Góp phần nghiên cứu các hợp chất có hoạt tính sinh học trong thân rễ cây ngải tiên bousigon (hedychium bousigonianum pierre ex gagn)

Góp phần nghiên cứu hợp chất có hoạt tính sinh học thân rễ ngải tiên Bousigon (Hedychium Bousigonianum Pierre ex Gagn) Đỗ Thị Hiền Trường Đại học Khoa học Tự nhiên Luận văn ThS ngành: Hóa hữu cơ; Mã số: 60 44 27 Người hướng dẫn: PGS.TS Văn Ngọc Hướng Năm bảo vệ: 2012 Abstract Nghiên cứu tinh dầu thân rễ ngải tiên bousigon Nghiên cứu qui trình chiết chọn lọc hợp chất có hoạt tính sinh học thân rễ ngải tiên bousigon Khảo sát hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định sản phẩm chiết Nghiên cứu phân lập γ - lacton α, β không no cặn chiết từ thân rễ ngải tiên bousigon Khảo sát invitro hoạt tính gây độc tế bào loại ưng thư sản phẩm phân lập Xác định cấu trúc phân tử chất phân lập Keywords Hóa hữu cơ; Hợp chất; Cây ngải tiên; Hoạt tính sinh học Content Nước ta nằm vùng khí hậu nhiệt đới gió mùa nên hệ thực vật vô đa dạng phong phú đặc biệt có tinh dầu làm thuốc Theo thống kê bước đầu, nước ta có 600 lồi có tinh dầu, phần lớn chưa nghiên cứu đầy đủ, hệ thống triệt để Hệ thực vật phong phú đa dạng vùng, quốc gia xem nguồn tài ngun q giá, có quan hệ trực tiếp tới đời sống người Hóa học hợp chất thiên nhiên với vai trị nghiên cứu thành phần hóa học tìm hiểu hoạt tính sinh học thuốc mang ý nghĩa khoa học thực tiễn Việc nghiên cứu hợp chất có hoạt tính sinh học thuốc dân tộc vấn đề hấp dẫn khoa học mà cịn đóng góp cho việc sử dụng thuốc có hiệu hơn, xác Góp phần phong phú cho hệ thực vật Việt Nam, lại gần gũi với đời sống nhân dân phải kể đến họ gừng (Zingiberaceae) Nhu cầu sử dụng sản phẩm từ họ gừng làm thuốc hương liệu giới nước ngày tăng Các nghiên cứu họ gừng đến nhiều ln điều hấp dẫn với nhà nghiên cứu Trong họ gừng có chi mà Việt Nam chưa nghiên cứu rộng rãi chi ngải Hedychium Trong giới với nhiều nghiên cứu báo cáo chi hấp dẫn hương thơm hoa hợp chất có hoạt tính sinh học thú vị thuộc dãy  - lacton diterpen ,  không no Đây hợp chất có hoạt tính chống ung thư, chống viêm mạnh nhà khoa học giới quan tâm cách đặc biệt Với định hướng chúng tơi chọn đề tài: “ Góp phần nghiên cứu hợp chất có hoạt tính sinh học thân rễ ngải tiên bousigon ( Hedychium bousigonianum Pierre ex Gagn) ” Hedychium (chi ngải) chi thuộc họ gừng (Zingiberaceae) gồm lâu năm phổ biến với chiều cao phát triển khoảng 120 – 180 cm Chi thường gọi với tên chi hoa loa kèn gừng chi loại thân thảo, thân rễ mập phân nhánh Chi có nguồn gốc từ vùng đất nhiệt đới Châu Á dãy Himalaya Các lồi chi thường có hoa đẹp, rực rỡ hấp dẫn mùi hương Tại Nam Á, chi Hedychium có 80 lồi Các nghiên cứu gần báo cáo có 41 lồi Ấn Độ, có 17 lồi đặc hữu Ấn Độ Ba loài chi Hedychium từ Thái Lan nhận dạng phân lập năm 1995 H samuiense, H tomentosum H biflorum Theo ―Cây cỏ Việt Nam‖ Phạm Hồng Hộ Việt Nam chi Hedychium có 12 lồi, phân bố hầu hết tỉnh từ Bắc chí Nam Về thành phần tinh dầu có cơng trình Nguyễn Thị Thủy cộng nghiên cứu thân rễ Ngải tiên Cây Ngải tiên (Hedychium coronarium Koenig) mọc tự nhiên huyện Sapa, tỉnh Lào Cai, đem trồng trại Thực nghiệm viện Sinh thái Tài nguyên Sinh Vật (Cổ Nhuế, Từ Liêm, Hà Nội) từ năm 2000 thu hoạch cuối năm 2002 để nghiên cứu Thành phần hoá học tinh dầu biết gồm thành phần 1,8 - Cineol - 43,32%,  - Pinen - 25,45%,  Pinen - 10,32%, 3- Cyclohexen- 1-methanol - 5,29% [5] Mới đây, vào tháng 11 năm 2011, tạp chí Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters, Phan văn Kiệm cộng công bố nghiên cứu hợp chất phân lập từ thân rễ ngải tiên Sapa – Việt Nam Trong báo cáo này, họ phận lập ba labdane loại diterpenes mới, đặt tên coronarins G,H,I hợp chất biết đến là: coronarin D, coronarin D methyl ether, hedyforrestin C, (E)-nerolidol, -sitosterol, daucosterol, stigmasterol Các hợp chất từ có tác dụng ức chế sản xuất cytokine tế bào gai có nguồn gốc từ tủy xương tác nhân gây viêm tiền gây viêm giải phóng bị kích thích LPS (lypopolysacchride) Trong số hợp chất này, hợp chất coronarins D, G, H chất ức chế đáng kể tới LPS kích thích TNF-, IL-6 IL-12 p40 sản xuất với IC50 khác nhau, từ 0,19 ± 0,11 ; 10,38 ± 2,34 M.[16] Ba hợp chất phân lập (1-3 : coronarins G,H,I) Cây ngải tiên bousigon, tên khoa học Hedychium bousigonianum Pierre ex Gagn, thuộc họ Gừng ( Zingiberaceae) Hedychium bousigonianum Pierre ex Gagn có nguồn gốc từ vùng Himalayas Nepal Ấn Độ sau phát tán tới khu vực Nam châu Phi Nam Mỹ Lồi cịn phân bố Nam Trung Quốc, Malaixia, Úc Việt Nam Cây mọc vùng có khí hậu mát lạnh Thân cỏ, cao 1-1,2 m Căn hành to – mm Lá có phiến thon hẹp, nhọn, dài 30 – 50 cm, rộng cm, khơng lơng Gié thưa, dài 20 cm; hoa có lông, dài 2,5 cm; hoa to, vàng; tiểu nhụy lép hẹp, dài 4cm; mơi xoan, chẻ đến ½; nỗn sào có lơng Thường mọc rừng Đà Lạt Hình 1.1: Thân rễ ngải tiên Bousigon Các loài chi Hedychium hấp dẫn hương thơm hoa hợp chất có hoạt tính sinh học thú vị thuộc dãy  - lacton diterpen ,  không no Đặc biệt γlacton α, β không no thuộc dãy labdan Các hợp chất theo Kumakara AB cộng hợp chất tác dụng ức chế tạo thành tác nhân gây ưng thư nhiều bệnh nguy hiểm khác NF-kB hoạt động mà cịn có tác dụng ức chế hoạt động tác nhân gây bệnh tật Chính đặc tính lưỡng dụng mà γ-lacton α, β không no thuộc dãy labdan ditecpen đối tượng nhà khoa học giới đặc biệt quan tâm nghiên cứu Chúng quan tâm hợp chất tìm kiếm thuộc chi Ngải (Hedychium) Trong cơng trình trước chúng tơi nghiên cứu labdan ditecpen có hoạt tính gây độc tố tế bào ưng thư ngải tiên (Hedychium coronarium Koen) [6] Trong cơng trình chọn ngải tiên Bousigon tên đề tài: “Góp phần nghiên cứu hợp chất có hoạt tính sinh học thân rễ ngải tiên bousigon ( Hedychium bousigonianum Pierre ex Gagn) ‖ Mục tiêu đề tài a Nghiên cứu thành phần hóa học thân rễ ngải tiên bousigon b Nghiên cứu, phân lập, xác định cấu trúc phân tử hoạt tính chống ung thư  - lacton ,  không no dãy labdan diterpene thân rễ ngải tiên bousigon Nhiệm vụ đề tài Nghiên cứu tinh dầu thân rễ ngải tiên bousigon Nghiên cứu qui trình chiết chọn lọc hợp chất có hoạt tính sinh học thân rễ ngải tiên bousigon Khảo sát hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định sản phẩm chiết Nghiên cứu phân lập  - lacton ,  không no cặn chiết từ thân rễ ngải tiên bousigon Khảo sát invitro hoạt tính gây độc tế bào loại ưng thư sản phẩm phân lập Xác định cấu trúc phân tử chất phân lập Mẫu thực vật phương pháp xử lí: Nguyên liệu thân rễ ngải tiên bousigon (Hedychium bousigonianum Pierre ex Gagn) Tiến sĩ Nguyễn Quốc Bình Bảo Tàng thiên nhiên Việt Nam cung cấp giám định Mẫu thân rễ ngải tiên bousigon lấy tỉnh Vĩnh Phúc vào tháng năm 2011 Sau thu mua về, mẫu rửa đất cát, loại bỏ phần thối rữa, hư hỏng thái ngang thân rễ thành lát dày 1- mm, nghiền thành bột cỡ hạt – mm bảo quản tủ lạnh để tiến hành nghiên cứu - Từ 0,2 kg nguyên liệu khô chuẩn bị cho nghiên cứu phần tinh dầu - Từ 3,6 kg nguyên liệu tươi chuẩn bị cho nghiên cứu hoạt chất sinh học Điều chế tinh dầu thân rễ ngải tiên bousigon a/ Cho 0,2 kg nguyên liệu (đã chuẩn bị phần 2.3.1) 2,5 lít dung dịch NaCl 10% cho vào bình cất A thiết bị chưng cất đặc biệt (hình 2.1) có bẫy tinh dầu D 60ml dung mơi toluen A: Bình cất B: Ống nối C: Sinh hàn D: Bẫy tinh dầu E: Khóa Hình 2.1: Thiết bị cất nước hồi lưu Đun hồi lưu 03 giờ, lấy toluen bẫy cất lấy dịch dầu – nước âm tính với KmnO4 0,2% b/Bão hòa dịch dầu-nước cất NaCl chiết 03 lần toluen lần 100ml c/ Gộp lượng toluen lấy bẫy chiết với lượng dịch chiết toluen từ dịch dầu nước,, làm khô Na2SO4, cất loại dung mơi, thu hồi tinh dầu, giữ lọ kín bảo quản tủ lạnh trước xác định thành phần hoá học nghiên cứu khác Hàm lượng tinh dầu tính tỉ lệ phần trăm khối lượng tinh dầu khối lượng mẫu khô (gam) Kết 0,5g tinh dầu Tính hiệu suất 0,25% Tinh dầu có màu vàng chanh nhạt, mùi thơm dễ chịu, hấp dẫn Chiết hợp chất có hoạt tính sinh học thân rễ ngải tiên bousigon : a/ Từ 3,6 kg nguyên liệu tươi chuẩn bị phần 2.3.1, ngâm vào 10 lít etanol 96% ba ngày, lọc Busne, ngâm tiếp lần nữa, lần 1,5 lít EtOH 96% lọc Busne Gộp dịch chiết etanol, thu 10 lít dịch lọc b/ Cơ dịch lọc cách đun cách thủy đến 1/6 thể tích Thêm vào thể tích nước bão hịa muối chiết lần n – hexan Lần : 150 ml Lần 2: 150 ml Lần 3: 150 ml Gộp dịch chiết n – hexan, làm khô Na2SO4, cất loại dung môi cách thủy thu cặn H, 3gam Hiệu suất 0.088% tính theo nguyên liệu tươi c/ Sau chiết n – hexan, dịch chiết tiếp diclometan, tiến hành lần, lần 100 ml, thu dịch diclometan Làm khô Na2SO4 khan, cất cách thủy để loại dung môi thu cặn C khối lượng gam, hiệu suất 0.11 % tính theo nguyên liệu tươi d/ Sau chiết diclometan, dịch chiết tiếp etylaxetat, tiến hành lần, lần 100 ml, thu dịch etyaxetat Làm khô Na2SO4 khan, cất cách thủy để loại dung môi thu cặn E khối lượng gam, hiệu suất 0.027 % tính theo nguyên liệu tươi Thử hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định (Antimicrobial activity) Theo phương pháp đại Vanden Bergher Vlietlink (1994) tiến hành phiến vi lượng 96 giếng, kháng sinh kiểm định bao gồm: Ampixilin, Tetracylin, Amphoterilin B Nystatin.Các chủng vi sinh vật kiểm định bao gồm nhóm: - Vi khuẩn Gr (-): Escherichia coli (ATCC 25922);Pseudomonas aeruginosa (ATCC 25923) - Vi khuẩn Gr (+) : Bacillus subtillis (ATCC 27212); Staphylococcus aureus (ATCC 12222) - Nấm mốc : Aspergillus niger (439); Fusarium oxysporum (M42) - Nấm sợi : Candida albicans (ATCC 7754); Saccharomyces cerevisiae (SH20) Phân tích nhận biết thành phần tinh dầu thân rễ ngải tiên bousigon: Đối với chất lỏng dễ bay nhiệt độ sôi thấp tinh dầu phương pháp đại để phân tích nhận biết thành phần phương pháp sắc kí khí kết hợp với khối phổ Theo phương pháp này, chạy theo chương trình nhiệt độ: Nhiệt độ đầu 900C, gia nhiệt 50C /phút đến 2800C máy GC-6890 MS-5973, xác định tinh dầu thân rễ ngải tiên bousigon khơ có 45 thành phần (xem phụ lục số 1), nhận dạng 21 thành phần thành phần có độ trùng lặp phổ khối 90% so với phổ khối chất thư viện máy (xem bảng 3.1) Bảng 3.1: Các thành phần Tinh dầu thân rễ ngải tiên bousigon vùng Vĩnh Phúc Thời gian Hàm Độ trùng STT Tên chất lưu lượng (%) lặp(%) 4.29 Iso-amylacetate 0.27 90 8.11 99 1,8-cineole 6.49 9.38 Linalool oxid 0.67 91 9.87 Trans-Linalool oxid 0.60 91 10.32 97 Linalool 22.31 12.43 Borneol L 1.15 90 12.80 14,66-terpinen-4-ol 1.1 93 13.27 91 α-terpineol 3.0 13.39 15,56-myrtenal 0.84 97 10 13.45 Myrtenal bicyclo 1.84 96 11 16.83 19,94 perilla ancol 0.41 95 12 17.09 20,14 carvacrol 0.69 93 13 24.40 Piperitenone 0.28 93 14 26.38 12-oxabicyclo[9,1,0]dodeca 1.06 91 15 27.07 Widdrene cyclopvopa[d]naphth 0.50 90 16 27.96 97 β-tumerone 4.90 17 28.79 36,48 -germacrone 1.01 99 18 29.90 91 37,94-zerubone 25.15 19 30.08 Drim-8-en-11-all-1-naphthalen 0.57 90 20 30.15 38,47 oxobisabolene 0.34 97 21 35.60 1,2-benzenedicarboxylic axit 0.65 94 Cộng 73.83 Kết cho thấy số thành phần xác định chiếm 73.83%; 26.17% tinh dầu chưa xác định thành phần Đây điều thú vị tinh dầu ngải tiên bousigon, cần nghiên cứu tiếp tục chiếm 1/4 lượng tinh dầu Khi so sánh thành phần tinh dầu thân rễ ngải tiên bousigon trồng Vĩnh Phúc với thành phần tinh dầu ngải tiên trồng Sapa, chúng tơi thấy có giống khác thành phần hàm lượng thành phần Điều thể bảng 3.2 Bảng 3.2: So sánh số thành phần tinh dầu thân rễ ngải tiên Sapa tinh dầu thân rễ ngải tiên bousigon Vĩnh Phúc Thành phần Loại (%) Tinh dầu Tinh dầu ngải tiên SaPa Tinh dầu ngải tiên bousigon Vĩnh phúc Linalool αβ37,94Nerollidol Terpineol tumerone zerubone 1,8-cineole 23,44 12,14 - 11,86 - 2,23 22,31 3,0 4,9 - 25,15 6,49 Sự khác biệt phương pháp điều chế, thổ nhưỡng khí hậu, mùa lấy mẫu lồi Chiết chọn lọc chất có hoạt tính sinh học thân rễ ngải tiên bousigon Sau chiết chọn lọc chất có hoạt tính sinh học thân rễ ngải tiên bousigon dụng môi n-hexan, diclometan etylaxetat cho thấy thân rễ ngải tiên bousigon hàm lượng chất không phân cực hay phân cực thấp, 0,088% tính theo nguyên liệu tươi; hàm lượng chất có độ phân cực trung bình cao: 0,11% 0.027% tính theo nguyên liệu mẫu tươi Đây điều mong ước chúng tơi Khảo sát hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định cặn chiết thân rễ ngải tiên bousigon Chúng tiến hành khảo sát hoạt tính kháng khuẩn mẫu cặn chiết H, C, E từ thân rễ ngải tiên loại vi sinh vật kiểm định (VSVKĐ) thuộc nhóm khác nhau: Gram (+), Gram (-), nấm mốc, nấm men theo phương pháp thử đại Vanden Bergher Vliethin Gah Kết thử bảng 3.3 Bảng 3.3 : Hoạt tính kháng VSVKĐ cặn chiết thân rễ ngải tiên bousigon VSVKĐ Mẫu Cặn C Cặn H Cặn E Vi khuẩn Gr(-) P E Arugin coli osa 200 (-) 200 (-) 200 (-) Nồng độ ức chế tối thiểu (MIC: g/ml) Vi khuẩn Gr(+) Nấm mốc B subtillis S aureus Asp niger F Oxysporum 100 100 100 (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) Nấm men S C cerevis Albicans iae (-) (-) (-) (-) (-) (-) Dấu (-) : khơng có hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định Kết cho cặn chiết từ thân rễ ngải tiên Bousigon có hoạt tính chống loại vi khuẩn gây bệnh đường ruột E.coli gây bệnh tiêu chảy B.subtullis gây bệnh viêm đạ tràng Khảo sát cặn chiết H C SKLM tiến hành khảo sát cặn chiết H SKLM với hệ dung môi n – hexan/EtOAc, 9/1,v/v; cặn C với hệ dung môi n – hexan/diclometan, 1/9,v/v hai thuốc vanilin/H2SO4 1% FeCl3 1M (pH = 4) Kết bảng 3.4 3.5 TT Rf 0,0 0,33 0,37 0,46 0,50 0,80 0,83 0,93 TT Rf 0,0 0,23 0,42 0,46 0,57 0,61 0,75 Bảng 3.4: Kết khảo sát cặn H SKLM Vanilin/H2SO4 FeCl3 1M Nguội Nóng Nguội Nóng Vàng Nâu đen Không màu Nâu Xanh sẫm Đen Không màu Xanh đậm Xanh sẫm Đen Không màu Nâu Nâu Đen Không màu Nâu Hồng Xanh đen Không màu Xanh đậm Hồng Tím hồng Khơng màu Khơng màu Nâu Đen Không màu Không màu Đen Đen Không màu Đậm Bảng 3.5 Kết khảo sát cặn C SKLM Vanilin/H2SO4 FeCl3 Nguội Nóng Nguội Xanh đen Đen Khơng màu Xanh đen Đen Khơng màu Tím Tím hồng Khơng màu Nâu Xanh mờ Khơng màu Khơng màu Tím mờ Khơng màu Khơng màu Xám Khơng màu Hồng Hồng tím Khơng màu Nóng Khơng màu Khơng màu Khơng màu Xanh đậm Khơng màu Không màu Không màu Kết cho thấy cặn chiết H phức tạp, có thành phần có thành phần lacton dạng este có Rf = 0,5 0,33 xanh đen với FeCl3 1M (pH =4) nóng Cịn cặn C phức tạp hơn, có thành phần có tới thành phần màu xanh đen với FeCl3 đun nóng, khơng màu nguội, thành phần lacton este Phân lập chất tinh khiết cặn chiết H cặn C Đối với hợp chất có nhiệt độ sơi cao, phương pháp phân lập tốt phương pháp sắc kí cột Hiệu phương pháp phụ thuộc vào nhiều yếu tố: tỉ lệ chất cần phân tách chất hấp phụ, hoạt tính chất hấp phụ, kích thước cột, phương pháp rửa cột dung môi rửa cột… Chúng phân lập chất lacton cặn H chiết từ thân rễ ngải tiên bousigon, kích thước cột 2,5 x 70 cm dung môi rửa cột n- hexan/EtOAc 9/1, v/v, tốc độ rửa ml/phút Kiểm tra thu gom sản phẩm SKLM Kết phân lập chất kí hiệu HB1, HB2, HB3 HB5 Tương tự với dung môi rửa cột n – hexan/diclometan, 1/9,v/v từ cặn chiết C phân lập chất HB7, có Rf = 0,76 dung môi CH2Cl2/CH3OH, 7/3, v/v Như phân lập chất tinh khiết từ cặn chiết từ thân rễ ngải tiên bousigon Xác định cấu trúc phân tử hợp chất HB3 Hợp chất HB3, dạng dầu không màu, Rf =0,45 (n- hexan/EtOAc 9/1, v/v), màu xanh đen với FeCl3 1M (pH=4) Phổ IR HB3 cho thấy phân tử có vịng -lactone có vị trí , - chưa no có C=O 1762 cm-1 C=C 1681 cm-1; nhóm exo- methylene C=C 1641 cm-1 , C-H 954 cm-1 nhóm ete C –O-C = 1118cm-1 Phổ 1HNMR) thấy tín hiệu nhóm methyl (H = 0,68 ppm; 0,78ppm; 0,85ppm) H exo-methylene (H = 4,32ppm; 4,37ppm 4,77ppm) Quan sát phổ 13C – NMR cho thấy Cacbon olefin vùng 107 – 147 ppm cặp đôi cacbon olefin liền kề có cường độ Tổng số cacbon hai đồng phân 42 Trong có nhón CH, 15 nhóm CH2, nhóm CH3) Tất kiện cho phép nghĩ đến cặp đồng phân epime metyl coronarin D ete Điều khẳng định thêm nhờ phổ khối HB3 có pic ion phân tử m/z = 331,7 (M+) , với phân mảnh có điểm ion m/z = 300,7 (M+ – CH3OH) Tất thỏa mãn với công thức phân tử C21H32O3 Số liệu phổ HB3 ghi bảng 3.8 công thức cấu tạo HB3 hình O 12 13 11 20 10 19 14 17 15 16 O O 21 H 18 Hình 3.1 Cơng thức cấu tạo HB3 – metyl coronarin D ete Bảng 3.6 Số liệu phổ 13C hợp chất HB3 Số liệu phổ 13C hợp chất HB3 Nguyên tử C HB3/a HB3/b 39,19 39,35 19,231 19,231 41,919 41,919 32,844 32,798 55,300 55,253 24,020 23,999 37,704 37,704 147,731 147,974 56,056 56,056 39,348 39,197 10 25,327 25,327 11 142,562 142,700 12 124,148 124,079 13 32,844 32,798 14 100,934 100,934 15 169,538 169,538 16 107,249 107,560 17 33,308 33,458 18 21,630 22,540 19 14,005 14,231 20 14,260 14,849 21 Xác định cấu tạo phân tử hợp chất HB5 Hợp chất HB5 tinh thể hình kim, màu trắng Rf= 0,79 ( n- hexan/EtOAc, 3/7,v/v), màu xanh đen với FeCl3 1M (pH = 4) đun nóng Phổ IR HB5 cho thấy có vịng - lacton , khơng no (C=O 1751 cm-1, liên kết đơi nhóm có C=C 1643 cm1 , C-H =829 cm-1); có liên kết đơi nhóm dạng E ( exo – metylen) với C=C 1603 cm-1, C-1 H 900 cm Trên phổ 13 C – NMR DEPT cho thấy rõ phân tử HB5 có 20 nguyên tử C, có nhóm metin olefin vùng trường yếu 120 – 145 ppm, nhóm metin Cacbon bậc no vùng 55 – 65 ppm, nhóm metylen đặc biệt nhóm exo metylen có C = 108,40 ppm Khối phổ HB5 cho pic M+ = 300,6 Từ số liệu suy công thức phân tử HB5 C20H28O2 độ bội liên kết Vì phân tử hợp chất HB5 có 20 nguyên tử cacbon, có vịng - lacton , khơng no, nhóm exo – metylen nhóm metyl vùng trường mạnh nên suy diterpen dựa vào qui luật đầu đuôi đặc điểm phổ xây dựng khung labdan Những kiện cho phép khẳng định HB5 Villosin có cơng thức hình 3.1 Các số liệu phổ 1H 13C-NMR bảng 3.6 Số liệu phổ HB5 tương ứng với số liệu phổ villosin công bố tài liệu 26 Hình 3.2 Cơng thức cấu tạo HB5 - Villosin Bảng 3.7 Số liệu phổ 1H 13C-NMR hợp chất HB5 Vị C (ppm) Độ bội, J(Hz) C (ppm) H (ppm) trí C HB5 villosin [26] HB5 HB5 40,83 40,9 1,00; 1,40 m 19,11 19,1 1,49; 1,46 m 42,30 42,3 1,51; 1,21 m 33,57 33,6 54,75 54,8 1,09 dd(2,68; 2,68) 23,38 23,4 1,71; 1,38 m 36,75 36,8 2,45; 2,08 m 149,40 149,4 62,22 62,2 2,37 m 10 39,29 39,3 11 136,87 136,9 6,89 dd(10,13; 10,13) H (ppm) villosin [26] 1,00; 1,45 1,40; 1,51 1,18; 1,40 1,09 1,71; 1,39 2,08; 2,44 2,37 6,90 12 13 14 15 16 17 18 19 20 120,66 129,55 142,34 69,56 172,31 108,40 33,38 21,93 15,05 120,7 129,6 142,3 69,6 172,3 108,4 33,6 22,0 15,1 6,10 d (15,84) 6,11 7,14 4,8 br_s d(1,6) 7,15 4,80; 4,5; 4,76 0,89 0,84 0,87 d(1,7); d(1,7) s s s 4,51; 4,76 0,89 0,84 0,87 Xác định cấu trúc phân tử hợp chất HB7 Hợp chất HB7 chất rắn, màu trắng, điểm nóng chảy 164oC Rf= 0,76 (CH2Cl2/CH3OH, 7/3,v/v), màu xanh đen với Vanilin/H2SO4đ Phổ IR HB7 OH= 3542.06 cm-1, 3391.40 cm-1 C=O =1710.80cm-1; liên kết đôi nhóm C=C =1640.30 cm-1 ; C-O-C vịng piran không no 1073.52 cm-1 Trên phổ 13 C – NMR DEPT cho thấy rõ phân tử HB7 có 17 nguyên tử C, có 10 nhóm CH, nhóm CH2, nhóm CH3 có 3C khơng liên kết trực tiếp với H Khối phổ HB7 cho pic M+ = 387.4 Từ số liệu suy công thức phân tử HB7 C17H24O10 Qua phân tích phổ 13 C – NMR HB7 thấy rõ nguyên tử C nhân pyrano-Dglucose vùng dịch chuyển từ 70-77ppm, cacbon anome 98.6, H anome có δH=4.53ppm nhóm etylencacbinol δH=3.06ppm, δC=66.99ppm Điều cho thấy HB7 glucosit Lấy công thức phân tử HB7 ( C17H24O10) trừ phần glycon C6H11O5 ta phần cịn lại C11H13O5 Trong có nhóm chức: OH, C=O, C=C ba nhóm thế, C-O-C vịng pyran khơng no, nhóm CH, nhóm CH2, nhóm CH3 C khơng liên kết với H Tổng số vịng liên kết đơi aglycose Phổ H – NMR HB7 cho thấy có nhóm proton olefin δH=7.46ppm δH=5.68ppm có nhóm metoxyl δH=3.64ppm δC=51.02ppm Vì có nhóm >C=O nên số vịng số liên kết đơi cịn lại 4, có vịng piran Vậy vịng khơng no Từ dự kiện chúng tơi xây dựng cơng thức aglycon hình COOCH3 O HO H O* Hình 3.3: Cấu tạo agycon Ghép với phần D-glucosit ta công thức HB7 hình O 11 O 12 CH3 6' OH HO 10 O O O 1' 5' OH 4' 2' 3' OH OH Hình 3.4: Cấu tạo HB7 Cấu tạo HB7 thể rõ phổ: IR, FAB-MS, 1H-NMR, 13C-NMR, DEPT, HSQC, HMBC Ở thấy rõ trước hết liên kết glucosit C1, với C1 qua H thể phổ HMBC có tương tác H1, với C1 H1 với C1 hiệu ứng thuận từ điện tử π điện tử chưa chia sẻ oxi mà cacbon nhóm >C=O trường thấp nhất, cịn nhóm CH vị trí trường cao δH-3=7.46ppm δC-3=151.58ppm Dưới ảnh hưởng điện tử π liên kết đơi mà nhóm metin vị trí trường yếu: δH-7=5.68ppm δC-7=125.55ppm Cũng lý luận tương tự δC-4=110.95ppm δC-8=144.07ppm Các số liệu 1H-NMR, 13C-NMR HB7 bảng Bảng 3.8 Số liệu phổ 1H 13C-NMR chất HB7 13 Vị trí C-NMR H-NMR C δC:ppm δH Độ bội 95.76 5.12 dd 151.59 7.46 br.s 110.95 34.58 3.10 brdd 37.88 3.70 m 125.51 5.68 br,s 144.07 45.88 2.64 t 10 59.35 4.13 br d 3.97 br d 11 166.82 12 51.03 3.64 s 1’ 98.63 4.53 d 2’ 73.31 4.71 t 3’ 76.63 5.03 t ’ 69.99 4.46 t ’ 77.24 4.7 m 6’ 60.99 3.06 dd Nhóm CH CH J.Hz 6.8; 7.2 CH CH2 CH 6.3; 7.3 CH CH CH 7.3 14.5 14.6 CH3 CH CH CH CH CH CH2 8.0 5.4 5.9 5.7 4.9; 5.3 Theo công thức ngồi 5C bất đối phần glucose cịn có 3C bất đối phần aglycon: C-1, C-5, C-9 Như số đồng phân quang học lớn Để xét cấu dạng HB7 xét phổ 1H-COSYGP (phụ lục 25a, 25b, 25c, 25d) Phổ cho thấy rõ tương tác H-5 với H-9 (hình vng ABCD) có J=6.8 Hz H-9 với H-1 (hình vng AEFG) có J=7.3 Hz Sự tương tác Vicial spin-spin có số tương tác J lớn nên chúng tương tác axial-axial Điều có nghĩa proton vị trí axial hình 3.4a 3.4b Như HB7 dạng thuyền (hình 3.4a) dạng ghế (hình 3.4b) Chúng tơi chưa có số liệu khẳng định dạng suy đốn HB7 dạng 3.4a dạng liên đơi dạng E, dạng nhóm lớn nằm vị trí trans với nên có ảnh hưởng hiệu ứng khơng gian hơn, bền dễ tồn Vậy HB7 geniposide OH 6' 5' H OH 10 1' O H OH H OH 2' 2O 4' OH 3' O H H3C O H O Hình 3.4a OH H HO 6' 5' 10 1' H H H H O O 2' 4' 3' OH OH OH O H3C 11 O O Hình 3.4b Khảo sát hoạt tính chống ung thư hợp chất HB5(villosin) phân lập từ thân rễ ngải tiên bousigon Villosin có nhiều cơng trình nghiên cứu hoạt tính chống ung thư Các loại ung thư như: ung thư gan Hep-G2, ung thư phổi A 549, ung thư thần kinh SK – N – SH, ung thư vú MCF – 7, ung thư cổ tử cung HeLa [18, 33] thử nghiệm Nhưng dòng ung thư phổi Lu, ung thư vân tim RD chưa thử nghiệm Chúng tơi khảo sát hoạt tính gây độc tế bào ung thư villosin phân lập từ thân rễ ngải tiên bousigon Vĩnh Phúc với dòng tế bào ung thư: ung thư gan (Hep-G2), ung thư phổi (Lu) ung thư vân tim (RD) theo phương pháp Skehan cộng (1993), Likhiwitayawuid cộng (1993); phương pháp áp dụng viện ung thư quốc gia Mỹ (NCI) Kết bảng 3.9 bảng 3.10 TT Bảng 3.9 Hàm lượng tế bào ung thư sống sót sau thử Các tế bào cịn sống sót CS (%) Ký hiệu mẫu Hep-G2 Lu RD DMSO 100,0±0,0 100,0±0,0 100,0±0,0 Chứng (+) 2,2±0,0 1,8±0,04 0,30±0,03 HB5 0,0±0,0 8,4±0,10 0,00±0,00 Kết luận HB5 dương tính tính dịng TT Bảng 3.10 Cường độ gây độc tế bào ung thư Nồng độ gây độc IC50 (g/ml) Ký hiệu mẫu Hep-G2 Lu RD Chứng (+) 0,257 0,312 0,188 HB5 0,788 0,969 0,675 0,325 0,675 0,476 Kết luận HB5 dương tính dòng Từ kết bảng cho thấy, mẫu HB5 (villosin) mà chúng tơi phân lập có tác dụng gây độc tế bào ung thư mạnh dòng ung thư người ung thư gan Hep-G2 ( IC50 0,78 microgam/ml), ung thư phổi Lu(IC50 0,96 microgam/ml) ung thư vân tim RD ( IC500,67 microgam/ml) KẾT LUẬN Tài liệu giới nghiên cứu ngải tiên bousigon chưa có, chúng tơi người nghiên cứu ngải tiên bousigon (Hedychium bousigonianum Pierr ex Gagn) trồng Vĩnh Phúc có kết luận sau: Đã xây dựng quy trình cất tinh dầu thân rễ ngải tiên bousigon cho hiệu suất tốt 0,25% tính theo ngun lệu khơ Đã phân tích thành phần tinh dầu thân rễ ngải tiên bousigon nhận biết 21 thành phần số 45 thành phần tinh dầu, có thành phần có hàm lượng lớn là: Linalool: 22.31% 37,94-zerubone: 25.15% Xây dựng quy trình chiết phân lớp chất thân rễ ngải tiên bousigon theo độ phân cực tăng dần dung môi n-hexan, diclometan etylaxetac khảo sát hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định cặn chiết Kết cho thấy cặn chiết có tác dụng chống vi khuẩn đường ruột E.coli B.subtillis Đã khảo sá cặn chiết sắc ký lớp mỏng phân lập chất tinh khiết từ cặn chiết n-hexan diclometan sắc ký cột Đã xác định cấu trúc phân tử chất phân lập phương pháp phổ đại villosin, epimer ete metyl coronarin D geniposide Khảo sát hoạt tính gây độc tế bào villosin dòng tế bào gây ưng thư gan Hep-G2, ung thư phổi Lu ung thư vân tim RD nhận thấy Villosin có hoạt tính gây độc tế bào mạnh dòng ung thư References TIẾNG VIỆT Đỗ Huy Bích, Đặng Quang Chung, Bùi Xuân Chương, Nguyễn Thượng Dong, Đỗ Trung Đàm, Phạm Văn Hiển, Vũ Ngọc Lộ, Phạm Duy Mai, Phạm Kim Mãn et al (2004), Cây thuốc động vật làm thuốc Việt Nam, tập I, Nxb KH&KT Hà Nội, tr 141-143 Bộ Y tế (2002), Dược điển Việt Nam, Nxb Y học, Hà Nội, tr 141 Võ Văn Chi (1997), Từ điển thuốc Việt Nam, Nxb Y học, TP HCM, tr 821 Phạm Hoàng Hộ (1993) Cây cỏ Việt Nam, NXB Montreal, tâ ̣p 3, tr 558 – 562 Nguyễn Thị Thuỷ, Nguyễn Thị Phương Thảo, Trương Anh Thư, Bùi Văn Thanh (2003)― Thành phần hoá học tinh dầu Ngải tiên (Hedychium coronarium Koenig)‖, Viện Sinh thái & Tài nguyên Sinh vật, Viện KH& CNVN 6 Văn Ngọc Hướng, Nguyễn Thị Mai Phương, Lê Anh Tuấn, Vương Văn Trường (2012) ―Góp phần nghiên cứu hợp chất labdan ditecpen có hoạt tính gây độc tế bào ưng thư thân rễ ngải tiên (Hedychium coronarium Koen)‖, Tạp chí dược học 429, tr.37-41 TIẾNG ANH Aziz M A., Habib M R., Karim M R., (2009) ― Antibacterial and Cytotoxic Activities of Hedychium coronarium J Koenig‖ , Research Journal of Agriculture and Biological Sciences, 5(6), pp 969-972 Boukouvalas J., Wang Jian-Xin and Marion O., (2007) ― Expedient synthesis of villosin and its isomer (E)-labda-8(17),12,14-trien-15(16)-olide‖, Tetrahedron Letters,48, pp 7747–7750 Chimnoi N, Pisutjaroenpong S, Ngiwsara L, Dechtrirut D, Chokchaichamnankit D, Khunnawutmanotham N, Mahidol C, Techasakul S., (2008) ― Labdane diterpenes from the rhizomes of Hedychium coronarium‖, Natural Product Research, 22(14),pp 1249–1256 10 Csurhes, S., Jones M.N, (2008) Pest plant risk assessment, Biosecurity Queensland Department of Primary Industries and Fisheries, Queensland , pp 11 Itokawa H, Morita H, Katou I, et al (1987) ― Cytotoxic diterpenes from the rhizomes of Hedychium coronarium‖, Planta Med,54, pp 311 12 Itokawa H, Morita H, Takeya K, Motidome M.(1988) ― Diterpenes from rhizomes of Hedychium coronarium‖, Chem Pharm Bull Tokyo,36, pp 2682–4,54, pp 311–5 13 Joshi S, Chanotiya CS, Agarwal G, Prakash O, Pant AK, Mathela CS, (2008) ― Terpenoid Compositions, and Antioxidant and Antimicrobial Properties of the Rhizome Essential Oils of Different Hedychium Species‖, Chemistry & Biodiversity, 5, p 299 14 Joy, P P., Thomas J., Mathew, S., and Skaria, B P., (1998), Zingiberaceous Medicinal and Aromatic Plants, Aromatic and Medicinal Plants Research Station, Odakkali, Asamannoor P.O.,Kerala, India, pp 23 – 24 15 Joy B, Rajan A, Abraham E., (2007) ― Antimicrobial activity and chemical composition of essential oil from Hedychium coronarium‖, Phytother Res, 21(5), pp 439 – 443 16 Phan Van Kiem , Nguyen Thi Kim Thuy , Hoang Le Tuan Anh , Nguyen Xuan Nhiem , Chau Van Minh , Pham Hai Yen , Ninh Khac Ban , Dan Thuy Hang, Bui Huu Tai, Nguyen Van Tuyen , Vivek Bhakta Mathema , Young-Sang Koh , Young Ho Kim, (2011) ― Chemical constituents of the rhizomes of Hedychium coronarium and their inhibitory effect on the pro-inflammatory cytokines production LPS- stimulated in bone marrow-derived dendritic cells‖ , Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters,21 pp 7460–7465 17 Kumrit I, Suksamrarn A, Meepawpan P, Songsri S, Nuntawong N., (2010) ―Labdane-type diterpenes from Hedychium gardnerianum with potent cytotoxicity against human small cell lung cancer cells‖, Phytother Res , 24(7), pp 1009-13 18 Kunnumakkara AB, Ichikawa H, Anand P, Mohankumar CJ, Hema PS, Nair MS, Aggarwal BB., (2008) ―Coronarin D, a labdane diterpene, inhibits both constitutive and inducible nuclear factor-kappa B pathway activation, leading to potentiation of apoptosis, inhibition of invasion, and suppression of osteoclastogenesis‖, Mol Cancer Ther,7 (10), pp 3306-17 19 Li R and Fan Y., (2011) ―Molecular Cloning and Expression Analysis of a Terpene Synthase Gene, HcTPS2, in Hedychium coronarium‖, Plant Molecular Biology Reporter, 29, pp 35–42 20 Liu X.H., Zhao D.B., Yang C.R., Wang H.Q., (2000) ―New Sesquiterpenoids from Hedychium yunnanense Gagne‖,Chinese Chemical Letters,11(11), pp 1009−1012 21 Lu Y., Zhong C X., Wang L., Lu C., Li X L and Wang P J., (2009), ―Antiinflammation activity and chemical composition of flower essential oil from Hedychium coronarium‖, African Journal of Biotechnology,8 (20), pp 5373-5377 22 Mabbertey D.J., (1998), The Plant-Book: A Portable Dictionary of the Higher Plants, Cambridge University Press, Cambridge 23 Matsuda H., Morikawa T., Sakamoto Y., Toguchida I and Yoshikawa M., (2002) ― Labdane-type Diterpenes with Inhibitory Effects on Increase in Vascular Permeability and Nitric Oxide Production from Hedychium coronarium‖, Bioorganic & Medicinal Chemistry,10, pp 2527–2534 24 Morikawa T, Matsuda H, Sakamoto Y, Ueda K, Yoshikawa M., (2002) ―New Farnesane-Type Sesquiterpenes, Hedychiols A and B 8,9-Diacetate, and Inhibitors of Degranulation in RBL-2H3 Cells from the Rhizome of Hedychium coronarium‖, Chem Pharm Bull,50(8), pp 1045—1049 25 Nakamura S, Okazaki Y, Ninomiya K, Morikawa T, Matsuda H, Yoshikawa M, (2008) ―Medicinal flowers XXIV Chemical structures and hepatoprotective effects of constituents from flowers of Hedychium coronarium‖, Chem Pharm Bull,56(12), pp 1704—1709 26 Nakatani N., Kikuzaki H., Yamaji H., Yoshio K., Kitora C., Okada K., Padolina W.G., (1994) ―Labdane diterpenes from rhizomes of Hedychium coronarium‖ Phyrochmustry,37(5), pp 1383-1388 27 Oh S, Jeong IH, Shin WS, Lee SA.(2003) ―Study on the synthesis of antiangiogenic (+)-coronarin A and congeners from (+)-sclareolide‖, Bioorg Med Chem Lett, 13, pp 2009 –12 28 Phillipine Medicinal Plants www.stuartxchange.org/Kamia.html 29 Qing Z., Xin H., Yun S.W, Cheng Z., HAO X.J., (2003) ―Two New Diterpenoids from Hedychium forrestii‖, Chinese Chemical Letters,14(11), pp 1141 – 1143 30 Sabulal, B George, V., Dan, M., Pradeep, N.S (2007), ―Chemical composition and antimicrobial activities of the essential oils from the rhizomes of four Hedychium species from South India‖, Journal of essential oil research,19, pp 1-5 31 Sirirugsa, P & Larsen K (1995), ―The genus Hedychium (Zingiberaceae) in Thailand‖ , Nordic Journal of Botany,15(3), pp 301–304 32 Shrotriya S, Ali MS, Saha A, Bachar SC, Islam M.S., (2007) ―Anti-inflammatory and analgesic effects of Hedychium coronarium Koen‖, Pak J Pharm Sci., 20(1), pp 42-47 33 Suresh G., Reddy P P., Babu K.S., Shaik T B, Kalivendi S V., (2010), ―Two new cytotoxic labdane diterpenes from the rhizomes of Hedychium coronarium‖, Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters, 20, pp 7544–7548 34 Taveira F.N., Oliveira1 A.B., Souza Filho J.D., Braga F.C, (2005) ―Epimers of labdane diterpenes from the rhizomes of Hedychium coronarium J Koenig‖, Revista Brasileira de Farmacognosia, Brazilian Journal of Pharmacognosy, 15(1), pp 55-59 35 Valkenburg J L C H van & Bunyapraphatsara N,(2002) ―Plant resource of South – east asia‖, Medicinal and poisonous plants ,12(2)  ... cứu hợp chất có hoạt tính sinh học thân rễ ngải tiên bousigon ( Hedychium bousigonianum Pierre ex Gagn) ‖ Mục tiêu đề tài a Nghiên cứu thành phần hóa học thân rễ ngải tiên bousigon b Nghiên cứu, ... lọc chất có hoạt tính sinh học thân rễ ngải tiên bousigon Sau chiết chọn lọc chất có hoạt tính sinh học thân rễ ngải tiên bousigon dụng môi n-hexan, diclometan etylaxetat cho thấy thân rễ ngải tiên. ..định hướng chọn đề tài: “ Góp phần nghiên cứu hợp chất có hoạt tính sinh học thân rễ ngải tiên bousigon ( Hedychium bousigonianum Pierre ex Gagn) ” Hedychium (chi ngải) chi thuộc họ gừng (Zingiberaceae)