Tạo dịch huyền phù tế bào

2.4 Khảo sát ứng dụng một số kỹ thuật làm tăng năng suất thu nhận hoạt chất lên hệ thống nuôi cấy dịch huyền phù tế bào

2.4.1 Tạo dịch huyền phù tế bào

2.4.1.1 Ảnh hưởng của nền khoáng và nồng độ đường lên khả năng sống của lớp mỏng tế bào

Thí nghiệm được bố trí theo thể thức khối hoàn toàn ngẫu nhiên, thừa số hai nhân tố, với 3 loại nền khoáng cơ bản (MS, MS1/2, GB5) và 4 nồng độ đường sucrose khác nhau (10, 20, 30, 40g/l), tổng cộng gồm 12 nghiệm thức, mỗi nghiệm thức lặp lại 3 lần, mỗi lần lặp lại là 1 đĩa petri với 25ml môi trường bán rắn và 15 mẫu cấy lớp mỏng. Chỉ tiêu theo dõi là tỷ lệ % số mẫu còn xanh và tươi sau 14 ngày mẫu tiếp xúc với môi trường nuôi cấy.

2.4.1.2 Ảnh hưởng của sự kết hợp hai loại hormone tăng trưởng (2,4-D và NAA) lên sự cảm ứng tạo mô sẹo từ lớp mỏng tế bào lá và tế bào rễ Drosera Kết quả thăm dò ảnh hưởng của từng chất điều hòa tăng trưởng thực vật (2,4-D, NAA, IBA) lên lớp mỏng D. burmanii cho thấy các mẫu lớp mỏng đều không cảm ứng với hầu hết các đơn chất này. Do đó, công thức kết hợp hai loại auxin khác

Luận án Tiến sĩ Sinh học Trang 57 nhau đã công bố tạo mô sẹo thành công trên cây cùng chi: (2,4-D: NAA) [50] được

áp dụng.

Thí nghiệm được bố trí theo thể thức khối hoàn toàn ngẫu nhiên, hai thừa số, với 5 nồng độ NAA khác nhau (0; 0,1; 0,2; 0,3; 0,4mg/l) và 5 nồng độ 2,4-D khác nhau (0; 0,1; 0,2; 0,3; 0,4mg/l). Chỉ tiêu theo dõi là tỷ lệ mẫu tạo mô sẹo (%) và hình thái mô sẹo sau 5 tuần nuôi cấy. Các thí nghiệm đều được lặp lại 3 lần, mỗi lần lặp lại là một đĩa petri với 25ml môi trường bán rắn và số mẫu ≤ 25 mẫu/ đĩa cho mỗi loại lớp mỏng tế bào lá và rễ.

2.4.1.3 Ảnh hưởng của sự kết hợp 3 loại hormone tăng trưởng (2,4-D: NAA: KN) lên sự cảm ứng tạo mô sẹo từ lớp mỏng tế bào lá và tế bào rễ Drosera Do tỷ lệ mô sẹo tạo thành từ sự kết hợp hai loại auxin vẫn còn thấp nên chúng tôi đã tiến hành thí nghiệm này nhằm cải thiện khả năng tạo mô sẹo từ lớp mỏng tế bào của Drosera dưới tác động của một tổ hợp 3 loại chất điều hòa tăng trưởng thực vật khác nhau. Thí nghiệm được tiến hành theo thể thức hoàn toàn ngẫu nhiên gồm 4 nồng độ KN khác nhau (0,1; 0,2; 0,3; 0,4mg/l) kết hợp với công thức sử dụng hai auxin thích hợp nhất đã được khảo sát ở mục 2.4.1.2.

2.4.1.4 Tạo dịch huyền phù tế bào từ mô sẹo

20-30 mẫu mô sẹo tạo thành được chuyển vào một erlen có thể tích 125ml chứa 15ml môi trường lỏng có cùng thành phần với môi trường tạo sẹo trước đó, erlen được đặt trong điều kiện nuôi đã nêu ở phần vật liệu, trên máy lắc 125 vòng/phút..

2.4.1.5 Thử nghiệm tạo dịch huyền phù tế bào trực tiếp từ lớp mỏng tế bào

Vì thời gian tạo dịch huyền phù tế bào thông qua mô sẹo quá dài nên chúng tôi đã thử nghiệm nuôi cấy dịch huyền phù tế bào trực tiếp từ lớp mỏng tế bào bằng cách:

nuôi lỏng lắc 20-30 mẫu lớp mỏng tế bào thân và rễ trong một erlen có thể tích 125ml chứa 15ml môi trường có cùng thành phần với môi trường nuôi dịch huyền phù tế bào của mô sẹo trước đó. Erlen được đặt trong điều kiện nuôi đã nêu ở phần vật liệu, trên máy lắc 125 vòng/phút.

Luận án Tiến sĩ Sinh học Trang 58 2.4.1.6 Kiểm tra khả năng sống của tế bào trong các dịch huyền phù tế bào tạo

thành bằng phương pháp nhuộm TTC

Hút 0,5ml dịch huyền phù bằng pipette có đầu hút vô trùng và to đủ để không phá vỡ các cụm tế bào được tạo thành từ mỗi phương pháp nuôi cấy, trộn chung với 0,5ml dung dịch phẩm nhuộm 2,3,5-triphenyltetrazolium chloride (TTC) trong ependolf 1,5ml (dung dịch TTC được tạo thành từ 0,2g TTC trong 10ml dung dịch đệm phosphate pH7,5; giữ tối ở 40C), để yên sau hơn 30 phút rồi quan sát dưới kính hiển vi. Tế bào chết không có màu trong khi tế bào sống có màu hồng do hoạt động hô hấp của tế bào tạo ra những hợp chất có khả năng kết hợp với TTC tạo phức chất formanzan màu hồng [109].

2.4.1.7 Cấy chuyền dịch huyền phù tế bào

Dịch huyền phù chứa tế bào sống được thay môi trường nuôi huyền phù bằng cách để tế bào lắng tự nhiên trong erlen trong 30 phút, loại bỏ môi trường cũ và thay môi trường mới với cùng thể tích. Thay môi trường như thế mỗi tuần 1 lần đến khi sinh khối tế bào tăng lên khoảng gấp đôi sinh khối cũ. Huyền phù sẽ được cấy chuyền vào một erlen vô trùng khác có thể tích 500ml bằng pipette 5ml có đầu hút vô trùng và to đủ để không phá vỡ các cụm tế bào, thêm môi trường mới theo tỷ lệ (1:2). Cấy chuyền như thế mỗi tuần 1 lần, thông thường tế bào huyền phù chỉ sử dụng sau 7-8 lần cấy chuyền.

2.4.1.8 Lựa chọn dịch huyền phù tế bào được tạo thành từ loại mô có khả năng tích lũy hoạt chất cao hơn làm nguồn vật liệu đầu cho các thí nghiệm tăng sinh Mô lá, mô rễ thu hoạch từ cùng các cá thể cây in vitro có độ tuổi 8-10 tuần nuôi cấy được đem xác định hàm lượng plumbagin bằng phương pháp HPLC. Kết quả cho phép lựa chọn được loại mô tích lũy hàm lượng plumbagin cao để tạo dịch huyền phù tế bào làm nguồn vật liệu đầu cho các thí nghiệm tăng sinh hợp chất.

Lu 2.

2.

Th cấ D m gi ph dị cứ ce da 1 th (h hỗ

Đ kh si

uận án Tiế .4.2 Ứng nuôi .4.2.1 Khả bào hí nghiệm ấy tế bào Drosera đư mới cho đến

iảm. Theo hương phá ịch huyền p ứ 4 ngày m ellulase 10 ao động lắc

ô=1mm n hể phủ tràn hình 2.6). S

ỗn hợp đã n

Đồng thời, c hác nhau n inh tế bào.

Hình 2.

ến sĩ Sinh h dụng một cấy dịch h ảo sát đườn o nuôi ban đ được tiến ban đầu t ợc theo dõ n khi số lư dõi và ghi áp đếm tế b phù tế bào một lần: 1m

% + 0,5ml c 100 vòng ngang x 1m n 4 ô này, đ Số tế bào t

nhỏ vào, từ

các dịch hu nhằm khảo Thí nghiệm .5. Buồng đ

học

số kỹ thuậ huyền phù ng cong tă đầu khác n hành kết h thích hợp.

õi tính từ k ượng tế bào nhận thời bào trong b

trên một d ml dịch hu l pectinase g/phút; nhỏ mm dài x 0 đếm số tế trung bình ừ đó xác đị

uyền phù tế sát mật độ m được tiế

đếm tế bào

ật tăng năn tế bào ăng trưởng nhau hợp khảo sá

Đường c khi cấy ch o trong dịc

gian của m buồng đếm diện tích đ uyền phù tế

5%, ngâm ỏ hỗn hợp t 0,1mm sâu

bào có tro h của mỗi ô

ịnh mật độ

ế bào được ộ tế bào nu ến hành the o và quy tắ

ng suất thu

g của dịch

át đường co ong tăng huyền huyề

ch huyền p mỗi pha tro m có khả n ã biết để x ế bào được m trong bể ổ trên vào bu u =0,1mm3 ong mỗi ô t

ô là số tế b tế bào nuô

c nuôi với m uôi cấy ban

eo thể thức c đếm tron

u nhận hoạ

huyền phù

ong tăng tr trưởng của ền phù tế b phù tế bào ong dịch hu năng giữ lư xác định mậ

c trộn với ổn nhiệt 25 uồng đếm g

=10-4ml), theo nguyê bào trung b ôi cấy [109

mật độ tế b n đầu nào th

hoàn toàn ng 1 ô lớn c

ạt chất lên ù tế bào có

rưởng và m a huyền p bào sang m

bắt đầu có uyền phù tế ượng thể tíc ật độ tế bà

hỗn hợp g 50C trong 3

gồm 4 ô lớ sao cho h ên tắc đếm bình có tro 9].

bào nuôi cấ hích hợp c n ngẫu nhiê

có thể tích

Trang 59 n hệ thống

ó mật độ tế

mật độ nuôi phù tế bào môi trường ó dấu hiệu ế bào bằng ch cố định o nuôi cấy gồm 0,5ml 30 phút với ớn (thể tích hỗn hợp có m nhất định ong 10-4ml

ấy ban đầu ho sự tăng ên, với mật

0,1mm3

9 ế

i o g u g h y l i h ó h l

u g t

Luận án Tiến sĩ Sinh học Trang 60 độ tế bào nuôi ban đầu khác nhau (5, 10, 15, 20, 25ml dịch huyền phù tế bào sau 1

tuần tuổi của lần cấy chuyền thứ hai: 40ml dịch môi trường), gồm 5 nghiệm thức khác nhau, mỗi nghiệm thức được lặp lại 3 lần, mỗi lần là một erlen nuôi cấy và được theo dõi đường cong tăng trưởng độc lập.

Từ thí nghiệm này trở đi, trừ các yếu tố được khảo sát, các yếu tố khác được cố định và giữ nguyên theo như trong điều kiện nuôi cấy đã nêu ở mục vật liệu, với mật độ tế bào nuôi cấy ban đầu và thời gian nuôi cấy thích hợp đã xác định ở mục 2.4.2.1.

Tất cả các thí nghiệm khảo sát việc ứng dụng các kỹ thuật tăng năng suất thu nhận hoạt chất trong dịch huyền phù tế bào ở mục này đều có cùng chỉ tiêu theo dõi là chỉ số tăng trưởng tế bào (được xác định bằng sự thay đổi trọng lượng tươi sinh khối tế bào) và hàm lượng hoạt chất trong nguyên liệu nuôi cấy (được xác định bằng phương pháp phổ tử ngoại UV).

2.4.2.2 Khảo sát điều kiện ánh sáng và tốc độ lắc thích hợp cho sự tăng trưởng và tích lũy hoạt chất

Thí nghiệm được tiến hành theo thể thức khối hoàn toàn ngẫu nhiên với 3 tốc độ lắc khác nhau (75, 125, 175vòng/phút) và 2 nghiệm thức ánh sáng khác nhau (chiếu sáng với thời gian 16 giờ/ngày, cường độ chiếu sáng 2800 ± 200lux; và ủ tối hoàn toàn) mỗi nghiệm thức được lặp lại 3 lần, mỗi lần là 3 erlen nuôi cấy độc lập.

2.4.2.3 Khảo sát ảnh hưởng của 2,4-D trong môi trường nuôi cấy dịch huyền phù tế bào lên sự tăng trưởng và tích lũy hoạt chất

Khảo sát ảnh hưởng của 2,4-D lên sự tăng trưởng và phát triển cũng như sự tích lũy hàm lượng hoạt chất của tế bào trong dịch huyền phù trong hai khoảng thời gian đã được xác định ở mục 2.4.2.1:

(1) khi tế bào bắt đầu chuyển sang môi trường mới đến khi tế bào bước vào pha giảm tăng trưởng (sau 8 ngày nuôi cấy),

(2) khi tế bào bắt đầu giảm tăng tưởng đến hết pha ổn định (từ ngày nuôi cấy thứ 8).

Luận án Tiến sĩ Sinh học Trang 61 Thay môi trường nuôi cấy theo cách đã trình bày ở mục 2.4.1.3 khi hết giai đoạn (1)

ở tất cả các nghiệm thức. Thí nghiệm gồm 4 nghiệm thức được bố trí thay đổi việc bổ sung hay không bổ sung 2,4-D theo bảng 2.2 ; mỗi nghiệm thức được lặp lại 3 lần, mỗi lần lặp lại là 3 erlen nuôi cấy độc lập.

Bảng 2.2. Các nghiệm thức được bố trí việc bổ sung hay không bổ sung 2,4-D

Nghiệm thức Giai đoạn (1) Giai đoạn (2) 1 + + 2 + −

3 − +

4 − −

−: không bổ sung 2,4-D; +: bổ sung 2,4-D (2mg/l)

2.4.2.4 Khảo sát tác động của việc bổ sung tiền chất lên sự tăng trưởng và tích lũy hoạt chất

Thí nghiệm được bố trí theo thể thức hoàn toàn ngẫu nhiên, gồm 4 nghiệm thức có nồng độ phenylalanine và tyrosine bổ sung trong môi trường nuôi cấy ban đầu khác nhau: 0; 0,1; 0,3; 0,5mM. Mỗi nghiệm thức được lặp lại 3 lần, mỗi lần lặp lại là 3 erlen nuôi cấy độc lập.

2.4.2.5 Khảo sát tác động của việc sử dụng chất cảm ứng phi sinh học acid salicylic lên sự tăng trưởng và tích lũy hoạt chất

Thí nghiệm được bố trí theo thể thức hoàn toàn ngẫu nhiên, với 5 nồng độ acid salicylic khác nhau (0; 0,5; 1; 1,5; 2mg/l). Thời điểm bổ sung nhân tố cảm ứng được cố định khi tế bào kết thúc pha tăng trưởng mạnh. Thời gian cảm ứng được cố định trong bốn ngày (acid salicylic được bổ sung dưới dạng dung dịch sodium salicylate 1M sau khi lọc qua màng lọc vụ trựng cú đường kớnh 0,2àm). Mỗi nghiệm thức được lặp lại 3 lần, mỗi lần lặp lại là 3 erlen nuôi cấy độc lập.

2.4.2.6 Kiểm chứng hiệu quả làm tăng năng suất thu nhận hoạt chất lên hệ thống nuôi cấy dịch huyền phù tế bào của các kỹ thuật đã khảo sát

Ở mỗi kỹ thuật tăng sinh đã khảo sát, chọn nguyên liệu được tạo thành trong nghiệm thức được xác định là thích hợp nhất cho tăng sinh hoạt chất khi khảo sát