3.3 Khảo sát việc ứng dụng một số kỹ thuật làm tăng năng suất thu nhận hoạt chất lên hệ thống nuôi cấy cây con tái sinh
3.3.5 Khảo sát tác động của việc sử dụng chất cảm ứng (elicitor) lên sự tăng trưởng và tích lũy hoạt chất
trưởng và tích lũy hoạt chất
3.3.5.1 Khảo sát ảnh hưởng của việc sử dụng acid salicylic
Kết quả thu nhận sau khoảng thời gian cảm ứng ở mỗi nghiệm thức được trình bày trong bảng 3.29 và hình 3.39.
Bảng 3.29. Ảnh hưởng của acid salicylic lên sự tăng trưởng và sự tích lũy plumbagin của cây con
Thời gian cảm ứng (ngày)
Nồng độ Salicylic (mg/l)
Nghiệm thức
Khối lượng cây tươi (g±SD)
Hàm lượng plumbagin (mg/g lượng cây tươi±SD)
5
0 5-0 2,789 ± 0,036de 0,251 ± 0,010c 0,5 5-0,5 2,790 ± 0,007de 0,241 ± 0,024bc 1 5-1 2,791 ±0,079de 0,261 ± 0,001cd 1,5 5-1,5 2,851 ± 0,025def 0,325 ± 0,005fgh 2 5-2 2,864 ± 0,004def 0,366 ± 0,005hij
10
0 10-0 2,798 ± 0,035de 0,282 ± 0,021cde 0,5 10-0,5 2,816 ± 0,044de 0,296 ± 0,024defg 1 10-1 2,824 ± 0,083de 0,397 ± 0,017j* 1,5 10-1,5 2,851 ± 0,057def 0,366 ± 0,004hij* 2 10-2 2,596 ± 0,069c 0,356 ± 0,003j*
15
0 15-0 2,912 ± 0,049ef 0,293 ± 0,023def 0,5 15-0,5 2,898 ± 0,064def 0,299 ± 0,026defg 1 15-1 2,865 ±0,030def 0,505 ± 0,006k* 1,5 15-1,5 2,743 ± 0,198d 0,374 ± 0,009ij* 2 15-2 2,589 ± 0,013c* 0,336 ± 0,030ghi*
20
0 20-0 3,005 ± 0,013f 0,307 ± 0,046efg 0,5 20-0,5 2,894 ± 0,025def 0,246 ± 0,003bc 1 20-1 2,848 ±0,070def 0,208 ± 0,007ab 1,5 20-1,5 2,302 ± 0,100b* 0,175 ± 0,0070a* 2 20-2 2,145 ± 0,032a* 0,173 ± 0,001a*
Các số trung bình trong cột với các mẫu tự khác nhau thì khác biệt nhau, * chỉ sự khác biệt giữa các nghiệm thức với đối chứng, sự khác biệt có ý nghĩa ở mức p=0,05
Số liệu được trích từ file phụ lục “Salicylic.exe”
Luận án Tiến sĩ Sinh học Trang 114 Xét về sự tăng trưởng của cây con thể hiện qua khối lượng cây tươi, kết quả ở hình
3.39 cho thấy: acid salicylic (0→1mg/l) chưa có biểu hiện rõ rệt sự ức chế tăng trưởng của cây trong tất cả các khoảng thời gian cảm ứng đã khảo sát (5-20 ngày).
Ở nồng độ 1,5mg/l, acid salicylic có dấu hiệu ức chế cây con tăng trưởng sau 15 ngày cảm ứng và ở nồng độ 2mg/l, salicylic có khả năng ức chế sự tăng trưởng của cây con sau 10 ngày cảm ứng. Trong đó, acid salicylic gây ức chế sự tăng trưởng Hình 3.39. Biểu đồ thể hiện ảnh hưởng của salicylic acid lên khả năng tăng trưởng
và sự tich lũy plumbagin
0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6
0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5
Hàm lượng Plumbagin (mg/g)
Khối lượng sinh khối tươi (g)
A B
Hình 3.40. Đồ thị thể hiện ảnh hưởng của thời gian cảm ứng và nồng độ cảm ứng của salicylic acid đến sự tích lũy plumbagin trong cây con D. burmanii
0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6
0 0,5 1 1,5 2 2,5
Hàm lượng plumbagin (mg/g khối lượng cây tươi)
Nồng độ salicylic acid (mg/l)
5 ngày 10 ngày 15 ngày 20 ngày
0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6
0 5 10 15 20 25
Hàm lượng plumbagin (mg/g khối lượng cây tươi)
Thời gian cảm ứng (ngày)
0 0.5 1 1.5 2
Luận án Tiến sĩ Sinh học Trang 115 của cây con mạnh nhất ở nồng độ 2mg/l trong 20 ngày cảm ứng, với tỷ lệ ức chế là
28,6%.
Xét về hàm lượng plumbagin tích lũy/1g khối lượng cây tươi, kết quả cho thấy:
− Ảnh hưởng của thời gian cảm ứng đến khả năng tích lũy plumbagin như sau (hình 3.40A): thời gian cảm ứng salicylic dài 20 ngày gây ức chế sinh tổng hợp plumbagin ở tất cả các nồng độ khảo sát. Trong khi đó, thời gian cảm ứng acid salicylic dài 5→15 ngày đều biểu hiện sự tăng tích lũy plumbagin ở tất cả các nồng độ khảo sát so với đối chứng. Đặc biệt khi cảm ứng 5 ngày, nồng độ 2mg/l acid salicylic vẫn chưa có dấu hiệu giảm tăng sinh plumbagin. Do đó, khi cảm ứng acid salicylic lên cây con D. burmanii, khoảng thời gian cảm ứng thích hợp là từ 5-15 ngày; trong đó, nếu chọn khoảng thời gian cảm ứng 5 ngày, chúng ta có thể sử dụng nồng độ salicylic cao hơn 2mg/l.
− Ảnh hưởng của nồng độ acid salicylic đến khả năng tích lũy plumbagin như sau (hình 3.40B): ở nồng độ 0,5mg/l, acid salicylic chưa có biểu hiện cảm ứng tăng tích lũy plumbagin so với đối chứng ở tất cả các khoảng thời gian cảm ứng. Ở nồng độ 2mg/l, acid salicylic gây ức chế sự tích lũy plumbagin so với đối chứng khi thời gian cảm ứng tăng dần. Chỉ có ở nồng độ 1 và 1,5mg/l; acid salicylic biểu hiện được khả năng gây tăng tích lũy plumbagin cao hơn so với đối chứng trong khoảng thời gian cảm ứng từ 5 đến 15 ngày; trong đó, nồng độ 1mg/l là tối ưu hơn.
Tóm lại, để tăng tích lũy plumbagin trong hệ thống nuôi cấy cây con D. burmanii, trong loạt nghiệm thức đã thiết kế, việc sử dụng acid salicylic ở nồng độ 1mg/l và cảm ứng trong 15 ngày là tối ưu nhất khi có thể làm tăng hàm lượng lên gấp 1,72 lần so với đối chứng không bổ sung. Tương tự với kết quả này, acid salicylic cũng từng được công bố có khả năng cảm ứng tăng sinh 7-methyljuglone ở cây D.
capensis lên gấp 2,1 lần so với đối chứng [118]. Kết quả cũng đã chứng minh được hiệu quả truyền tín hiệu cảm ứng gen kháng ở thực vật của acid salicylic trong sự hoạt hóa sinh tổng hợp hợp chất thứ cấp.
Luận án Tiến sĩ Sinh học Trang 116 Ngoài ra, để khảo sát sự tăng tích lũy plumbagin dưới tác động của acid salicylic ở
các bộ phận khác nhau, thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của acid salicylic ở các nồng độ (0; 0,5; 1; 2,5; 3,5mg/l) trong khoảng thời gian cảm ứng là 15 ngày cũng đã được tiến hành thêm trên từng bộ phận thân và rễ riêng rẽ, tuy nhiên trên dòng D.burmanii khác. Với số lượng bình nuôi cấy cho 1 nghiệm thức là 3 bình để có đủ số lượng nguyên liệu phân tích thành hai bộ phận lá và rễ riêng lẽ. Kết quả ghi nhận được trình bày trong bảng 3.30.
Bảng 3.30. Ảnh hưởng của acid salicylic lên sự tích lũy plumbagin ở hai bộ phận rễ và lá D. burmanii
Nồng độ Salicylic (mg/l) Hàm lượng plumbagin (mg/g khối lượng tươi±SD) Lá Rễ
0 0,685 0,01 1,285 0,07
0,5 0,540 0,04 1,410 0,10
1 1,700 0,42 0,940 0,14
2,5 1,765 0,60 0,305 0,11 3,5 1,270 0,01 0,120 0,03
Kết quả ở bảng 3.30 được ghi nhận từ một dòng cây khác hẳn dòng cây được ghi nhận ở bảng 3.29 nên cho hàm lượng plumbagin cao hơn rất nhiều, tuy nhiên sự trùng khớp về tác động cảm ứng của salicylic ở các nồng độ khác nhau lên cây ở bảng 3.30 và bảng 3.29 cho phép chúng ta có thể sử dụng số liệu này nhằm suy luận tác động của salicylic ở các bộ phận khác nhau: trong rễ, sự gia tăng hàm lượng plumbagin do salicylic cảm ứng xảy ra nhanh hơn so với trong lá (chỉ cần 0,5mg/l acid salicylic đã có thể cảm ứng plumbagin trong rễ tăng lên gấp 1,09 lần so với đối chứng, trong khi trong lá chỉ tăng 0,78 lần so với đối chứng). Tuy nhiên, sự gia tăng này ở rễ lại kết thúc nhanh hơn ở lá (1mg/l acid salicylic vẫn còn khả năng cảm ứng plumbagin trong lá tăng lên 2,48 lần so với đối chứng, trong khi đã ức chế sự tích lũy plumbagin trong rễ). Phải chăng đó là do các tế bào rễ D. burmanii là nơi tích lũy plumbagin nhiều hơn (ở mẫu đối chứng, plumbagin ở rễ cao hơn so với lá) và khi bị cảm ứng đề kháng, hợp chất ở rễ sẽ được huy động sớm hơn cả. Bên cạnh đó, tế bào rễ D. burmanii là nơi tiếp cận trực tiếp với tác nhân cảm ứng nên nhanh chóng chịu tác động gây ức chế tăng trưởng của acid salicylic hơn so với tế bào lá.
Luận án Tiến sĩ Sinh học Trang 117 3.3.5.2 Khảo sát ảnh hưởng của việc sử dụng cao nấm men
Kết quả thu nhận sau khoảng thời gian cảm ứng ở mỗi nghiệm thức được trình bày trong bảng 3.31 và hình 3.41, 3.42.
Bảng 3.31. Ảnh hưởng của cao nấm men lên sự tăng trưởng và sự tích lũy plumbagin của cây con
Thời gian cảm ứng (ngày)
Nồng độ cao nấm men
(mg/l)
Nghiệm thức
Khối lượng cây tươi (g±SD)
Hàm lượng plumbagin (mg/g lượng cây tươi±SD)
5
0 5-0 2,790 ± 0,036abc 0,249 ± 0,013a 0,5 5-0,5 2,783 ± 0,057abc 0,304 ± 0,023bc 1 5-1 2,761 ± 0,069ab 0,327 ± 0,000bcd* 1,5 5-1,5 2,777 ± 0,071abc 0,341 ± 0,000cde* 2 5-2 2,805 ± 0,026abc 0,367 ± 0,000def*
10
0 10-0 2,798 ± 0,035abc 0,282 ± 0,021ab 0,5 10-0,5 2,738 ± 0,100ab 0,361 ± 0,000de* 1 10-1 2,716 ± 0,118ab 0,376 ± 0,000defg* 1,5 10-1,5 2,688 ± 0,099ab 0,425 ± 0,000gh* 2 10-2 2,671 ± 0,002a 0,416 ± 0,011fgh*
15
0 15-0 2,912 ± 0,050 bc 0,293 ± 0,023abc 0,5 15-0,5 2,774 ± 0,121ab 0,431 ± 0,022h* 1 15-1 2,812 ± 0,226abc 0,569 ± 0,014i* 1,5 15-1,5 2,723 ± 0,175ab 0,430 ± 0,011gh* 2 15-2 2,711 ± 0,168ab 0,432 ± 0,011h*
20
0 20-0 3,005 ± 0,134c 0,307 ± 0,046bc 0,5 20-0,5 2,762 ± 0,010ab 0,682 ± 0,017j* 1 20-1 2,723 ± 0,013ab 0,637 ± 0,016j* 1,5 20-1,5 2,719 ± 0,076ab 0,449 ± 0,049h* 2 20-2 2,683 ± 0,001ab 0,394 ± 0,057efgh*
Các số trung bình trong cột với các mẫu tự khác nhau thì khác biệt nhau, * chỉ sự khác biệt giữa các nghiệm thức với đối chứng, sự khác biệt có ý nghĩa ở mức p=0,05. Số liệu được trích từ file phụ lục “cao nam men.exe”
Hình 3.41. Biểu đồ thể hiện ảnh hưởng của cao nấm men lên sự tăng trưởng và sự tích lũy plumbagin của D.burmanii
0 0,2 0,4 0,6 0,8
2,4 2,5 2,6 2,7 2,8 2,9 3 3,1
5_0 5_0.5 5_1 5_1.5 5_2 10_0 10_0.5 10_1 10_1.5 10_2 15_0 15_0.5 15_1 15_1.5 15_2 20_0 20_0.5 20_1 20_1.5 20_2 Hàm lượng Plumbagin (mg/g)
Khối lượng sinh khối tươi (g) Trọng lượng tươi (g) Hàm lượng Plum (mg/g)
Luận án Tiến sĩ Sinh học Trang 118 Xét về sự tăng trưởng của cây con thể hiện qua khối lượng cây tươi, kết quả ở hình
3.41 cho thấy: cao nấm men có biểu hiện gây ức chế tăng trưởng cây con từ nồng độ 0,5mg/l trong khoảng thới gian 10 ngày cảm ứng trở đi. Trong đó, cao nấm men gây ức chế tăng trưởng mạnh nhất ở nồng độ 2mg/l khi cảm ứng trong 20 ngày, với tỷ lệ gây ức chế là 10,95%.
Xét về hàm lượng plumbagin tích lũy/ 1g khối lượng cây tươi, kết quả cho thấy:
− Ảnh hưởng của thời gian cảm ứng đến khả năng tích lũy plumbagin như sau (hình 3.42A): với các khoảng thời gian cảm ứng đã khảo sát (5 → 20 ngày), cao nấm men đều cảm ứng tăng tích lũy plumbagin trong cây cao hơn so với đối chứng ở tất cả các nồng độ. Trong đó, khi cảm ứng thời gian dài, hàm lượng plumbagin tăng lên đáng kể hơn so với cảm ứng trong thời gian ngắn.
− Ảnh hưởng của nồng độ cao nấm men đến khả năng tích lũy plumbagin như sau (hình 3.42B): Ở nồng độ 0,5→1mg/l, thời gian cảm ứng càng dài, hàm lượng plumbagin được cảm ứng bởi cao nấm men càng cao. Từ nồng độ 1,5; hàm lượng plumbagin đều có dấu hiệu giảm đi khi thời gian cảm ứng dài hơn 15 ngày.
Tóm lại, để cảm ứng tăng tích lũy plumbagin ở D. burmanii, việc sử dụng cao nấm men thích hợp nhất là ở nồng độ 0,5→1mg/l và cảm ứng trong thời gian dài. Cụ thể, trong loạt nghiệm thức đã khảo sát, nồng độ cao nấm men sử dụng thích hợp nhất là 0,5mg/l và thời gian cảm ứng thích hợp nhất là 20 ngày. Với nghiệm thức này, hàm
A B
Hình 3.42. Đồ thị thể hiện ảnh hưởng của thời gian cảm ứng và nồng độ cảm ứng của cao nấm men lên sự tích lũy plumbagin trong cây con D. burmanii
0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8
0 0,5 1 1,5 2 2,5
Hàm lượng plumbagin (mg/g khối lượng cây tươi)
Nồng độ cao nấm men (mg/l)
0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8
0 5 10 15 20 25
Hàm lượng plumbagin (mg/g khối lượng cây tươi)
Thời gian cảm ứng (ngày)
Luận án Tiến sĩ Sinh học Trang 119 lượng plumbagin được cảm ứng bởi cao nấm men có thể tăng lên gấp 1,94 lần so
với đối chứng không bổ sung. Rõ ràng, đối với D. burmanii, nấm men có thể tác động lên tế bào thực vật nhằm mục đích cảm ứng tăng sinh tổng hợp hợp chất thứ cấp một cách hiệu quả. Nhiều nghiên cứu cho rằng cao nấm men có thể tác động bằng các polypeptid hay các peptid ngắn của chúng lên tế bào thực vật như một elicitor [84]. Tuy nhiên, cơ chế tác động của các peptide cho đến nay vẫn chưa được sáng tỏ, các nghiên cứu về vấn đề này vẫn còn đang là mối quan tâm lớn đối với các nhà nghiên cứu về tương tác giữa vi sinh và thực vật.
Cũng như khi khảo sát cảm ứng của acid salicylic, với tác động của cao nấm men, sự tích lũy plumbagin ở hai bộ phận khác nhau của cây (lá, rễ) nhằm khai thác một số khác biệt khi cảm ứng tăng sinh hợp chất giữa các tác nhân có nguồn gốc khác nhau cũng đã được tiến hành khảo sát thêm với dòng cây D. burmanii khác. Thí nghiệm được tiến hành độc lập với các nồng độ cao nấm men khác nhau (0; 0,5; 1;
1,5; 2mg/l) và thời gian cảm ứng được cố định là 20 ngày. Kết quả được trình bày trong bảng 3.32.
Bảng 3.32. Ảnh hưởng của cao nấm men lên sự tích lũy plumbagin ở lá và rễ của D. burmanii
Nồng độ cao nấm men (mg/l) Hàm lượng plumbagin (mg/g khối lượng cây tươi±SD) Lá Rễ
0 0,685 0,01 1,285 0,07
0,5 1,510 0,15 2,850 0,09
1 0,820 0,06 1,985 0,15
1,5 0,690 0,08 2,395 0,36
2 1,325 0,15 1,655 0,16
Kết quả cho thấy có khác biệt về sự tích lũy plumbagin ở các bộ phận (lá và rễ) khi bị cảm ứng bởi cao nấm men so với acid salicylic: khi bị cảm ứng do chất truyền tín hiệu acid salicylic, rễ có dấu hiệu tăng tích lũy hợp chất nhanh hơn lá và cũng nhanh chóng bị ức chế tăng trưởng hơn so với lá; trong khi dưới tác động của các elicitor vi sinh vật như nấm men thì dấu hiệu tăng tích lũy cũng như khả năng tích lũy hợp chất ở rễ và lá là ngang nhau. Phải chăng sự khác biệt này là do quá trình
Luận án Tiến sĩ Sinh học Trang 120 nhận diện của tế bào thực vật với mỗi tác nhân khác nhau: acid salicylic cảm ứng
gen đề kháng theo cả 1 quá trình từ lúc được nhận diện bởi các receptor ở màng tế bào thực vật; trong khi những peptide có nguồn gốc từ vi sinh vật như nấm men lại được cho là xâm nhập trực tiếp vào tế bào và vận chuyển đến những mô ở xa rồi hoạt động như một tín hiệu của chính chúng [15]. Bên cạnh đó, các chất cảm ứng từ vi sinh vật như nấm men được cho là ít độc tính hơn so với các chất cảm ứng hóa học như acid salicylic.