3.1 Nuôi cấy in vitro hai loài Drosera để tạo nguồn nguyên liệu khởi đầu
3.1.3 Nhân giống bằng tạo chồi bất định từ lớp mỏng tế bào
So với phương pháp nhân giống bằng chồi bên, phương pháp tạo chồi bất định không ổn định và có cơ hội xảy ra biến dị hơn nhưng lại tạo được nhiều chồi hơn [43]. Do vậy, phương pháp này được khảo sát nhằm góp phần làm tăng số lượng nguyên liệu in vitro như mong muốn, hỗ trợ cho phương pháp nhân giống bằng chồi bên khi cần lượng nguyên liệu nhiều trong thời gian ngắn cho những thí nghiệm sàng lọc và thu nhận hoạt chất tiếp theo.
Các bộ phận lóng thân (D. indica), lá, cuống lá, cuống hoa của cây con Drosera nẩy mầm từ hạt sau khoảng 4 tuần nuôi cấy được cô lập và cắt thành những đoạn ngắn (1-2cm) đặt trên môi trường MS rắn bổ sung các thành phần như đã liệt kê ở mục 2.1.1, cùng với nồng độ BA khác nhau (0, 1, 2, 3, 4, 5mg/l). Tuy nhiên, sau 5 tuần nuôi cấy, kết quả cho thấy đường kính thân D. indica quá nhỏ mà bề mặt của lá và thân của hai loài này lại có rất nhiều lông tơ mang tuyến tiết khá dài và dày với giọt
“dew drop” giống như keo trên đầu nên lớp mỏng tế bào lá và lóng thân không có
Luận án Tiến sĩ Sinh học Trang 67
Hình 3.4. Biểu đồ biểu diễn ảnh hưởng của BA lên sự tạo chồi bên của Drosera (trái: D. indica, phải: D. burmanii)
0 2 4 6 8 10 12 14
0 20 40 60 80 100 120
0 1 2 3 4 5
số chồi / mẫu Chiều cao chồi (cm)
tỷ lệ tạo chồi (%)
Nồng độ BA (mg/l)
tỷ lệ tạo chồi (%) số chồi/ mẫu chiều cao chồi (cm)
0 5 10 15 20 25
0 20 40 60 80 100 120
0 1 2 3 4 5
số chồi / mẫu Chiều cao chồi (cm)
tỷ lệ tạo chồi (%)
Nồng độ BA (mg/l)
tỷ lệ tạo chồi (%) số chồi/ mẫu chiều cao chồi (cm)
khả năng tiếp xúc với môi trường nuôi cấy và hầu như không có khả năng tái sinh chồi trực tiếp, chỉ có lớp tế bào ở đoạn ngọn phát hoa là có khả năng tái sinh chồi bất định dưới tác động của BA trong khoảng nồng độ từ 1 đến 5 (mg/l). Do vậy, việc khảo sát ảnh hưởng của BA (1-5mg/l) lên sự tái sinh chồi bất định chỉ được tiến hành chi tiết trên đoạn ngọn phát hoa. Kết quả khảo sát được trình bày trong bảng 3.2 và hình 3.4, 3.5, 3.6.
Bảng 3.2. Ảnh hưởng của BA (mg/l) lên sự tạo chồi bất định từ phát hoa
Loài Nồng độ BA (mg/l)
Tỷ lệ mẫu tạo chồi (% ± SD)
Số chồi /mẫu (chồi ± SD)
Chiều cao 1 chồi (cm ± SD)
D. indica
0 6,67 ± 11,55a 0,33 ± 0,58a 0,60 ± 1,04a 1 86,67 ± 11,55b* 11,55 ± 1,78e* 1,57 ± 0,16b 2 86,67 ± 11,55b* 5,22 ± 0,80d* 1,54 ± 0,03b 3 86,67 ± 23,09b* 3,62 ± 0,80cd* 1,22 ± 0,17ab 4 66,67 ± 11,55b* 2,28 ± 0,67bc 1,20 ± 0,08ab 5 60,00 ± 20,00b* 1,56 ± 0,51ab 0,98 ± 0,11ab
D. burmanii
0 13,33 ± 11,55a 0,67 ± 0,58a 0,90 ± 0,78a 1 86,67 ± 11,55c* 5,90 ± 0,26c* 0,78 ± 0,04a 2 93,33 ± 11,55c* 20,08 ± 1,32e* 0,60 ± 0,05a 3 93,33 ± 11,55c* 15,47 ± 0,42d* 0,58 ± 0,02 a 4 86,67 ± 11,55c* 3,52 ± 0,66b* 0,58 ± 0,05 a 5 55,00 ± 11,55b* 1,67 ± 0,38a 0,53 ± 0,03a
Các số trung bình trong cột với các mẫu tự khác nhau thì khác biệt nhau, * chỉ sự khác biệt giữa các nghiệm thức với đối chứng, sự khác biệt có ý nghĩa ở mức p=0,05
Luận án Tiến sĩ Sinh học Trang 68 Hình 3.5. Sự tái sinh chồi bất định từ ngọn phát hoa D. indica sau 5 ngày
A. mẫu được nhìn bằng mắt thường – B. mẫu được nhìn qua kính lúp – C. mẫu được cắt dọc, nhuộm 2 màu và nhìn dưới kính hiển vi 10X
Hình 3.6. Sự tái sinh chồi bất định từ ngọn phát hoa D. burmanii
A. Sau 1 tuần – B. sau 2 tuần – C. sau 3 tuần – D. sau 4 tuần – E. sau 6 tuần
Luận án Tiến sĩ Sinh học Trang 69 Kết quả cho thấy nồng độ BA (1 mg/l) là nồng độ thích hợp để tạo chồi bất định từ
lớp tế bào của đoạn ngọn phát hoa D. indica, và BA (2mg/l) là nồng độ thích hợp để tạo chồi bất định từ lớp tế bào của đoạn ngọn phát hoa D. burmanii.
Như đã đề cập, việc tạo chồi bất định từ ngọn phát hoa giữ vai trò hỗ trợ cho phương pháp nhân giống bằng chồi bên để tạo nguồn nguyên liệu in vitro. Tuy nhiên, kết quả này được xem là 1 thành công trong việc nhân nhanh giống cho Drosera, đặc biệt ở D. burmanii (phát hoa có thể khởi tạo cụm chồi trong cùng điều kiện như đốt thân nhưng cho số lượng chồi cao hơn gấp đôi so với đốt thân). Vì đối với cây D. burmanii Vahl, việc tạo chồi từ phát hoa cho nhiều lợi điểm hơn so với tạo chồi từ đốt thân: cá thể có 1 đốt thân rất ngắn nhưng có thể có từ 2-4 phát hoa dài; khi phát hoa được cắt đi, lập tức phát hoa khác sẽ được tái sinh và nếu cắt liên tục phát hoa non, cây có thể kéo dài đời sống hơn bình thường.