3.1 Nuôi cấy in vitro hai loài Drosera để tạo nguồn nguyên liệu khởi đầu
3.2.3 Sàng lọc và cô lập hợp chất có khả năng ức chế tăng sinh tế bào in vitro
Bảng 3.12. Tỷ lệ (%) ức chế sự tăng sinh dòng tế bào ung thư ruột kết DLD-1 sau khi cảm ứng 48 giờ của cỏc cao chiết (100àg/ml)
Loài Mẫu cảm ứng Ký hiệu I (%)± SD Đối chứng Chứng dương RES 74,799 ± 6,783e
D. indica Cao n-hexan I1 12,773 ± 5,322a*
Cao chloroform I2 76,162 ± 2,240e*
Cao ethyl acetate I3 16,166 ± 5,344ab*
Cao ethanol I4 44,809 ± 8,591d*
D. burmanii Cao n-hexan B1 15,010 ± 4,410ab*
Cao chloroform B2 73,516 ± 2,973e Cao ethyl acetate B3 35,548 ± 7,351c*
Cao ethanol B4 21,531 ± 2,805b*
Các số trung bình trong cột với các mẫu tự khác nhau thì khác biệt nhau, * chỉ sự khác biệt giữa các nghiệm thức với đối chứng, sự khác biệt có ý nghĩa ở mức p=0,05
Luận án Tiến sĩ Sinh học Trang 85 Kết quả cho thấy trong 8 loại cao chiết từ hai loài Drosera nuôi cấy in vitro, chỉ có
2 cao chiết chloroform của hai loài làm giảm sự tăng sinh tế bào DLD-1 trên 50%
và hai loại cao có hoạt tính tương đương nhau (cùng phân hạng trong thống kê), Bên cạnh đó, do hàm lượng cao của D. burmanii cao hơn nên chúng tôi đã chọn cao chloroform D. burmanii để sắc ký cột bằng hệ dung môi gồm chloroform và ether dầu hỏa nhằm cô lập hợp chất có hoạt tính ức chế tăng sinh tế bào.
3.2.3.2 Thu nhận các phân đoạn từ cao chiết chloroform của D. burmanii và sàng lọc các phân đoạn có khả năng ức chế tăng sinh tế bào
a. Sắc ký cột
Cao chloroform của D. burmanii (18,45g) được đem sắc ký cột silica gel với pha động là hệ dung môi chloroform: ether dầu hỏa với độ phân cực tăng dần từ 0%
chloroform đến 100% chloroform trong ether dầu hỏa.
b. Sàng lọc các phân đoạn chứa hợp chất phenolic bằng FeCl3/methanol Kết quả định tính được tổng kết trong bảng 3.13
Kết quả định tính cho thấy trừ phân đoạn 1, 5, 6, 7, các phân đoạn còn lại đều dương tính với thuốc thử phenolic và được chọn để tiến hành quy trình sàng lọc tiếp theo nhằm tầm soát hoạt chất có khả năng ức chế tăng sinh tế bào.
Hình 3.17. Biều đồ thể hiện tỷ lệ% ức chếtăng sinh tếbào DLD-1 của các loại cao chiết
0 20 40 60 80 100
RES I1 I2 I3 I4 B1 B2 B3 B4
Tỷ lệức chế tăng sinh DLD-1 (%)
Luận án Tiến sĩ Sinh học Trang 86 Hình 3.18. Biểu đồ biểu diễn tỷ lệ
(%) ức chế tăng sinh dòng tế bào DLD-1sau khi cảm ứng 48 giờ của
các phân đoạn
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
RES PĐ2 PĐ3 PĐ4 PĐ8
Tỷ lệức chế tăng sinh DLD-1 (%)
Bảng 3.14. Tỷ lệ (%) ức chế sự tăng sinh dòng tế bào ung thư ruột kết DLD-1 sau khi cảm ứng
48 giờ của cỏc phõn đoạn (100àg/ml)
Loài Mẫu Ký hiệu I (%)± SD Đối
chứng
Chứng dương
RES 74,841 ± 5,799b
Phân đoạn
2 PĐ2 51,008 ± 4,054a*
3 PĐ3 86,640 ± 2,415c*
4 PĐ4 45,119 ± 8,594a*
8 PĐ8 49,973 ± 7,616a*
Các sốtrung bình trong cột với các mẫu tự khác nhau thì khác biệt nhau, * chỉ sự khác biệt giữa các nghiệm thức với đối chứng, sự khác biệt có ý nghĩa ở mức p=0,05
Bảng 3.13. Kết quả sắc ký cột silica gel trên cao chloroform của D. burmanii
Phân đoạn
Số thứ tự lọ (100ml/lọ)
Lượng cao (g)
Dung môi giải ly
Sắc ký lớp mỏng
Thuốc thử FeCl3
Phân đoạn được chọn đem thử nghiệm SRB
1 1-8 0,32 E 2 vệt (a) −
2 9-28 1,08 E:C (9:1)
E:C (8:2) 3 vệt (a) + X
3 29-42 4,81 E:C (7:3) 3 vệt (a) + X
4 43-92 3,25 E:C (7:3) E:C (6:4) E:C (5:5)
5 vệt (b) + X
5 93-102 0,43 E:C (5:5) 4 vệt (b) − 6 102-114 2,01 E:C (4:6)
E:C (3:7) 4 vệt (b) − 7 115-123 0,74 E:C (2:8) 3 vệt (b) − 8 123-135 1,95 E:C (1:9)
C 5 vệt (c) + X
C: chloroform, E: ether dầu hỏa
(a): Hệ dung môi sắc ký lớp mỏng là ether dầu hỏa: chloroform (8:2) (b): Hệ dung môi sắc ký lớp mỏng là ether dầu hỏa : chloroform (2:8) (c): Hệ dung môi sắc ký lớp mỏng là chloroform
c. Sàng lọc các phân đoạn chứa phenolic có khả năng ức chế tăng sinh tế bào Bốn phân đoạn 2, 3, 4, 8 của bảng 3.13 được thử nghiệm SRB lần thứ 2 để tìm phân đoạn có khả năng ức chế cao nhất. Mỗi phân đoạn được pha trong DMSO 0,25% có cựng nồng độ (100àg/ml) cựng với chứng dương resveratrol (60àM) được đem cảm ứng trờn cỏc giếng chứa cựng lượng tế bào (104tế bào/100àl/1giếng). Kết quả được trình bày trong bảng 3.14 và hình 3.18.
Luận án Tiến sĩ Sinh học Trang 87 Kết quả trong bảng 3.14 cho thấy trong 4 phân đoạn khảo sát, phân đoạn thứ 3 cho
tỷ lệ ức chế tăng sinh dòng tế bào ung thư ruột kết DLD-1 cao nhất. Do đó, chúng tôi chọn phân đoạn 3 để cô lập hợp chất có khả năng ức chế tăng sinh tế bào.
3.2.3.3 Cô lập và thu nhận hoạt chất
Phân đoạn 3 (3,48g) được thực hiện sắc ký cột silica gel, giải ly bằng hệ dung môi ether dầu hỏa-chloroform với độ phân cực tăng dần từ 20% chloroform cho đến 50% chloroform trong ether dầu hỏa. Kết quả sắc ký cột trình bày ở bảng 3.15.
Phân đọan 3 của bảng 3.15 được tinh chế nhiều lần bằng sắc ký lớp mỏng điều chế với hệ dung môi ether dầu hỏa-chloroform (8:2) cho đến khi sản phẩm thu được chỉ còn 1 vết tròn rõ có Rf = 0,48 (hình 3.19). Kết quả cho phép cô lập được một hợp chất B (m=65mg) tương đối tinh khiết (khi kiểm tra bằng các hệ dung môi bất kỳ khác, hợp chất luôn hiện ra một vết duy nhất trên sắc ký lớp mỏng).
Bảng 3.15. Kết quả sắc ký cột phân đoạn 3 của bảng 3.14
Phân đoạn
Số thứ tự lọ (50ml/lọ)
Lượng
cao (g) Dung môi giải ly Sắc ký lớp
mỏng Ghi chú 1 1-6 0,15 E:C (80:20) 2 vệt (a)
2 6-27 0,38
E:C (90:10) E:C (75:25) E:C (72:28)
2 vệt (a)
3 28-59 0,93
E:C (72:28) E:C (71:29) E:C (70:30) E:C (69:31) E:C (65:35)
3 vệt (a)
Có dạng tinh thể hình kim dài,
màu cam đỏ
4 59-74 0,55 E:C (65:35)
E:C (60:40) 4 vệt (a) 5 75-90 0,32 E:C (60:40)
E:C (55:45) 4 vệt (a) 6 91-100 0,45 E:C (55:45)
E:C (50:50) 3 vệt (a) E: ether dầu hỏa, C: chloroform,
(a): Hệ dung môi sắc ký lớp mỏng là ether dầu hỏa: chloroform (8:2)
Luận án Tiến sĩ Sinh học Trang 88 3.2.3.4 Khảo sát hoạt tính của hợp chất cô lập được theo định hướng có khả năng
ức chế sự tăng sinh của tế bào ung thư ruột kết ở người DLD-1
Hợp chất B được kiểm tra khả năng ức chế sự tăng sinh của tế bào ung thư ruột kết ở người DLD-1 bằng phương pháp sử dụng máy đếm và đo kích thước tế bào coulter counter, đồng thời được khảo sát sâu hơn về ảnh hưởng của nó lên sự sinh tổng hợp protein và biểu hiện của protein mTOR (mammalian target of rapamycin), một protein kinase thiết yếu cho sự tăng sinh và phát triển tế bào động vật bằng phương pháp điện di miễn dịch Western Blot.
a. Coulter counter
Sự tăng sinh và phát triển của tế bào DLD-1 sau khi cảm ứng với hoạt chất cô lập được khảo sát trong 48 giờ. Cảm ứng hoạt chất ở các nồng độ khác nhau (0; 0,625;
1,25; 2,5; 3; 5àM) lờn tế bào đó được trải vào mỗi giếng của đĩa 24 giếng với mật độ 3,5x104 tế bào/giếng 24 giờ trước. Thí nghiệm được lặp lại 4 lần, mỗi lần là một giếng trong đĩa 24 giếng cho mỗi nồng độ. Sự tăng sinh và phát triển của tế bào sau 24, 48 giờ sau khi cảm ứng được trình bày trong bảng 3.16 và hình 3.20, 3.21.
Hình 3.19. Cô lập và thu nhận hoạt chất B
Thứ tự từ trái sang phải: đáy erlen hứng phân đoạn 3 sau khi làm khô dung môi; sắc ký điều chế nhiều lần vệt chất màu cam đỏ; vệt tròn rõ của hợp chất tinh khiết tại Rf=0,48 khi được giải ly bằng hệ ether dầu hỏa-chloroform (8:2); tinh thể của hợp
chất tinh khiết được kết tinh lại trong chloroform.
Luận án Tiến sĩ Sinh học Trang 89 Hình 3.20. Đường cong tăng sinh tế bào DLD-1 theo thời gian dưới ảnh hưởng của hợp
chất B ở các nồng độ khác nhau
0 50000 100000 150000 200000 250000 300000
0 24 48
số tế bào sống
Thời gian cảm ứng (giờ)
0 0,625
1,25 2,5
3 5
Res
Bảng 3.16. Ảnh hưởng của hợp chất ở các nồng độ khác nhau lên sự tăng sinh của tế bào DLD-1 sau 24, 48 giờ cảm ứng
Nồng độ mẫu thử (àM)
Thời gian cảm ứng (giờ)
0 24 48
Số tế bào còn sống khi được cảm ứng với hợp chất (tế bào ± SD)
0 (DMSO) 44176,5± 791,9 122321,3±6057,3 258948,0±14536,5 0,625 44176,5±791,9 117292,5±3428,4 237638,3±4034,6
1,25 44176,5±791,9 113654,3±3190,9 224799,8±15923,9 2,5 44176,5±791,9 89057,3±3765,6 199386,0±15307,2 3 44176,5±791,9 57980,3±5720,6 148936,5±15287,5 5 44176,5±791,9 20868,8±1335,5 92337,8±17867,5 Res 60 44176,5±791,9 25415,3±1648,6 106016,8±4466,3 Số liệu được trích từ phần mềm hỗ trợ Multisizer program AccuComp của máy đếm tế bào Coulter counter hiệu CoulterR Partikle count & size analyser Z2 (Beckmann Coulter Inc.)
Hình 3.21. Biểu đồ thể hiện tỷ lệ ức chế tăng sinh tế bào của hợp chất ở các nồng độ khác nhau (trái: sau 24 giờ cảm ứng, phải: sau 48 giờ cảm ứng)
0%
20%
40%
60%
80%
100%
120%
0 0,625 1,25 2,5 3 5 Res
% tế bào sống
Nồng độ hợp chất (àM) sống chết
0%
20%
40%
60%
80%
100%
120%
0 0,625 1,25 2,5 3 5 Res
% tế bào sống
Nồng độ hợp chất (àM) sống chết
Luận án Tiến sĩ Sinh học Trang 90 Ngoại suy từ biểu đồ thể hiện giá trị tỷ lệ ức chế sự tăng sinh (I%) tương ứng với
các nồng độ khảo sát, nồng độ ức chế 50% sự tăng sinh tế bào (IC50) của hoạt chất được xác định là 2,85 (24 giờ); và 3,53 (48 giờ). Bên cạnh đó, ảnh hưởng của hoạt chất lên hình thái tế bào thông qua các thông số diện tích, đường kính và thể tích tế bào cũng được ghi nhận trong bảng 3.17, hình 3.22.
Kết quả ở bảng 3.17, hình 3.23 cho thấy hợp chất B có khả năng ức chế mạnh sự tăng sinh tế bào (IC50=3,53àM sau 48 giờ cảm ứng), mạnh hơn cả chứng dương resveratrol (IC50=27àM) được sử dụng trong sàng lọc [67].
Trong đú, khi ở nồng độ thấp (0,0625-25àM), hợp chất cú xu hướng kộo dẹt tế bào, làm gia tăng diện tích tế bào lên chút ít (10-20%) nhưng thể tích và đường kính tế bào vẫn khụng thay đổi. Song, khi ở nồng độ cao (2,5-5àM), hợp chất làm giảm kích thước tế bào dần dần cho đến khi tế bào mất khả năng bám dính rồi chết.
So với resveratrol, một hợp chất ly trích từ vỏ trái nho đang được nghiên cứu sử dụng như một dược chất điều trị ung thư, tác dụng ức chế tăng sinh và phát triển của hợp chất B trên dòng tế bào DLD-1 khác hẳn: resveratrol cũng ức chế sự tăng sinh tế bào nhưng làm tăng kích thước tế bào trong 48 giờ đầu cảm ứng [17], [67].
So với rapamycin, một chất kháng sinh được công nhận về khả năng ức chế con đường truyền tín hiệu của protein mTOR, protein giữ vai trò chính trong việc tăng sinh và phát triển tế bào, thì tác dụng của hợp chất B lên DLD-1 có phần tương tự:
ức chế và làm giảm kích thước tế bào dần dần cho đến khi mất khả năng bám dính ngay sau 2 giờ cảm ứng [86].
Do vậy, với kết quả khảo sát, chúng tôi hy vọng hợp chất B được cô lập từ loài Drosera nuôi cấy in vitro sẽ là một hợp chất có tiềm năng sử dụng tương tự như rapamycin. Cũng vì lý do này, thí nghiệm tiếp theo đã được thiết kế nhằm khảo sát xem cơ chế tác dụng của hợp chất B trong việc ức chế tăng sinh và phát triển của tế bào in vitro thông qua sự biểu hiện của protein mTOR và con đường truyền tín hiệu của nó giống hay khác với cơ chế tác dụng của rapamycin.
Luận án Tiến sĩ Sinh học Trang 91 Bảng 3.17. Ảnh hưởng của hợp chất ở các nồng độ khác nhau lên kích thước của tế
bào DLD-1 sau 24, 48 giờ cảm ứng
Nồng độ chất B
(àM)
Thời gian cảm ứng (giờ)
0 24 48
Đường kớnh trung bỡnh của 1 tế bào (àm ± SD)
0 (DMSO) 13,84±0,108 14,08±0,080 14,88±0,287 0,625 13,82±0,102 14,32±0,089 14,32±0,182 1,25 13,78±0,092 14,44±0,194 14,25±0,376 2,5 13,92±0,088 14,39±0,100 13,94±0,299 3 13,91±0,102 13,04±0,055 13,83±0,206 5 13,89±0,098 9,444±0,872 8,476±0,747
Diện tớch trung bỡnh của 1 tế bào (àm2 ± SD)
0 (DMSO) 364,47±43,99 461,11±50,36 420,55±53,41 0,625 353,45±42,67 518,15±50,89 443,12±56,28 1,25 356,63±41,87 529,92±71,98 501,11±68,23 2,5 362,18±60,52 548,12±84,39 444,46±51,83 3 367,23±40,60 431,48±49,16 423,39±37,84 5 359,88±50,36 206,10±20,72 190,60±30,11
Thể tớch trung bỡnh 1ml tế bào đem đo (àm3 ± SD)
0 (DMSO) 1,19×108 ± 7×106 3,1×108 ± 1×107 7,26×108 ± 8×107 0,625 1,19×108 ± 7×106 3,1×108 ± 7×106 6,31×108 ± 3×107 1,25 1,18×108 ± 7×106 3,1×108 ± 4×106 6,03×108 ± 6×107 2,5 1,20×108 ± 7×106 2,6×108 ± 9×106 5,05×108 ± 3×107 3 1,17×108 ± 7×106 1,5×108 ± 2×107 3,92×108 ± 4×107 5 1,19×108 ± 7×106 2,8×108 ± 2×106 2,62×108 ± 4×107 Số liệu về đường kính và thể tích tế bào được trích từ phần mềm hỗ trợ Multisizer program AccuComp của máy đếm tế bào Coulter counter hiệu CoulterR Partikle count & size analyser Z2 (Beckmann Coulter Inc.), Số liệu về diện tích tế bào được xác định bằng phần mềm FitterBJ
Luận án Tiến sĩ Sinh học Trang 92 Hình 3.22. Biểu đồ thể hiện ảnh hưởng của hoạt chất lên kích thước của tế bào
DLD-1
0 2 4 6 8 10 12 14 16
0 0,625 1,25 2,5 3 5
Đường kớnh trung bỡnh 1 tế bào (àm)
Nồng độ hợp chất (àM) 0hr 24hr 48hr
0 100 200 300 400 500 600 700
DMSO 0,625 1,25 2,5 3 5
Diện tớch trung bỡnh của 1 tế bào (àm^2)
Nồng độ hợp chất (àM) Ảnh hưởng của hợp chất lên diện tích tế bào
0hr 24hr 48hr
0 100000000 200000000 300000000 400000000 500000000 600000000 700000000 800000000 900000000
0 0,625 1,25 2,5 3 5
thể tích sinh khối tế bào/ 1ml (um^3/ml)
Nồng độ hợp chất (àM) Ảnh hưởng của hợp chất lện thể tích sinh khối tế bào
0 24 48
Luận án Tiến sĩ Sinh học Trang 93 Hình 3.23. Tế bào DLD-1 dưới ảnh hưởng của hợp chất B sau 48 giờ cảm ứng được
quan sát dưới kính hiển vi đối pha, độ phóng đại 10x
A: chứng õm (DMSO); B: 0,625àM; C: 1,25àM; D: 2,5àM; E: 3àM; F: 5àM
A B
C D
E F
Luận án Tiến sĩ Sinh học Trang 94 b. Western blot:
Phương pháp Western Blot được sử dụng để khảo sát sự biểu hiện của protein mTOR (cả về tổng lượng protein lẫn hoạt tính phosphoryl hóa của nó) cùng với sự biểu hiện của phân tử downstream của nó trong con đường truyền tín hiệu là protein S6K vốn là protein giữ vai trò quan trọng trong sinh tổng hợp protein khi bị tác động bởi hợp chất B và chứng dương là rapamycin. Tế bào được trải đều trong 10ml môi trường nuôi vào đĩa petri có đường kính 10cm, với nồng độ 105 tế bào/ml, ủ trong 24 giờ để tế bào bám vào đáy đĩa. Cảm ứng tế bào với hoạt chất B với nồng độ 4àM (∼IC50) và chứng õm là DMSO, chứng dương là rapamycin 0,5àM [16]
trong 5 khoảng thời gian khảo sát (0phút, 30phút, 120phút, 8giờ, 48giờ),
Thu nhận protein tổng và xác định hàm lượng protein tổng bằng phương pháp DC Protein Assay reagents (Bio-Rad, Denmark) (phụ lục 1.2):
Đường chuẩn tuyến tính giữa nồng độ protein chuẩn BSA (0; 0,065; 0,125; 0,25;
0,375; 0,5; 0,75mg/l) và giá trị mật độ quang hấp thu ở bước sóng 750nm được trình bày trong phụ lục 2.1.
Dựa vào đường chuẩn, nồng độ protein tổng thu nhận từ sinh khối của tế bào DLD- 1 có và không có cảm ứng hoạt chất trong các khoảng thời gian (0, 30 phút, 120 phút, 8 giờ, 48 giờ) đã được xác định trong bảng 3.18, hình 3.24.
Bảng 3.18. Nồng độ protein tổng của sinh khối tế bào khi bị cảm ứng bởi hợp chất B và rapamycin theo thời gian
Thời gian cảm ứng
Nồng độ protein tổng (mg/ml ± SD) DMSO Hợp chất B
(4àM)
rapamycin (0,5àM)
Hợp chất B (4àM) + rapamycin (0,5àM) 0 0,501±0,007 0,501±0,007 0,501±0,007 0,501±0,007 30 phút 0,830±0,009 0,785±0,015 0,598±0,005 0,730±0,012
2 giờ 1,251±0,011 0,679±0,026 0,506±0,009 0,522±0,007 8 giờ 1,429±0,001 0,728±0,004 0,756±0,005 0,572±0,005 48 giờ 5,679±0,008 3,653±0,007 2,562±0,002 0,643±0,004
Luận án Tiến sĩ Sinh học Trang 95 Kết quả ở bảng 3.18 và hình 3.24 cho thấy, trong 30 phút đầu cảm ứng, hợp chất B
cũng như rapamycin có tác động làm thay đổi hàm lượng protein tổng của tế bào, và thực sự giảm rõ rệt sau 2 giờ cảm ứng. Kết quả phản ánh đúng với nghiên cứu trước đây từng chứng minh rapamycin tác dụng ức chế tăng sinh tế bào bằng con đường truyền tín hiệu mTOR rõ rệt sau 2 giờ cảm ứng [86].
Qua đó, dựa trên hàm lượng protein tổng định lượng được, chúng tôi nhận thấy hiệu quả ức chế tăng sinh của hợp chất B và rapamycin tương tự nhau: tác động ức chế sự sinh tổng hợp protein trong thời gian ngắn (chỉ sau 2 giờ), và làm giảm hàm lượng protein tổng xuống đáng kể (∼50%).
Bên cạnh đó, thử nghiệm kết hợp cả hai tác động của rapamycin và hợp chất B lên tế bào cũng giúp nhận ra mối quan hệ của hai hợp chất này khi tồn tại cùng nhau:
hợp chất B làm tăng khả năng ức chế của rapamycin và rapamycin cũng làm tăng thêm tác dụng của hợp chất B lên tế bào DLD-1. Mối quan hệ giữa các hoạt chất có cùng khả năng ức chế tăng sinh tế bào DLD-1 như thế này cũng đang được quan tâm trong các nghiên cứu gần đây giữa resveratrol và rapamycin [17], [67]. Tuy nhiên không giống như hợp chất B, resveratrol ức chế cường độ tác động của rapamycin lên tế bào ung thư [17]. Do đó, đối với resveratrol người ta có thể sử
Hỡnh 3.24. Biểu đồ thể hiện ảnh hưởng của hợp chất B (4àM) và rapamycin (0,5àM) lờn hàm lượng protein tổng của lysate tế bào DLD-1
0,00 1,00 2,00 3,00 4,00 5,00
0 30' 2 8 48
Nồng độ protein tổng (mg/ml
Thời gian cảm ứng (giờ)
Luận án Tiến sĩ Sinh học Trang 96 dụng resveratrol như một chất kìm hãm độc tính của rapamycin trong điều trị ung
thư trong khi hợp chất B không thể nắm giữ vai trò như thế.
Tóm lại, kết quả khảo sát hàm lượng protein tổng trong sinh khối tế bào DLD-1 khi bị cảm ứng bởi hợp chất B và rapamycin cho thấy tác động ức chế sinh tổng hợp protein tổng của hai hợp chất này tương tự nhau.
Việc khảo sát sự biểu hiện của các protein đích (mTOR, pmTOR và S6K) khi tế bào bị cảm ứng bởi rapamycin so với sự biểu hiện các protein đó khi tế bào bị cảm ứng bởi hợp chất B sẽ giúp chúng tôi tìm hiểu cơ chế tác động của hợp chất B có giống với rapamycin hay không.
Điện di protein bằng phương pháp SDS Page, chuyển protein đã được phân tách sau điện di lên màng lai và phát hiện tín hiệu của kháng thể bắt cặp với protein mTOR, pmTOR, S6K:
Tín hiệu của kháng thể bắt cặp với các protein quan tâm được phát hiện đồng thời với tín hiệu protein Actin làm tín hiệu chuẩn và ghi nhận thể tích tín hiệu phát quang bằng phần mềm Vision Words LS Acquisition & Analysis 6.4.3.
Kết quả được trình bày trong bảng 3.19 và hình 3.25, 3.26.
Bảng 3.19. Ảnh huởng của hợp chất B và rapamycin lên sự biểu hiện của protein mTOR, pmTOR, S6K theo thời gian
Protein
đích Hợp chất cảm ứng
Thể tích phát quang của tín hiệu
0 giờ 30 phút 2 giờ 0 giờ 8 giờ 48 giờ
mTOR
DMSO 8,430 16,745 20,046 9,490 10,718 17,415
HC B (4àM) 8,430 15,968 12,755 9,490 9,182 15,989 Rap (0,5àM) 8,430 16,908 13,035 9,490 9,217 12,786 HC B (4àM) +
Rap (0,5àM) 8,430 16,895 13,001 9,490 9,624 11,196
pmTOR
DMSO 4,855 5,930 6,870 3,210 8,919 8,263
HC B (4àM) 4,855 5,993 4,198 3,210 8,656 7,414
Rap (0,5àM) 4,855 5,762 1,854 3,210 6,982 3,082
HC B (4àM) +
Rap (0,5àM) 4,855 5,866 1,938 3,210 7,732 3,138
S6K
DMSO 132,850 134,983 130,677 85,251 105,894 96,383 HC B (4àM) 132,850 131,857 127,960 85,251 103,893 99,122 Rap (0,5àM) 132,850 16,215 6,871 85,251 0,000 0,000 HC B (4àM) +
Rap (0,5àM) 132,850 39,895 6,768 85,251 0,000 0,000 HC B: hợp chất B, Rap: rapamycin
Luận án Tiến sĩ Sinh học Trang 97
Hình 3.25. Biều đồ thể hiện ảnh huởng của hợp chất B và rapamycin lên sự biểu hiện của protein mTOR, pmTOR, S6K theo thời gian
0 5 10 15 20 25
0 30' 2 giờ
Thể tích phát quang tín hiệu
Thời gian cảm ứng
mTOR
DMSO HC Rap HC+Rap
0 5 10 15 20
0 8 giờ 48 giờ
Thể tích tín hiệu phát quang
Thời gian cảm ứng
mTOR
DMSO HC Rap HC+Rap
0 1 2 3 4 5 6 7 8
0 30 phút 2 giờ
Thể tích phát quang tín hiệu
Thời gian cảm ứng
pmTor
DMSO HC Rap HC+Rap
0 2 4 6 8 10
0 8 giờ 48 giờ
Thể tích tin hiệu phát quang
Thời gian cảm ứng
pmTOR DMSO HC Rap HC+Rap
0 20 40 60 80 100 120 140 160
0 30 phút 2 giờ
Thể tích tín hiệu phát quang
Thời gian cảm ứng
S6K DMSO HC Rap HC + Rap
0 20 40 60 80 100 120
0 8 giờ 48 giờ
Thể tích tín hiệu phát quang
Thời gian cảm ứng
S6K DMSO HC Rap HC + Rap