,38 ± 2,96a Màu vàng xốp Tăng sinh nhanh Các số trung bình trong cột với các mẫu tự khác nhau thì khác biệt nhau, sự khác biệt có ý nghĩa ở mức p=0,05
Lu
Cá p=
H
uận án Tiế Bảng 3.3
Nghiệm thức K
R1 R2 0, R3 R4 R5 R6 0, R7 R8 R9 R10 0, R11 R12 R13 R14 0, R15 R16 ác số trung b
=0,05
Hình 3.48.
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
tỷ lệ mẫu tạo mô sẹo (%)
ến sĩ Sinh h 38. Tỷ lệ m
Nồng độ (m KN 2,4-D
,1 0,1 0,2 0,1 0,2
,2 0,1 0,2 0,1 0,2
,3 0,1 0,2 0,1 0,2
,4 0,1 0,2 0,1 0,2 ình trong cột
Biểu đồ th
1 2
học
mẫu tạo mô
mg/l) Tỷ NAA s
0,1 63 0,1 81 0,2 85 0,2 87 0,1 88 0,1 82 0,2 100 0,2 39 0,1 52 0,1 95 0,2 59 0,2 39 0,1 90 0,1 76 0,2 69 0,2 51 t với các mẫu
hể hiện tỷ l
3 4 5
Mô s
ô sẹo từ rễ
ỷ lệ % mẫu tạ sẹo từ rễ±SD 3,25 ± 0,75bcd 1,11 ± 8,89def 5,62 ± 4,85efg 7,30 ± 1,59efg 8,46 ± 0,00efg 2,78 ± 6,11def 0,00 ± 0,00g
9,42 ± 14,42a 2,61 ± 12,61ab 5,83 ± 4,17a 9,10 ± 2,44ab 9,88 ± 6,55a 0,00 ± 10,00e 6,84 ± 4,11bc 9,57 ± 0,00bc 1,64 ± 3,36ab u tự khác nhau
ệ mẫu tạo
6 7
Ng
sẹo từ lá
dưới ảnh h
ạo H
d Màu đỏ fg Màu và g Màu vàn g Màu đỏ g Màu vàn fg Màu và
Màu đỏ Màu vàn b Màu đỏ Màu đỏ bc Màu và
Màu đỏ fg Màu đỏ de Màu vàn cde Màu đỏ
Màu vàn u thì khác biệ
mô sẹo dư
8 9 10 hiệm thức
Mô sẹo t
hưởng của 2
Hình thái
, rắn àng, bán rắn
ng đỏ, rắn , rắn ng, bán rắn àng nhạt, xốp
, bán rắn ng đỏ, rắn , rắn , rắn àng, bán rắn
, rắn , rắn ng, bán rắn ỏ, bán rắn
ng đỏ, rắn ệt nhau, sự kh
ưới ảnh hưở
11 12
từ rễ
2,4-D, KN
Khả năng
Ít tăng sin Tiếp tục t Ít tăng sin Ít tăng sin Ít tăng sin p Tiếp tục t Ít tăng sin Ít tăng sin Ít tăng sin Ít tăng sin Tiếp tục t Ít tăng sin Ít tăng sin Ít tăng sin Tiếp tục t Ít tăng sin hác biệt có ý
ởng của 2,4
13 14 15
Trang 128 N, NAA
g tăng sinh
h tăng sinh
h h h tăng sinh
h h h h tăng sinh
h h h tăng sinh
h
nghĩa ở mức
4-D, NAA,
16
8
c
KN
Luận án Tiến sĩ Sinh học Trang 129
C15, rễ
C9, lá
C7, rễ
Hình 3.49. Hình thái mô sẹo dưới tác động kết hợp của 3 loại hormone
2,4-D, NAA, KN
L16 L7: tỉ lệ tạo mô sẹo cao
nhưng không tăng sinh L9: tỉ lệ tạo mô sẹo cao nhưng không tăng sinh
R2 R6 R11
R15 R7: tỉ lệ tạo mô sẹo cao
nhưng không tăng sinh R14: tỉ lệ tạo mô sẹo cao nhưng không tăng sinh
Luận án Tiến sĩ Sinh học Trang 130 Kết quả sau khi thống kê cho thấy hầu hết các nghiệm thức đều tạo sẹo với tỷ lệ cao
(>75%) ngoại trừ các nghiệm thức R1, R8, R9, R11, R12, R15, R16 (<75%). Giữa các nghiệm thức cho tỷ lệ mẫu tạo mô sẹo >75%, tỷ lệ mẫu tạo sẹo ít có sự khác biệt về mặt thống kê. Do đó, ngoài chỉ tiêu tỷ lệ mẫu tạo sẹo để loại các nghiệm thức cho tỷ lệ thấp, chúng tôi còn dựa vào khả năng tăng sinh (trạng thái tơi xốp và tăng trưởng) của mô sẹo để lựa chọn nghiệm thức thích hợp. Sự kết hợp cả 3 loại hormone 2,4-D, KN và NAA cho tỷ lệ mẫu tạo mô sẹo cao nhưng các mô sẹo tạo thành đều ít tăng sinh, chỉ có những mô sẹo ở nghiệm thức L2, L6, L15, L16 và R2, R6 tiếp tục tăng sinh. Trong khi đó, nghiệm thức L6 và R6 (0,2mg/l 2,4-D; 0,2mg/l NAA và 0,1mg/l KN ở lá và rễ) có tỷ lệ tạo mô sẹo cao nhất trong số các nghiệm thức có khả năng tạo mô sẹo xốp và có khả năng tăng sinh nhanh.
Từ 3 thí nghiệm tạo mô sẹo, cả 3 chất điều hòa tăng trưởng thực vật (2,4-D, NAA, KN) đều cho thấy là thành phần cần thiết trong sự hình thành mô sẹo từ lớp mỏng tế bào D. burmanii. Thiếu 1 trong 3 chất (2,4-D, NAA, KN), mô sẹo ít tăng sinh hơn và hình thái không thích hợp cho nuôi cấy dịch huyền phù tế bào. Trong loạt thí nghiệm đã thiết kế, nồng độ hormone tối ưu để cảm ứng tạo mô sẹo từ mô lá và rễ là 0,2mg/l 2,4-D; 0,2mg/l NAA và 0,1mg/l KN.
3.4.1.4 Tạo dịch huyền phù tế bào từ mô sẹo
20-30 mẫu mô sẹo tạo thành được chuyển vào một erlen có thể tích 125ml chứa 15ml môi trường lỏng có cùng thành phần với môi trường tạo sẹo trước đó, erlen được đặt trong điều kiện nuôi chiếu sáng trong 16 giờ/ngày với cường độ chiếu sáng là 2800 ± 200 lux, nhiệt độ phòng nuôi cấy khoảng 22-250C và ẩm độ trung bình là 70% trên máy lắc 125 vòng/phút. Sau 1 tuần, dịch huyền phù tế bào được tạo thành từ mô sẹo lá và rễ đều có dấu hiệu tăng trưởng, các tế bào quan sát dưới kính hiển vi đa số đều có nhân to, hạt tinh bột mịn (hình 3.50)
Luận án Tiến sĩ Sinh học Trang 131 Hình 3.50. Dịch huyền phù tế bào được tạo thành từ mô sẹo
A: dịch huyền phù tế bào tạo thành từ mô sẹo lá B: dịch huyền phù tế bào tạo thành từ mô sẹo rễ 1: mô sẹo được chuyển vào môi trường lỏng 2: dịch huyền phù tế bào sau khi được cấy chuyền
3: tế bào dịch treo dưới kính hiển vi với độ phòng đại 10x
A1 B1
A2 B2
A3 B3
Luận án Tiến sĩ Sinh học Trang 132 3.4.1.5 Thử nghiệm tạo dịch huyền phù tế bào được tạo thành trực tiếp từ lớp
mỏng tế bào
20-30 mẫu lớp mỏng tế bào được nuôi lỏng lắc trong một erlen có thể tích 125ml chứa 15ml môi trường có cùng thành phần với môi trường nuôi dịch huyền phù tế bào của mô sẹo trước đó, erlen được đặt trong điều kiện nuôi chiếu sáng trong 16 giờ/ngày với cường độ chiếu sáng là 2800 ± 200 lux, nhiệt độ phòng nuôi cấy khoảng 22-250C và ẩm độ trung bình là 70% trên máy lắc 125 vòng/phút. Sau 2 tuần, chúng tôi nhận thấy dịch huyền phù tế bào được tạo thành trực tiếp từ lớp mỏng tế bào có chứa nhiều cụm tế bào không nhân và hạt tinh bột lớn và một ít cụm tế bào có nhân to, hạt tinh bột mịn (hình 3.51).
3.4.1.6 Kiểm tra khả năng sống của tế bào trong các dịch huyền phù tế bào tạo thành bằng phương pháp nhuộm TTC
Kết quả cho thấy dịch huyền phù tế bào D. burmanii được tạo thành từ cả hai phương pháp thông qua mô sẹo và trực tiếp từ lớp mỏng tế bào đều có chứa những tế bào bắt màu hồng khi được nhuộm TTC (hình 3.52). Mặc dù tại thời điểm khảo sát khả năng sống chết của tế bào, mật độ tế bào trong dịch huyền phù tế bào được tạo ra trực tiếp từ lớp mỏng tế bào còn ít hơn so với dịch huyền phù tế bào tạo thành từ mô sẹo, nhưng kết quả đã cho thấy có thể tăng sinh tế bào trực tiếp từ vết thương của lớp mỏng tế bào trong môi trường lỏng lắc mà không cần qua giai đoạn tạo mô
Hình 3.51. Dịch huyền phù tế bào được tạo thành trực tiếp từ lớp mỏng tế bào A: dịch huyền phù tế bào khi được cấy chuyền sang môi trường mới B: cụm tế bào dịch treo 7 ngày tuổi không nhân, tinh bột lớn
ế ổ
A B C
Luận án Tiến sĩ Sinh học Trang 133 sẹo trên môi trường rắn. Ngay thời điểm hiện tại, chúng tôi chưa tìm thấy tài liệu
nào nghiên cứu nuôi cấy dịch huyền phù tế bào trực tiếp từ lớp mỏng tế bào. Song, nhóm chúng tôi đã tiến hành thử nghiệm trên 3 đối tượng khác ngoài D. burmanii:
Nhàu (Monrinda citrifolia L.), Mãn Đình Hồng (Althaea rosea L.) và Hòe (Sophora japonica L.), cả ba đều cho thấy được khả năng tăng sinh của tế bào khi được tách rời trực tiếp từ lớp mỏng tế bào trong môi trường lỏng lắc. Điều này có thể được giải thích bằng khả năng cảm ứng tế bào phân chia trong mẫu lớp mỏng tế bào: dịch huyền phù tế bào thường được nuôi cấy từ mô sẹo, một cụm tế bào chưa phân hóa và có khả năng phân chia mạnh là nhờ vào sự tương tác của các tế bào lân cận nhau, do đó nếu nuôi huyền phù với mật độ tế bào ban đầu thấp người ta thường phải cảm ứng sự phân chia tế bào bằng “tế bào nuôi”, chất biến dưỡng phóng thích từ tế bào nuôi làm thay đổi thành phần môi trường đủ để kích thích sự phân chia tế bào [106];
với dịch huyền phù được nuôi trực tiếp từ lớp mỏng tế bào, tế bào vẫn có khả năng phân chia được phải chăng là nhờ trạng thái dễ dàng bị cảm ứng phân chia của lớp mỏng tế bào?? Tuy còn nhiều nghi vấn cần được đào sâu nghiên cứu nhưng kết quả thực sự đã mở ra hướng đi khả quan hơn cho việc nuôi cấy dịch huyền phù tế bào của thực vật, nhất là đối với những loài khó cảm ứng tạo mô sẹo trên môi trường rắn như D. burmanii.
Hình 3.52. Tế bào D. burmanii bắt màu hồng khi nhuộm TTC – A: tế bào trong dịch huyền phù từ mô sẹo; B: tế bào trong dịch huyền phù từ lớp mỏng tế bào.
A B
Luận án Tiến sĩ Sinh học Trang 134 3.4.1.7 Lựa chọn dịch huyền phù tế bào được tạo thành từ loại mô có khả năng tích
lũy hoạt chất cao hơn làm nguồn vật liệu đầu cho các thí nghiệm tăng sinh Mô lá, mô rễ thu hoạch từ cùng các cá thể cây in vitro có độ tuổi khoảng 8-10 tuần nuôi cấy được đem xác định hàm lượng plumbagin bằng phương pháp HPLC. Kết quả được trình bày trong bảng 3.39.
Bảng 3.39. Hàm lượng plumbagin tích lũy trong các loại mô khác nhau
Tên mẫu phân tích Hàm lượng plumbagin (mg/kg sinh khối tươi)
Mô lá 152,62
Mô rễ 458,18
Số liệu được trích từ bảng kết quả phân tích của Phòng Phân Tích trung tâm. Trường ĐHKHTN. TP.HCM có đính kèm sắc ký đồ ở phụ lục 2.10
Kết quả đã chứng minh được đối với D. burmani nuôi cấy in vitro, sự tích lũy plumbagin trong rễ cao hơn gấp 3 lần so với trong lá. Đồng thời, kết quá định lượng cho phép chọn dịch huyền phù tế bào được tạo thành từ mô rễ (theo phương pháp trực tiếp hay gián tiếp thông qua mô sẹo) làm nguồn vật liệu đầu cho các thí nghiệm tăng năng suất thu nhận plumbagin ở bước tiếp theo.
3.4.2 Ứng dụng một số kỹ thuật tăng năng suất thu nhận hoạt chất lên hệ thống nuôi cấy dịch huyền phù tế bào
3.4.2.1 Khảo sát đường cong tăng trưởng của dịch huyền phù tế bào có mật độ tế bào nuôi ban đầu khác nhau
Kết quả xác định mật độ tế bào có trong 1ml dịch huyền phù tế bào rễ D. burmanii ở các nghiệm thức có mật độ tế bào nuôi ban đầu khác nhau theo thời gian (cứ 4 ngày/ 1 lần) được trình bày trong bảng 3.40 và hình 3.53.
Luận án Tiến sĩ Sinh học Trang 135 Bảng 3.40. Ảnh hưởng của mật độ tế bào nuôi cấy ban đầu đến thời gian tăng
trưởng của dịch huyền phù tế bào rễ Drosera
Ngày Mật độ tế bào (tế bàox104/ ml) ±SD
(5:40) (10:40) (15:40) (20:40) (25:40)
0 2,17±0,144a 2,50 ±0,000a 2,60±0,433a 3,17 ±0,144a 3,83±0,144a 4 2,58±0,804a 2,42 ±0,144a 3,58 ±1,233a 8,58±0,144c* 13,58±0,520c*
8 9,08 ±1,528c 11,33± 0,144c* 14,92±3,146c* 16,33±0,144e* 14,58±0,144c*
12 13,42±0,382d* 20,33±0,144d* 22,67±0,382d* 14,83±0,287d* ,50±0,750b*
16 52,60 ±0,433b* 9,75±3,250b* 11,58±0,144b* 6,25±0,433b* 4,00 ±0,661a Các số trung bình trong cột với các mẫu tự khác nhau thì khác biệt nhau, * chỉ sự khác biệt giữa các nghiệm thức với đối chứng, sự khác biệt có ý nghĩa ở mức p=0,05
Kết quả cho thấy đường cong tăng trưởng của tế bào rễ D. burmanii thay đổi khi mật độ tế bào nuôi cấy ban đầu khác nhau. Mật độ tế bào nuôi cấy ban đầu thấp như (5:40), (10:40), (15:40) sẽ kéo dài pha tiềm tàng và pha tăng trưởng hơn so với mật độ tế bào ban đầu cao như (20:40) và (25:40). Trong đó, với mật độ tế bào nuôi cấy ban đầu là (15:40), sự tăng trưởng của tế bào đạt đến mức cao nhất, với số tế bào ban đầu là 2,6×104 tế bào/ml sẽ tăng lên 22,7×104 tế bào/ml sau 12 ngày (tốc độ tăng trưởng trung bỡnh à=7,66ì10-3hr-1). Chu kỳ tăng trưởng của tế bào thay đổi như sau: số lượng tế bào gần như giữ nguyên trong 4 ngày đầu nuôi cấy; sau đó tăng trưởng lũy thừa trong khoảng thời gian từ 4-8 ngày, từ 8-12 ngày, tế bào tiếp tục tăng trưởng nhưng tốc độ tăng trưởng giảm dần, số lượng tế bào tạo thành đạt cực đại ở ngày thứ 12, và tế bào đi vào pha ổn định từ ngày thứ 12.
Hình 3.53. Đường cong tăng trưởng của các dịch huyền phù tế bào D. burmanii có mật độ tế bào ban đầu khác nhau
0 5 10 15 20 25
0 4 8 12 16
số tế bào×104/ ml
5_40 10_40 15_40 20_40 25_40
Luận án Tiến sĩ Sinh học Trang 136 Kết quả cho phép xác định được trong chu kỳ tăng trưởng của tế bào rễ D.
burmanii, số lượng tế bào sẽ đạt cực đại tại thời điểm 12 ngày từ khi cấy chuyền huyền phù vào môi trường mới với mật độ tế bào ban đầu khoảng 2,6×104 tế bào/ml. Do đó, để chọn thời điểm khảo sát sự tích lũy hoạt chất trong tế bào D.
burmanii, chúng tôi chọn khoảng thời gian nuôi cấy đủ để quá trình biến dưỡng thứ cấp của tế bào đã xảy ra là 12 ngày từ khi bắt đầu cấy chuyền huyền phù vào môi trường mới; và thời điểm cảm ứng tăng tích lũy hợp chất thích hợp nhất là trong khoảng 8-12 ngày.
Từ thí nghiệm này trở đi, trừ các yếu tố được khảo sát, các yếu tố khác được cố định và giữ nguyên theo điều kiện nuôi cấy như sau: môi trường nuôi cấy lỏng có thành phần khoáng Gamborg’ B5, bổ sung đường sucrose (20g/l), PVP (1g/l), casein hydrosylate (100 mg/l), chất điều hòa tăng trưởng thực vật (0,2mg/l 2,4-D; 0,2mg/l NAA; 0,1mg/l KN); pH = 5,8 ± 0,1 (được chỉnh bằng NaOH 1N và HCl 1N); chiếu sáng trong 16 giờ/ngày với cường độ chiếu sáng là 2800 ± 200 lux, nhiệt độ phòng nuôi cấy khoảng 22-250C và ẩm độ trung bình là 70%; với mật độ tế bào nuôi cấy ban đầu 2,6×104 tế bào/1ml và thời gian nuôi cấy thích hợp là sau 12 ngày.
Tất cả các thí nghiệm khảo sát việc ứng dụng các kỹ thuật tăng năng suất thu nhận hoạt chất trong dịch huyền phù tế bào ở mục này đều có cùng chỉ tiêu theo dõi là chỉ số tăng trưởng tế bào (được xác định bằng sự thay đổi trọng lượng tươi sinh khối tế bào) và hàm lượng hoạt chất trong nguyên liệu nuôi cấy (được xác định bằng phương pháp phổ tử ngoại UV).
3.4.2.2 Khảo sát điều kiện ánh sáng và tốc độ lắc thích hợp cho sự tăng trưởng và tích lũy hoạt chất
Dịch huyền phù tế bào cấy chuyền lần thứ 4 sau 7 ngày tuổi được pha loãng bằng môi trường nuôi cấy đã cố định để đạt được 50ml dịch huyền phù tế bào có mật độ tế bào nuôi cấy ban đầu là 2,6×104 tế bào/ml ở mỗi nghiệm thức. Đặt các erlen vào các điều kiện chiếu sáng và tốc độ lắc khác nhau.