3.1 Nuôi cấy in vitro hai loài Drosera để tạo nguồn nguyên liệu khởi đầu
3.2.2 Sàng lọc và cô lập hợp chất có hoạt tính kháng oxy hóa
3.2.2.1 Sàng lọc các loại cao chiết có hoạt tính kháng oxy hóa mạnh bằng thử nghiệm năng lực khử của Yen và Duh (1993)
Các loại cao chiết được đem thử năng lực khử bằng phương pháp Yen và Duh (1993): một lượng bằng nhau của mỗi loại cao chiết (5mg) được hòa trong 10ml ethanol và tiến hành thí nghiệm. Kết quả trình bày trong bảng 3.6 và hình 3.9, 3.10
Bảng 3.6. Năng lực khử thể hiện qua giá trị OD ở bước sóng 700nm của các loại cao theo phương pháp Yen và Duh (1993)
Loài Dung dịch đo Ký hiệu Gía trị OD ± SD Đối chứng Chứng âm ĐC 0,007 ± 0,001a
Chứng dương VitE 0,951 ± 0,026h*
D. indica Cao n-hexan I1 0,160 ± 0,011b*
Cao chloroform I2 0,775 ± 0,003g*
Cao ethyl acetate I3 0,501 ± 0,066e*
Cao ethanol I4 0,350 ± 0,009d*
D. burmanii Cao n-hexan B1 0,121 ± 0,003b Cao chloroform B2 0,666 ± 0,037f*
Cao ethyl acetate B3 0,678 ± 0,009f*
Cao ethanol B4 0,273 ± 0,001c*
Các số trung bình trong cột với các mẫu tự khác nhau thì khác biệt nhau, * chỉ sự khác biệt giữa các nghiệm thức với đối chứng, sự khác biệt có ý nghĩa ở mức p=0,05
Luận án Tiến sĩ Sinh học Trang 75 Kết quả cho thấy với loài D. indica, năng lực khử của cao chloroform cao hơn hẳn
so với của các loại cao chiết khác, kế đó là cao ethyl acetate và thấp nhất là n-hexan.
Còn đối với loài D. burmanii, năng lực khử của cao chloroform và cao ethyl acetate có hoạt tính tương đương nhau (được xếp vào cùng một nhóm phân hạng khi thống kê) và cao hơn so với cao ethanol và n-hexan. Do đó, có thể nói các hợp chất có độ phân cực trung bình và độ phân cực khá (các hợp chất được hòa tan trong chloroform và ethyl acetate) của hai loài Drosera giữ vai trò chủ yếu trong việc tạo nên hoạt tính kháng oxy hóa của cây. Trong đó, cao chloroform của D.indica cho thấy có chứa nhiều hoạt chất và có tính kháng oxy hóa mạnh nhất trong 8 loại cao chiết đã điều chế. Vì vậy, để sàng lọc tìm loại cao chiết chứa hoạt chất kháng oxy hóa mạnh, chúng tôi chọn cao chiết chloroform của D.indica và tiến hành giải ly trên sắc ký cột silica gel bằng hệ dung môi gồm chloroform và ethyl acetate.
3.2.2.2 Thu nhận các phân đoạn từ cao chiết chloroform của D. indica và sàng lọc phân đoạn có hoạt tính oxy hóa mạnh
a. Sắc ký cột
Cao chloroform của D. indica (15,72g) được thực hiện sắc ký cột silica gel với pha động là hệ dung môi chloroform: ethyl acetate với độ phân cực tăng dần từ 0% ethyl acetate đến 100% ethyl acetate trong chloroform.
b. Sàng lọc các phân đoạn chứa hợp chất phenolic bằng FeCl3/methanol Kết quả định tính được tổng kết trong bảng 3.7
Kết quả định tính cho thấy các phân đoạn trừ phân đoạn 7, hầu hết đều dương tính với thuốc thử định tính phenolic. Tuy nhiên, để có thể cô lập hoạt chất tinh khiết, chúng tôi đã chọn những phân đoạn có khối lượng cao hơn trong số đó để tiến hành thử nghiệm hoạt tính sinh học lần 2 trong quy trình sàng lọc.
Luận án Tiến sĩ Sinh học Trang 76 Bảng 3.7 . Kết quả sắc ký cột silica gel trên cao chloroform của D. indica
Phân đoạn
Số thứ tự lọ (100ml/lọ)
Lượng cao (g)
Dung môi giải ly
Sắc ký lớp mỏng
Thuốc thử FeCl3
Phân đoạn được chọn đem
thử nghiệm năng lực khử
1 1-12 1,58 C 3 vết (a) + X
2 13-18 0,94 C C:E (9:1) C:E (8:2)
4 vết (a) + X
3 19-29 0,57 C:E (7:3)
C:E (6:4) 4 vết (b) + 4 30-34 0,13 C:E (6:4)
C:E (5:5) 4 vết (b) +
5 35-95 1,83 C:E (4:6) 4 vết (c) + X 6 96-130 2,27 C:E (4:6)
C:E (3:7) 3 vết (c) + X 7 135-141 0,98 C:E (2:8) 4 vệt (c) −
8 141- 145 0,75 C:E (1:9) 4 vệt (c) +
9 145-155 1,92 E 5 vệt (c) + X
C: chloroform, E: ethyl acetate
(a): Hệ dung môi sắc ký lớp mỏng là chloroform: ethyl acetate (8:2) (b): Hệ dung môi sắc ký lớp mỏng là chloroform: ethyl acetate (5: 5) (c): Hệ dung môi sắc ký lớp mỏng là chloroform: acetone (9: 1)
c. Sàng lọc các phân đoạn chứa phenolic có hoạt tính oxy hóa mạnh bằng thử nghiệm năng lực khử theo Yen và Duh (1993):
5 phân đoạn (phân đoạn 1, 2, 5, 6, 9) sau khi được lựa chọn được đem thử nghiệm năng lực khử với cùng một khối lượng bằng nhau ở mỗi phân đoạn (1mg) trong 10ml ethanol.
Kết quả được trình bày trong bảng 3.8 và hình 3.11, 3.12 cho thấy trong 5 phân đoạn chọn đem thử nghiệm, phân đoạn 6 cho hoạt tính kháng oxy hóa cao nhất. Do đó, chúng tôi sử dụng phân đoạn 6 (∼2g cao) để cô lập hoạt chất có tính kháng oxy hóa.
Luận án Tiến sĩ Sinh học Trang 77 Bảng 3.8. Năng lực khử thể hiện qua giá trị OD ở bước sóng 700nm của các phân
đoạn theo phương pháp Yen và Duh (1993)
Dung dịch đo Ký hiệu Gía trị OD ± SD
Chứng âm ĐC 0,004 ± 0,0002a
Chứng dương VitE 0,717 ± 0,0455e* Phân đoạn 1 1 0,184 ± 0,0043b* Phân đoạn 2 2 0,171 ± 0,0022b* Phân đoạn 5 5 0,262 ± 0,0095c*
Phân đoạn 6 6 0,389 ± 0,0100d*
Phân đoạn 9 9 0,185 ± 0,0095b*
Các số trung bình trong cột với các mẫu tự khác nhau thì khác biệt nhau, * chỉ sự khác biệt giữa các nghiệm thức với đối chứng, sự khác biệt có ý nghĩa ở mức p=0,05
3.2.2.3 Cô lập và thu nhận hợp chất
Phân đoạn 6 của bảng 3.8 được đem sắc ký lọc gel Sephadex LH-20, giải ly với hệ dung môi chloroform-methanol (1:1). Hơn 60% các phân đoạn thu được sau lọc gel có dạng tinh thể hình kim mịn, vàng ánh sau khi được kết tinh trong hệ dung môi chloroform-ethyl acetate (3: 7) (hình 3.13). Kết quả cho phép cô lập được một hợp chất A (m= 49mg) tương đối tinh khiết (khi kiểm tra bằng các hệ dung môi bất kỳ khác, hợp chất luôn hiện ra một vết duy nhất trên sắc ký lớp mỏng).
Hình 3.11. Biểu đồ biểu diễn năng lực khử của các phân đoạn trong thử nghiệm Yen & Duh
0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8
NC VitE PĐ 1 PĐ 2 PĐ 5 PĐ 6 PĐ 9
Gía trị OD700nm
Nghiệm thức
Hình 3.12 Năng lực khử của các phân đoạn trong thử nghiệm Yen & Duh
Luận án Tiến sĩ Sinh học Trang 78 3.2.2.4 Khảo sát hoạt tính kháng oxy hóa của hợp chất cô lập
Hợp chất cô lập được khảo sát hoạt tính kháng oxy hóa bằng hai phương pháp ferric thyocyante (FTC) và thiobarbituric acid (TBA) cùng với 2 chứng dương có hoạt tính kháng oxy hóa mạnh khác là BHA và vitamin E.
Động học của phản ứng FTC được khảo sát dựa trên đường cong biến thiên độ hấp thu quang phổ ở bước sóng hấp thu 500nm của chứng âm trong phản ứng. Qua đó, kết quả cho thấy quá trình peroxid hóa lipid ở phương pháp FTC kéo dài trên dưới 7 ngày (bảng 3.9, hình 3.14). Do đó, để các mẫu phản ứng hoàn toàn, chúng tôi chọn thời điểm ghi nhận khả năng ức chế của các hoạt chất là 7 ngày sau khi bắt đầu ủ.
Tương tự, động học của phản ứng TBA được khảo sát dựa trên đường cong biến thiên độ hấp thu quang phổ ở bước sóng hấp thu 532nm của chứng âm trong phản ứng, kết quả cho thấy quá trình peroxid hóa lipid ở phương pháp TBA kéo dài trên dưới 8 ngày, do đó thời điểm ghi nhận khả năng ức chế của các hoạt chất là 8 ngày sau khi bắt đầu ủ (bảng 3.10, hình 3.15).
Hình 3.13 .Tinh thể hình kim của hợp chất A
A: Hợp chất sau khi cô lập được giải ly trên bảng sắc ký bằng hệ dung môi gồm chloroform: aceton (1: 1) và 7 giọt acid acetic cho một vệt rõ, gọn ở vị trí Rf = 0,61.
B: Tinh thể hình kim của hợp chất A
Luận án Tiến sĩ Sinh học Trang 79 Kết quả ở bảng 3.9 và 3.10 cho thấy với cả 2 hai phương pháp, biến thiên độ hấp
thu quang phổ của hợp chất A và hai chất chứng dương đều thể hiện rất rõ sự hấp thu ở bước sóng thích hợp (500nm ở phương pháp FTC, 532nm ở phương pháp TBA) thấp hơn so với chứng âm tại tất cả thời điểm theo dõi. Dung dịch có giá trị OD càng cao chứng tỏ dung dịch có chứa càng nhiều các sản phẩm bị oxy hóa. Rõ ràng, hợp chất A có khả năng tương đương như vitamin E và BHA: ức chế quá trình peroxid hóa lipid theo thời gian và khả năng này thể hiện rõ nhất khi phản ứng xảy ra hoàn toàn ở các mẫu, tức thời điểm sản phẩm của quá trình peroxide hóa ở chứng âm đã đạt giá trị cực đại (sau 7 ngày ở phương pháp FTC, và 8 ngày với phương pháp TBA). Tại thời điểm đó, tỷ lệ % kháng oxy hóa của hoạt chất đã được xác định (bảng 3.11, hình 3.16)
Kết quả ở cả hai phương pháp đều cho thấy được khả năng ức chế quá trình peroxide hóa lipid của hợp chất A rất cao, nó có thể được xếp cùng nhóm với Vitamin E và BHA về khả năng kháng oxy hóa.
Luận án Tiến sĩ Sinh học Trang 80 Ngày
Ngày
Hình 3.14. Đường cong biến thiên độ hấp thu quang phổ ở 500nm để theo dõi động
học của phản ứng
000 000 000 000 000 001 001 001 001 001
0 1 2 3 4 5 6 7
Đối chứng Vitamin E
BHA Hợp chất
000 000 000 001 001 001 001
0 1 2 3 4 5 6 7
Đối chứng Vitamin E
BHA Hợp chất
Bảng 3.9. Hoạt tính kháng oxy hóa của hợp chất theo phương pháp FTC
Lần lặp
lại
Ngày
Gía trị OD Chứng
âm VitE BHA Hợp chất A
1
0 0,266 0,221 0,279 0,254 1 0,373 0,285 0,288 0,286 2 0,374 0,301 0,301 0,291 3 0,381 0,258 0,280 0,272 4 0,394 0,326 0,314 0,324 5 0,425 0,389 0,328 0,308 6 0,829 0,387 0,341 0,330 7 0,343 0,308 0,281 0,267
% hoạt tính kháng oxy hóa AI (%)
10,15 18,09 22,05
2
0 0,225 0,178 0,209 0,207 1 0,472 0,411 0,395 0,342 2 0,474 0,428 0,409 0,346 3 0,481 0,384 0,388 0,327 4 0,503 0,396 0,360 0,336 5 0,525 0,401 0,342 0,357 6 1,036 0,537 0,492 0,482 7 0,508 0,430 0,363 0,330
% hoạt tính kháng oxy hóa AI (%)
15,43 28,58 35,12
Luận án Tiến sĩ Sinh học Trang 81 Ngày
Ngày
Hình 3.15. Đường cong biến thiên độ hấp thu quang phổ ở532nmđểtheo dõiđộng
000 000 000 000 000
0 1 2 3 4 5 6 7 8
OD532
Đối chứng Vitamin E
BHA Hợp chất
000 000 000 000 000 001 001
0 1 2 3 4 5 6 7 8
OD532
Đối chứng Vitamin E
BHA Hợp chất
Bảng 3.10. Hoạt tính kháng oxy hóa của hợp chất theo phương pháp TBA
Lần lặp
lại
Ngày
Gía trị OD Chứng
âm VitE BHA Hợp chất A
1
0 0,021 0,023 0,022 0,036 1 0,055 0,063 0,051 0,041 2 0,063 0,03 0,027 0,024 3 0,082 0,031 0,023 0,039 4 0,085 0,044 0,029 0,044 5 0,149 0,036 0,027 0,034 6 0,151 0,045 0,033 0,039 7 0,183 0,037 0,028 0,036 8 0,093 0,027 0,011 0,026
% hoạt tính kháng oxy hóa AI (%)
70,97 88,17 72,04
2
0 0,017 0,016 0,024 0,014 1 0,029 0,021 0,018 0,017 2 0,041 0,034 0,023 0,020 3 0,063 0,046 0,028 0,021 4 0,122 0,061 0,038 0,023 5 0,287 0,076 0,045 0,032 6 0,399 0,167 0,065 0,056 7 0,501 0,113 0,063 0,048 8 0,447 0,082 0,036 0,043
% hoạt tính kháng oxy hóa AI (%)
81,66 91,95 90,38
Luận án Tiến sĩ Sinh học Trang 82 Bảng 3.11. Tỷ lệ % hoạt tính kháng oxy hóa AI (%) của các hoạt chất khảo sát
Chứng âm Vitamin E BHA Hợp chất A AI (% ± SD)
(phương pháp TBA) 0,00±0,00a 76,31±5,34b* 90,06±1,89b* 81,21±9,17b* AI (% ± SD)
(phương pháp FTC) 0,00±0,00a 12,79±2,64ab 23,33±5,25b* 28,59±6,53b* Các số trung bình trong cột với các mẫu tự khác nhau thì khác biệt nhau, * chỉ sự khác biệt giữa các nghiệm thức với đối chứng, sự khác biệt có ý nghĩa ở mức p=0,05
3.2.2.5 Xác định cấu trúc hóa học của hoạt chất cô lập được theo hướng tìm hoạt chất có khả năng chống oxy hóa
Ghi nhận các tín hiệu để xác định cấu trúc hợp chất:
Đặc điểm của hợp chất: có dạng tinh thể hình kim dài, màu vàng, nhiệt độ nóng chảy: 3160C, trị số Rf = 0,61 khi được giải ly bằng hệ dung môi chloroform-aceton (1: 1) và 7 giọt acetic acid.
Kết quả khối phổ MS: có sự hiện diện của đỉnh [M-1]- 301 tương ứng với khối lượng phân tử của A là 302 (phụ lục 2.6)
Kết quả phổ 1H-, 13C-NMR, DEPT, HMQC và HMBC: các tín hiệu nhận diện từ kết quả phổ được trình bày tóm tắt trong bảng 3.11.
Hình 3.16. Biểu đồ biểu diễn tỷ lệ hoạt tính kháng oxy hóa của hợp chất cô lập so với vitE và BHA ở cả hai phương pháp FTC và TBA
0 20 40 60 80 100
AI (FTC) AI (TBA)
Tỷ lệ kháng oxy hóa (%)
VITE BHA Hop chat
Luận án Tiến sĩ Sinh học Trang 83 Bảng 3.11. Phổ 1H-NMR, 13C-NMR và HMBC của hợp chất A cô lập được.
Vị trí
1H-NMR (CDCl3) (δ ppm, J Hz)
13C-NMR (CDCl3) (δ ppm)
HMBC (1H → 13C) 2 146,97 3 136,76 4 176,57 5 162,32 6 6,26 (1H, d, J=2,5) 99,16 5, 7, 10 7 165,02 8 6,52 (1H, d, J=2,0) 94,45 7, 9, 10 9 157,78
10 104,12 1’ 123,76 2’ 7,82 (1H, d, J=2) 115,76 4’, 6’
3’ 145,85 4’ 148,36 5’ 7,00 (1H, d, J=8,5) 116,21 1’, 3’, 4’
6’ 7,70 (1H, dd, J=8,5 và 2,5) 121,45 2’, 4’
5-OH 12,15 (1H, s)
Số liệu ghi nhận được tóm tắt từ các kết quả chạy phổ ở phụ lục 2.7
Xác định cấu trúc hợp chất
Dựa trên các tín hiệu về đặc điểm và kết quả phổ đã ghi nhận được từ hợp chất cô lập được, so sánh với các đặc điểm và phổ chuẩn của các hợp chất đã biết, hợp chất được xác định có cấu trúc là quercetin, một flavonoid có giá trị hoạt tính sinh học cao rất phổ biến trong giới thực vật [13].
Vài thông tin về hợp chất vừa xác định cấu trúc
Danh pháp hóa học: 2-(3,4-dihydrophenyl)-3,5,7-trihydroxy-4H-chromen-4-one Tên thương mại: quercetin, sophoretin, meletin, xanthaurine, quercetol, quercitrin,
flavin meletin.
Cấu trúc hóa học: C15H10O7; M=302,226
O
OH HO
O OH
OH 1
2
3 4 5
6
7 8
9
10
1' 2' 3' 4' 5' 6'
OH
Luận án Tiến sĩ Sinh học Trang 84 Hóa tính và lý tính: tinh thể hình kim, màu vàng, có vị đắng, nóng chảy ở 3160C.
Không tan trong nước, tan ít trong cồn, tan trong acid acetic và các dung dịch có tính kiềm.
Dược tính: quercetin đã được chứng minh là có vai trò quan trọng trong hoạt động kháng viêm của cơ thể do nó có thể ngăn chặn trực tiếp nhiều tiến trình khởi phát sự viêm: ức chế sự sản xuất và phóng thích histamin và các chất trung gian khác trong quá trình viêm và dị ứng [42], [76], [110]. Ngoài ra, quercetin còn được chứng minh là có khả năng kháng các chủng vi khuẩn gây ra các bệnh về hô hấp, dạ dày, ruột, bài tiết và bệnh ngoài da [89]; làm giãn nở động mạch vành, giảm mỡ tích tụ trong máu, chống đông máu, chống thiếu máu, chống bệnh quá mẫn cảm [51].