3.1 Nuôi cấy in vitro hai loài Drosera để tạo nguồn nguyên liệu khởi đầu
3.1.4 Thử nghiệm quy trình nuôi cấy hai bước (Improved 2-step Liquid Culture System) trong việc cải thiện khả năng nhân chồi và phát triển thành cây con hoàn chỉnh [24]
Đốt thân của cây con Drosera hay chồi con sau khi được tạo thành từ các phương pháp nhân giống, được tiến hành nhân giống theo hai bước: (1) nuôi cấy trên môi trường MS (rắn, lỏng) với nồng độ BA thích hợp đã xác định ở mục 2.1.2.2 (0,5mg/l cho D. indica; 2mg/l cho D. burmanii) nhưng chỉ trong 2 tuần; (2) sau đó các mẫu cấy đã được cảm ứng nhân chồi bên được lập tức chuyển sang môi trường MS (rắn, lỏng) bổ sung đầy đủ các thành phần ngoại trừ BA trong 3 tuần tiếp theo.
Sau 5 tuần nuôi cấy, so sánh với mẫu đối chứng không áp dụng quy trình nuôi cấy lỏng 2 bước.
Kết quả ghi nhận được trình bày trong bảng 3.3, hình 3.7 cho thấy việc nuôi cấy hai bước theo quy trình của Christoph Wawrosch (2009) áp dụng trên cả hai loài Drosera đều đạt hiệu quả cao, trong đó NT2 (2 tuần đầu cảm ứng tạo chồi bằng MS rắn bổ sung BA, 3 tuần sau chuyển mẫu đã cảm ứng sang môi trường MS lỏng không bổ sung hormone) là thích hợp nhất cho việc cải thiện khả năng nhân chồi và
Luận án Tiến sĩ Sinh học Trang 70
Hình 3.7. Biểu đồ biểu diễn ảnh hưởng của việc ứng dụng quy trình nuôi cấy lỏng 2 bước lên khả năng tạo chồi của Drosera (trái: D. indica, phải: D. burmanii)
0 5 10 15 20 25
0 20 40 60 80 100 120
NT0 NT1 NT2 NT3
số chồi/ mẫu
tỷ lệ mẫu tạo chồi (%)
Nghiệm thức
tỷ lệ tạo chồi (%) số chồi/mẫu
0 5 10 15 20 25 30
0 20 40 60 80 100 120
NT0 NT1 NT2 NT3
số chồi/ mẫu
tỷ lệ mẫu tạo chồi (%)
Nghiệm thức
tỷ lệ tạo chồi (%) số chồi/mẫu
phát triển cây con với tỷ lệ tạo chồi cao nhất (100%) và số chồi trên một mẫu cao hơn (D. indica: cao gấp 1,58 lần; D. burmanii cao gấp 2,03 lần) so với đối chứng không áp dụng quy trình nuôi cấy hai bước.
Bảng 3.3. Thử nghiệm quy trình nuôi cấy 2 bước với 2 kiểu nuôi cấy rắn, lỏng
Loài Nghiệm thức
Quy trình nuôi cấy từ đốt thân
Tỷ lệ tạo chồi (%±SD)
Số chồi /mẫu (chồi ± SD)
Hình thái cây con
D. indica
NT0 5 tuần: MS rắn +BA 100,00 ± 0,00b
15,60
± 0,40a
Cây lùn, không thấy rễ, lá ít NT1 2 tuần đầu: MS rắn + BA
3 tuần sau: MS rắn
100,00 ± 0,00b
17,40
± 0,87b*
Cây cao hơn đối chứng, có rễ, lá nhiều NT2 2 tuần đầu: MS rắn + BA
3 tuần sau: MS lỏng
100,00 ± 0,00b
25,33
± 0,64c*
Cây cao nhất, có rễ, lá nhiều
NT3 2 tuần đầu: MS lỏng + BA 3 tuần sau: MS lỏng
73,33
±11,55a*
26,03
± 0,91c*
Cây cao, có rễ, lá nhiều
D. burmanii
NT0 5 tuần: MS rắn +BA 100,00 ± 0,00b
9,47
± 0,12a
Lá nhỏ, không vươn cao, không rễ NT1 2 tuần đầu: MS rắn + BA
3 tuần sau: MS rắn
100,00 ± 0,00b
11,27
± 0,31b*
Lá to, vươn cao hơn đối chứng, có rễ NT2 2 tuần đầu: MS rắn + BA
3 tuần sau: MS lỏng
100,00 ± 0,00b
20,07 ± 0,95d*
Lá to, nhiều, thân vươn cao, có rễ
NT3 2 tuần đầu: MS lỏng + BA 3 tuần sau: MS lỏng
53,33
±11,55a*
17,00
± 0,00c*
Lá to, nhiều, thân vươn cao nhất, có rễ Các số trung bình trong cột với các mẫu tự khác nhau thì khác biệt nhau, * chỉ sự khác biệt giữa các nghiệm thức với đối chứng, sự khác biệt có ý nghĩa ở mức p=0,05
Luận án Tiến sĩ Sinh học Trang 71 Trong phần lớn trường hợp, theo Nitsch (1968), cytokinin kích thích khả năng nhân
chồi nhưng không có tác dụng kích thích liên tục do cytokinin chỉ tác dụng ở mức DNA trong giai đoạn tiền xử lý, đồng thời nó lại có khả năng ức chế sự kéo dài chồi và kìm hãm tạo rễ [7]. Do đó, rõ ràng khi áp dụng quy trình nuôi cấy 2 bước của Christoph Wawrosch, giai đoạn bị ức chế kéo dài chồi và kìm hãm tạo rễ đã được rút ngắn sau khi được cảm ứng kích thích tạo chồi trong môi trường có cytokinin trong 2 tuần (thay vì 5 tuần như trong quy trình nuôi cấy 1 bước trong nhân chồi thông thường). So sánh các nghiệm thức NT1, NT2, NT3 với đối chứng NT0, kết quả cho thấy hầu hết các nghiệm thức có áp dụng quy trình nuôi cấy hai bước đều làm tăng số chồi lên cao hơn so với đối chứng, cây con phát triển có khả năng tạo rễ trong khi đối chứng thì không.
Bên cạnh đó, kết quả cũng chứng minh được khả năng nuôi cấy Drosera trong môi trường lỏng: trong giai đoạn đầu của quá trình, khi so sánh NT2 và NT3, kết quả cho thấy rõ việc sử dụng agar trong môi trường nuôi cấy là vô cùng cần thiết bởi vì nếu được cảm ứng tạo chồi ngay trong môi trường lỏng tĩnh, không sử dụng agar, đốt thân sẽ cho tỷ lệ tạo chồi rất thấp, mẫu cấy bị ngập chìm trong môi trường hoàn toàn không có oxy để hấp thụ. Tuy nhiên, ở giai đoạn sau của quy trình, khi so sánh giữa NT1 và NT2, các mẫu được nuôi trong môi trường lỏng có số chồi nhân lên gần gấp đôi (D. indica: 1,39 lần; D. burmanii: 1,67 lần) trên môi trường rắn, đồng thời cũng phát triển và tạo rễ nhiều hơn. Rõ ràng, sau khi được cảm ứng 2 tuần trên môi trường rắn nhờ BA, chồi con được tạo thành với kích thước đủ để có một phần vượt lên khỏi bề mặt dung dịch môi trường lỏng tĩnh đã vượt qua trở ngại thiếu oxy, nhờ đó có thể hấp thụ tối đa dưỡng chất, phát huy hết khả năng nhân chồi, cho tỷ lệ tạo chồi và số chồi trên mẫu cao vượt bậc.
Tóm lại, kết quả thí nghiệm cho thấy rõ được sự cần thiết của việc áp dụng quy trình nuôi cấy lỏng hai bước của Christoph Wawrosch (2009) đối với hai loài Drosera, trong đó ở bước đầu, mẫu cấy buộc phải nuôi trên môi trường có cytokinin (có thể ở dạng rắn, bán rắn, hay lỏng có sục khí) trong 2 tuần, và bước tiếp theo mẫu sẽ được chuyển sang nuôi cấy trong môi trường lỏng tĩnh đã được loại bỏ
Luận án Tiến sĩ Sinh học Trang 72 thành phần cytokinin trong 3 tuần trước khi chuyển sang môi trường tạo rễ. Kết quả
đã mở ra hướng nuôi cấy lỏng cho Drosera, một hướng nuôi cấy dễ dàng hơn, thuận tiện hơn và có khả năng ứng dụng để nuôi cấy với số lượng lớn.