Nguyên liệu nuôi cấy: trái chứa hạt của 2 loài Drosera được thu thập từ khu bảo tồn thiên nhiên Bình Châu – Phước Bửu (tỉnh Bà Rịa–Vũng Tàu). Việc định danh mẫu thu hái được tiến hành bởi BM. Thực vật học (nay là BM. Sinh thái và Sinh học tiến hóa) của Trường ĐH Khoa học tự nhiên, TP. HCM (phụ lục 2.1).
Hoá chất khử trùng: Javel + Tween-20 (0,01% v/v) Chất điều hòa tăng trưởng thực vật: BA
Môi trường nuôi cấy: MS (phụ lục 1.1), bổ sung: đường sucrose (30g/l), than hoạt tính (1g/l), casein hydrosylate (100 mg/l), agar khi sử dụng môi trường rắn (7g/l), pH = 5,8 ± 0,1 (được chỉnh bằng NaOH 1N hay HCl 1N). Môi trường được hấp khử trùng bằng autoclave ở 1atm, 1210C, trong 30 phút.
Điều kiện nuôi cấy: chiếu sáng trong 16 giờ/ngày với cường độ chiếu sáng là 2800
± 200 lux, nhiệt độ phòng nuôi cấy khoảng 22-250C và ẩm độ trung bình là 70%.
2.1.2 Phương pháp
2.1.2.1 Khử trùng nguyên liệu nuôi cấy
Hai loài Drosera thu hái ở khu bảo tồn thiên nhiên Bình Châu-Phước Bửu có bề mặt thân và lá phủ đầy lông tơ mang tuyến tiết với giọt “dew drop” có chất dính ở đầu và mang vô số vi sinh vật khác nhau. Do vậy, để có mẫu cấy vô trùng, chúng tôi phải nuôi cấy cây trưởng thành trong điều kiện in vitro từ bộ phận khác dễ khử trùng hơn là trái chứa hạt, rồi mới sử dụng các mẫu cấy từ cây trưởng thành in vitro đó. Để có sự đồng nhất về di truyền, các mẫu cấy sử dụng trong cùng một thí nghiệm sau đó đều có nguồn gốc từ một cây trưởng thành ban đầu này.
Trái chứa hạt Drosera được khử trùng theo các bước: đốt nhanh trái qua đèn cồn cho cháy hết lông tơ bên ngoài, sau đó rửa bằng nước cất vô trùng 2-3 lần, rồi lắc
Luận án Tiến sĩ Sinh học Trang 36 Hình 2.1 . Sơ đồ phương pháp nhân giống bằng chồi bên [7]
trong ethanol 70% trong 1 phút, rửa lại bằng nước cất vô trùng 3-5 lần trước khi lắc trong dung dịch khử trùng gồm Tween-20 (0,01% v/v) và Javel (10% v/v), sau 10 phút rửa sạch dung dịch khử trùng bằng nước cất vô trùng 5-7 lần, cuối cùng tách bỏ vỏ của trái Drosera đã khử trùng để lấy hạt chứa bên trong, đem hạt ngâm trong dung dịch giberelin 1% trong 24 giờ trước khi gieo hạt trên môi trường MS rắn có bổ sung các thành phần như đã liệt kê ở mục 2.1.1.
2.1.2.2 Nhân giống bằng chồi bên (hình 2.1)
Cây con Drosera nẩy mầm từ hạt sau khoảng 4 tuần nuôi cấy được cô lập chồi ngọn và chồi bên trong môi trường MS rắn có bổ sung các thành phần như đã liệt kê ở mục 2.1.1, cùng với các nồng độ BA khác nhau (0; 0,1; 0,5; 1; 2; 3mg/l).
Sau 5 tuần nuôi cấy, xác định tỷ lệ mẫu tạo chồi bên, số chồi bên được tạo thành trên một mẫu, chiều cao trung bình chồi. Thí nghiệm được bố trí theo thể thức hoàn toàn ngẫu nhiên gồm 6 nghiệm thức với nồng độ BA khác nhau như đã đề cập trên mỗi loài Drosera; mỗi nghiệm thức có 3 lần lặp lại, mỗi lần lặp lại là một bình, mỗi bình chứa 100ml môi trường và 10 đốt thân.
2.1.2.3 Nhân giống bằng tạo chồi bất định từ lớp mỏng tế bào (hình 2.2)
Các bộ phận lóng thân (chỉ đối với D. indica), lá, cuống lá, cuống hoa, của cây con Drosera nẩy mầm từ hạt sau khoảng 4 tuần nuôi cấy được cô lập, cắt thành những lớp mỏng (3-4mm) và được cấy vào môi trường MS rắn có bổ sung các thành phần như đã liệt kê ở mục 2.1.1, cùng với nồng độ BA khác nhau (0; 1; 2; 3; 4; 5mg/l).
Luận án Tiến sĩ Sinh học Trang 37 Hình 2.2. Sơ đồ phương pháp nhân giống bằng chồi bất định [64]
Sau 5 tuần nuôi cấy, xác định tỷ lệ mẫu tạo chồi bên, số chồi bên được tạo thành trên một mẫu, chiều cao trung bình chồi. Thí nghiệm được bố trí theo thể thức hoàn toàn ngẫu nhiên gồm 6 nghiệm thức với nồng độ BA khác nhau như đã đề cập trên mỗi loài Drosera; mỗi nghiệm thức có 3 lần lặp lại, mỗi lần lặp lại là một bình, mỗi bình chứa 100ml môi trường và 5 mẫu cấy lớp mỏng ban đầu.
2.1.2.4 Thử nghiệm quy trình nuôi cấy hai bước (Improved 2-step Liquid Culture System) trong việc cải thiện hệ số nhân chồi và phát triển thành cây in vitro hoàn chỉnh [24]
Đốt thân (mang chồi ngọn hay chồi bên) của cây con Drosera nẩy mầm từ hạt sau khoảng 4 tuần nuôi cấy được thử nghiệm quy trình nuôi cấy hai bước (bảng 2.1):
(1) cảm ứng mẫu tạo chồi bên trong 2 tuần bằng môi trường MS có chứa cytokinin với nồng độ BA thích hợp đã xác định ở mục 2.1.2.2 (0,5mg/l cho D. indica;
2mg/l cho D. burmanii) nhưng chỉ trong 2 tuần.
(2) sau đó các mẫu cấy đã được cảm ứng tạo chồi bên lập tức được chuyển sang môi trường MS lỏng loại bỏ cytokinin trong 3 tuần.
Trong đó, thí nghiệm được thiết kế kết hợp với việc theo dõi khả năng nuôi cấy Drosera trong môi trường lỏng.
Bảng 2.1. Thử nghiệm quy trình nuôi cấy 2 bước với 2 kiểu nuôi cấy rắn và lỏng
Nghiệm thức Quy trình nuôi cấy từ đốt thân
Bước 1 (2 tuần) Bước 2 (3 tuần) NT0 Rắn, bổ sung BA suốt 5 tuần nuôi cấy
NT1 rắn, bổ sung BA rắn, không bổ sung BA NT2 rắn, bổ sung BA lỏng, không bổ sung BA NT3 lỏng, bổ sung BA lỏng, không bổ sung BA
Luận án Tiến sĩ Sinh học Trang 38 Sau 5 tuần nuôi cấy, xác định các chỉ tiêu: tỷ lệ mẫu tạo chồi, số chồi bên được tạo
thành trên một mẫu và hình thái của cây. Thử nghiệm được lặp lại 3 lần cho mỗi nghiệm thức, mỗi lần lặp lại là một quy trình tiến hành độc lập với 100ml môi trường và 5 mẫu cấy ban đầu.
2.1.2.5 Tạo rễ và phát triển cây con hoàn chỉnh
Chồi con tách ra từ cụm chồi mẹ được tạo thành ở mỗi loài Drosera sau 4-6 tuần nuôi cấy có thể phát triển thành cây con hoàn chỉnh với đầy đủ các bộ phận trên môi trường MS lỏng bổ sung các thành phần như đã liệt kê ở mục 2.1.1, kể cả rễ mà không cần đến việc bổ sung auxin.