Vật liệu
• Vật liệu nuôi cấy ban đầu: Chồi con Drosera được tái sinh bằng phương pháp nhân giống in vitro ở mục 2.1 có nguồn gốc từ một cây trưởng thành ban đầu ngoại trừ thí nghiệm khảo sát vòng đời.
• Chất chuẩn plumbagin: plumbagin 99,9% (Sigma Aldrich)
• Tiền chất, chất cảm ứng: phenylalanine, tyrosine, acid salicylic, cao nấm men (Merk).
• Môi trường nuôi cấy và điều kiện nuôi cấy: tương tự thành phần môi trường và điều kiện nuôi cấy in vitro đã liệt kê ở phần 2.1.1
Luận án Tiến sĩ Sinh học Trang 52 Phương pháp
Trừ các yếu tố được khảo sát, các yếu tố khác được cố định và giữ nguyên như trong điều kiện nuôi cấy đã nêu ở mục 2.1.1. Tất cả các thí nghiệm khảo sát việc ứng dụng các kỹ thuật tăng năng suất thu nhận hoạt chất trong cây con nuôi cấy ở mục này đều có cùng chỉ tiêu theo dõi là sự tăng trưởng và phát triển cây con thể hiện bằng khối lượng cây tươi và hàm lượng hoạt chất trong nguyên liệu nuôi cấy được xác định bằng phương pháp phổ tử ngoại (UV).
2.3.1 Khảo sát vòng đời in vitro để xác định các giai đoạn tăng trưởng ở Drosera Vòng đời của Drosera in vitro được theo dõi tính từ khi hạt được gieo trong điều kiện nuôi cấy in vitro cho đến khi cây bắt đầu có phát hoa từ đỉnh sinh trưởng. Qúa trình này được chia làm 4 giai đoạn chính: (1) giai đoạn nẩy mầm, (2) giai đoạn tăng trưởng, (3) giai đoạn trưởng thành, (4) giai đoạn lão. Theo dõi và ghi nhận thời gian của từng giai đoạn ở mỗi cá thể trong một quần thể có cùng điều kiện nuôi cấy và trên cùng thành phần môi trường như đã trình bày ở mục vật liệu. Thí nghiệm được lặp lại 3 lần, mỗi lần là một quá trình nuôi cấy và theo dõi độc lập trên một quần thể gồm 15 hạt có khả năng nẩy mầm thành cây con trên các ống nghiệm khác nhau có cùng điều kiện nuôi cấy.
2.3.2 Khảo sát điều kiện nuôi cấy thích hợp cho sự tăng trưởng và tích lũy hoạt chất của cây con
2.3.2.1 Ảnh hưởng của hàm lượng khoáng đa lượng
Thí nghiệm được bố trí theo thể thức hoàn toàn ngẫu nhiên, gồm 5 nghiệm thức với hàm lượng khoáng đa lượng được thay đổi theo các tỷ lệ lần lượt là 1, 1/2, 1/4, 1/8, 0 so với hàm lượng khoáng đa lượng trong thành phần môi trường MS. Mỗi nghiệm thức được lặp lại 3 lần, mỗi lần lặp lại là 1 bình nuôi cấy chứa 100ml môi trường, mỗi bình cấy 10 mẫu cấy ban đầu.
Luận án Tiến sĩ Sinh học Trang 53 2.3.2.2 Ảnh hưởng của ánh sáng
Thí nghiệm được bố trí theo thể thức hoàn toàn ngẫu nhiên, gồm 3 nghiệm thức ánh sáng khác nhau: cây được chiếu sáng đầy đủ (cường độ ánh sáng 2800 ± 200 lux, thời gian chiếu sáng 16 giờ/ ngày), cây được chiếu sáng yếu hơn (cường độ chiếu sáng 800 ± 200 lux, thời gian chiếu sáng 16 giờ/ ngày) và cây được nuôi trong tối hoàn toàn. Mỗi nghiệm thức được lặp lại 3 lần, mỗi lần lặp lại là 1 bình nuôi cấy chứa 100ml môi trường và 10 mẫu cấy ban đầu.
2.3.2.3 Ảnh hưởng của pH môi trường
Thí nghiệm được bố trí theo thể thức hoàn toàn ngẫu nhiên, gồm 3 nghiệm thức môi trường có giá trị pH ban đầu khác nhau: 5,2 (môi trường acid hơn), 5,8 (môi trường thông thường của MS làm đối chứng), 6,4 (môi trường ít acid hơn). Mỗi nghiệm thức được lặp lại 3 lần, mỗi lần lặp lại là 1 bình nuôi cấy chứa 100ml môi trường và 10 mẫu cấy ban đầu.
2.3.2.4 Ảnh hưởng của mật độ cá thể nuôi cấy
Thí nghiệm được bố trí theo thể thức hoàn toàn ngẫu nhiên, gồm 3 nghiệm thức có mật độ cá thể nuôi cấy ban đầu khác nhau: 5, 10, 15, 20, 25 mẫu /100ml môi trường trong bình nuôi cấy có cùng thể tích chứa. Mỗi nghiệm thức được lặp lại 3 lần, mỗi lần lặp lại là một bình nuôi cấy.
2.3.3 Khảo sát tác động của NAA lên sự tăng trưởng và tích lũy hoạt chất của cây con
Thí nghiệm được bố trí theo thể thức hoàn toàn ngẫu nhiên, gồm 6 nghiệm thức có nồng độ NAA bổ sung trong môi trường nuôi cấy ban đầu khác nhau: 0; 0,1; 0,5; 1;
2; 3mg/l. Mỗi nghiệm thức được lặp lại 3 lần, mỗi lần lặp lại là một bình nuôi cấy chứa 100ml môi trường với 10 mẫu cấy ban đầu.
Luận án Tiến sĩ Sinh học Trang 54 2.3.4 Khảo sát tác động của việc bổ sung tiền chất lên sự tăng trưởng và tích lũy
hoạt chất của cây con
2.3.4.1 Ảnh hưởng của việc bổ sung phenylalanine
Thí nghiệm được bố trí theo thể thức hoàn toàn ngẫu nhiên, gồm 6 nghiệm thức có nồng độ phenylalanine bổ sung trong môi trường nuôi cấy ban đầu khác nhau: 0, 0,1; 0,2; 0,3; 0,4; 0,5mM; mỗi nghiệm thức được lặp lại 3 lần, mỗi lần lặp lại là một bình nuôi cấy chứa 100ml môi trường với 10 mẫu cấy ban đầu.
2.3.4.2 Ảnh hưởng của việc bổ sung tyrosine
Thí nghiệm được bố trí theo thể thức hoàn toàn ngẫu nhiên, gồm 6 nghiệm thức có nồng độ tyrosine bổ sung trong môi trường nuôi cấy ban đầu khác nhau: 0; 0,1; 0,2;
0,3; 0,4; 0,5mM; mỗi nghiệm thức được lặp lại 3 lần, mỗi lần lặp lại là một bình nuôi cấy chứa 100ml môi trường với 10 mẫu cấy ban đầu.
2.3.5 Khảo sát tác động của việc sử dụng chất cảm ứng (elicitor) lên sự tăng trưởng và sự tích lũy hoạt chất
2.3.5.1 Ảnh hưởng của việc sử dụng chất cảm ứng acid salicylic
Thí nghiệm được bố trí theo thể thức khối hoàn toàn ngẫu nhiên, thừa số 2 nhân tố với 5 nồng độ acid salicylic khác nhau (0; 0,5; 1; 1,5; 2mg/l) và 4 khoảng thời gian cảm ứng khác nhau (5, 10, 15, 20 ngày), thời điểm bổ sung nhân tố cảm ứng được cố định khi nuôi cấy vật liệu đầu được 6 tuần tuổi (acid salicylic được bổ sung dưới dạng dung dịch sodium salicylate 1M sau khi lọc qua màng lọc vô trùng có đường kớnh 0,2àm). Thớ nghiệm cú tổng cộng 20 nghiệm thức, mỗi nghiệm thức được lặp lại 3 lần, mỗi lần lặp lại là một bình nuôi cấy chứa 100ml môi trường với 10 mẫu cấy ban đầu.
2.3.5.2 Ảnh hưởng của việc sử dụng chất cảm ứng cao nấm men
Thí nghiệm được bố trí theo thể thức khối hoàn toàn ngẫu nhiên, thừa số 2 nhân tố với 5 nồng độ cao nấm men khác nhau (0; 0,5; 1; 1,5; 2mg/l) và 4 khoảng thời gian cảm ứng khác nhau (5, 10, 15, 20 ngày), thời điểm bổ sung nhân tố cảm ứng được
Luận án Tiến sĩ Sinh học Trang 55 cố định khi nuôi cấy vật liệu đầu được 6 tuần tuổi (cao nấm men được bổ sung dưới
dạng dung dịch hòa tan trong nước cất có nồng độ 1mg/1ml sau khi hấp vô trùng), với tổng cộng 20 nghiệm thức, mỗi nghiệm thức được lặp lại 3 lần, mỗi lần lặp lại là một bình nuôi cấy chứa 100ml môi trường với 10 mẫu cấy ban đầu.
2.3.6 Khảo sát tác động cảm ứng của việc gây stress nitrogen lên sự tăng trưởng và tích lũy hoạt chất
Trong thí nghiệm này, chúng tôi khảo sát ảnh hưởng của môi trường thiếu nitrogen như một tác nhân gây stress dinh dưỡng lên sự tăng trưởng và phát triển cũng như sự tích lũy hàm lượng hoạt chất của cây con. Thí nghiệm được bố trí theo thể thức hoàn toàn ngẫu nhiên với 3 môi trường có thành phần nitrogen khác nhau:
(1) môi trường MS cơ bản có đầy đủ thành phần nitrogen (1650mg/l NH4NO3, 1900mg/l KNO3) làm đối chứng,
(2) môi trường MS cơ bản có thành phần nitrogen thiếu NH4NO3 (0mg/l NH4NO3, 1900mg/l KNO3),
(3) môi trường MS cơ bản hoàn toàn không có thành phần nitrogen (0mg/l NH4NO3, 0mg/l KNO3).
Thời điểm cảm ứng stress được cố định khi nuôi cấy vật liệu đầu được 6 tuần tuổi (mẫu cấy ban đầu sau khi được nuôi trong môi trường MS bình thường trong 6 tuần sẽ được chuyển sang môi trường mới với thành phần khác nhau). Thời gian cảm ứng được cố định trong 30 ngày, mỗi nghiệm thức được lặp lại 3 lần, mỗi lần lặp lại là ba bình nuôi cấy chứa 100ml môi trường với 10 mẫu cấy ban đầu.
2.3.7 Kiểm chứng hiệu quả làm tăng năng suất thu nhận hoạt chất lên hệ thống nuôi cấy cây con tái sinh của các kỹ thuật đã khảo sát
Ở mỗi kỹ thuật tăng sinh đã khảo sát, chọn nguyên liệu được tạo thành trong nghiệm thức được xác định là thích hợp nhất cho tăng sinh hoạt chất khi khảo sát bằng phương pháp phổ tử ngoại UV đem kiểm chứng lại bằng phương pháp HPLC.
Dựa trên kết quả định lượng HPLC, một lần nữa có thể đánh giá được hiệu quả của việc ứng dụng các kỹ thuật này.