Nghiên cứu các hợp chất có hoạt tính sinh học trong cây ngải tiên HEDYCHIUM CORONARIUM KOENIG

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN - NGUYỄN THỊ MAI PHƢƠNG NGHIÊN CỨU CÁC HỢP CHẤT CÓ HOẠT TÍNH SINH HỌC TRONG CÂY NGẢI TIÊN HEDYCHIUM CORONARIUM KOENIG LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC HÀ NỘI, 2011 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN Nguyễn Thị Mai Phƣơng NGHIÊN CỨU CÁC HỢP CHẤT CĨ HOẠT TÍNH SINH HỌC TRONG CÂY NGẢI TIÊN HEDYCHIUM CORONARIUM KOENIG Chuyên ngành: Hóa hữu Mã số: 60 44 27 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: PGS.TS Văn Ngọc Hƣớng Chân thành cảm ơn tài trợ đề tài CNHD – ĐT – 018/10 – 11 Thuộc chương trình trọng điểm quốc gia phát triển cơng nghiệp hóa dược Hà Nội, 2011 MỤC LỤC MỤC LỤC LỜI MỞ ĐẦU CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Khái quát chi Hedychium 1.1.1 Đặc điểm thực vật học 1.1.2 Thành phần hóa học chi Hedychium 1.1.3 Hoạt chất sinh học thân rễ loài chi Hedychium 1.1.4 Ứng dụng loài thuộc chi Hedychium 1.2 Tổng quan ngải tiên 10 1.2.1 Xuất xứ 10 1.2.2 Một số đặc điểm thực vật 11 1.2.3 Thành phần hóa học ngải tiên ( Hedychium coronarium Koenig) 13 2.3.1.Tecpenoid tinh dầu ngải tiên 13 2.3.2 Sesquiterpenoid diterpenoid 17 1.2.3.3 Các hợp chất C6 – C3 26 1.2.3.4 Các hợp chất C6 – C3 – C6 27 1.2.3.5 Các hợp chất Steroids 28 2.4 Các hợp chất có hoạt tính sinh học ngải tiên 29 1.2.4.1 Hoạt tính sinh học tác dụng tinh dầu 29 1.2.4.2 Hoạt tính sinh học chất chiết từ thân rễ 30 2.5 Tình hình nghiên cứu Hedychium coronarium Việt Nam 33 1.2.6 Ứng dụng ngải tiên Hedychium coronarium Koenig 35 CHƢƠNG 2: ĐỀ TÀI, PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU VÀ THỰC NGHIỆM 37 2.1 Đề tài, mục tiêu nhiệm vụ 37 2.1.1 Tên đề tài 37 2.1.2 Mục tiêu đề tài 37 2.1.3 Nhiệm vụ đề tài 37 2.2 Các phương tiện nghiên cứu 38 2.2.1 Thiết bị nghiên cứu 38 2.2.2 Dụng cụ 38 2.2.3 Các hóa chất 39 2.3 THỰC NGHIỆM 39 2.3.1 Mẫu thực vật phương pháp xử lí: 39 2.3.2 Điều chế tinh dầu thân rễ ngải tiên 40 2.3.3 Phân tích nhận biết thành phần tinh dầu thân rễ ngải tiên 41 2.3.4 Chiết hợp chất có hoạt tính sinh học củ ngải tiên 41 2.3.5 Thử hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định (Antimicrobial activity) 42 2.3.6 Khảo sát cặn chiết sắc ký lớp mỏng (SKLM) 42 2.3.7 Phân lập xác định cấu trúc phân tử chất cặn chiết 43 2.3.8 Các số vật lí số liệu phổ chất thu được……………… 45 2.3.9 Khảo sát hoạt tính gây độc tế bào hợp chất phân lập được: 46 CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 47 3.1 Đối tượng đề tài nghiên cứu 48 3.2 Nghiên cứu tinh dầu thân rễ ngải tiên 48 3.2.1 Điều chế tinh dầu 48 3.2.2 Phân tích nhận biết thành phần tinh dầu thân rễ ngải tiên 49 3.3 Nghiên cứu hợp chất có hoạt tính sinh học củ Ngải tiên (Hedychium coronarium Koenig) 51 3.3.1 Chiết chọn lọc chất có hoạt tính sinh học củ ngải tiên… 51 3.3.2 Khảo sát hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định tinh dầu cặn chiết củ ngải tiên 52 3.3.3 Phân lập hợp chất cặn chiết H E thân rễ ngải tiên 53 3.3.3.1 Khảo sát cặn chiết H E SKLM 53 3.3.3.2 Phân lập chất tinh khiết cặn chiết E H 55 3.3.4 Xác định cấu trúc phân tử chất phân lập 56 3.3.4.1 Xác định cấu tạo phân tử hợp chất P7 56 3.3.4.2 Xác định cấu trúc phân tử hợp chất P5 58 3.3.4.3 Xác định cấu trúc phân tử H6 61 3.3.5 Khảo sát hoạt tính chống ung thư chất phân lập từ thân rễ ngải tiên 63 KẾT LUẬN 66 TÀI LIỆU THAM KHẢO 67 LỜI MỞ ĐẦU Nước ta nằm vùng khí hậu nhiệt đới gió mùa nên hệ thực vật vô đa dạng phong phú đặc biệt có tinh dầu làm thuốc Theo thống kê bước đầu, nước ta có 600 lồi có tinh dầu, phần lớn chưa nghiên cứu đầy đủ, hệ thống triệt để Hệ thực vật phong phú đa dạng vùng, quốc gia xem nguồn tài ngun q giá, có quan hệ trực tiếp tới đời sống người Hóa học hợp chất thiên nhiên với vai trị nghiên cứu thành phần hóa học tìm hiểu hoạt tính sinh học thuốc mang ý nghĩa khoa học thực tiễn Việc nghiên cứu hợp chất có hoạt tính sinh học thuốc dân tộc vấn đề hấp dẫn khoa học mà cịn đóng góp cho việc sử dụng thuốc có hiệu hơn, xác Góp phần phong phú cho hệ thực vật Việt Nam, lại gần gũi với đời sống nhân dân phải kể đến họ gừng (Zingiberaceae) Nhu cầu sử dụng sản phẩm từ họ gừng làm thuốc hương liệu giới nước ngày tăng Các nghiên cứu họ gừng đến nhiều ln điều hấp dẫn với nhà nghiên cứu Trong họ gừng có chi mà Việt Nam chưa nghiên cứu rộng rãi chi ngải Hedychium Trong giới với nhiều nghiên cứu báo cáo chi hấp dẫn hương thơm hoa hợp chất có hoạt tính sinh học thú vị thuộc dãy  - lacton diterpen ,  không no Đây hợp chất có hoạt tính chống ung thư, chống viêm mạnh nhà khoa học giới quan tâm cách đặc biệt Với định hướng chọn đề tài: “ Nghiên cứu hợp chất có hoạt tính sinh học ngải tiên ( Hedychium coronarium Koenig) ‖ CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Khái quát chi Hedychium 1.1.1 Đặc điểm thực vật học Hedychium (chi ngải) chi thuộc họ gừng (Zingiberaceae) gồm lâu năm phổ biến với chiều cao phát triển khoảng 120 – 180 cm Chi thường gọi với tên chi hoa loa kèn gừng chi loại thân thảo, thân rễ mập phân nhánh Chi có nguồn gốc từ vùng đất nhiệt đới Châu Á dãy Himalaya Các lồi chi thường có hoa đẹp, rực rỡ hấp dẫn mùi hương Tại Nam Á, chi Hedychium có 80 lồi Các nghiên cứu gần báo cáo có 41 lồi Ấn Độ, có 17 lồi đặc hữu Ấn Độ [29] Ba loài chi Hedychium từ Thái Lan nhận dạng phân lập năm 1995 H samuiense, H tomentosum H biflorum.[30] Theo ―Cây cỏ Việt Nam‖ Phạm Hồng Hộ Việt Nam chi Hedychium có 12 lồi, phân bố hầu hết tỉnh từ Bắc chí Nam [4] 1) Hedychium coronarium Koen Thường gọi ngải tiên Địa thực vật: Dạng giống gừng, thơm, phiến to, không lông, mép cao 2-3 cm Phát hoa chót thân, có nhiều hoa xanh, hoa trắng thơm Đài ống dài; vành có tai hẹp, dài ; tiểu nhụy lép dạng cánh hoa to; tiểu nhụy thụ; môi to, thùy Nang cao 2,5 cm; mảnh vàng; hột đỏ Phân bố Lào Cai, Đà Lạt, Hà Giang 2) Hedychium coronarium var flavescens (Lodd.) Hook Gọi ngải tiên vàng vàng Cành ngắn, có sợi; thân cao đến 2m, đáy đo đỏ Lá có phiến thon dài, mặt láng, mặt có lơng; mép cao 3-4 cm Phát hoa thơng; đài có ống có lơng; vành có ống dài đến 10 cm; phiến vàng lợt; mơi có bớt vàng sẫm Hoa thơm ngọt, màu vàng 3) Hedychium coronarium var flavum K.Schum Gọi ngải tiên vàng Thân cỏ cao, cành ngắn; thân đo đỏ Lá có phiến thon, chót có dài 4- cm; mép cao đến 5cm Phát hoa hình bắp cao đến 15cm, hoa có lơng chót, mang – hoa; hoa vàng; ống vành dài cm, mơi to, chẻ chót 4) Hedychium bousigoniamun Pierre ex Gagn Gọi Ngải tiên Bousigon Thân cỏ, cao 1-1,2 m Căn hành to – mm Lá có phiến thon hẹp, nhọn, dài 30 – 50 cm, rộng cm, không lông Gié thưa, dài 20 cm; hoa có lơng, dài 2,5 cm; hoa to, vàng; tiểu nhụy lép hẹp, dài 4cm; môi xoan, chẻ đến ½; nỗn sào có lơng Thường mọc rừng Đà Lạt 5) Hedychium coccineum Hamilt Ngải tiên đỏ Địa thực vật: cao 1,5 – 2m Lá có phiến dài 25 – 50 cm, rộng 3- cm, đáy tà, có hình tim; mép cao 1- 2,5 cm; hoa đỏ; đài dài cm, cánh hoa cm; mơi thùy, nỗn có lơng Thường mọc nơi đất ẩm lầy, vùng núi cao 6) Hedychium ellipticum Sm , Ngải tiên bầu dục Cỏ cao m Lá có phiến bầu dục, to 20 – 40 x 10-15 cm, mỏng, có điểm trong; mép nâu, cao cm; bẹ không lông Phát hoa nghiên, dày, to 12x3-4 cm; hoa không lông, cao cm; hoa trắng, cao cm; vành có lơng nhung; nỗn sào có lơng Mọc nơi triền núi 7) Hedychium gardnerianum Roscoe Ngải tiên Gardner Kanili Ginger, Ginger Lily Địa thực vật: Cao đến m, dạng gừng Lá có phiến bầu dục, khơng cuống; mép cao Phát hoa đứng cao; hoa xanh, 2x1 cm; đài vảy; hoa vàng bua; ống hoa dài 5-6 cm; cánh hoa hẹp, dài cm, rộng – mm; tiểu nhụy lép dẹp, vàng tươi; môi vàng chanh, xoan có thùy; tiểu nhụy thụ màu cam đậm, chi tía, chứa nuốm giữa, lục; nỗn sào khơng lơng Thích hợp với đất cầm thủy: Đà Lạt 8) Hedychium forresti Diels var latebracteatum K Lars Ngải tiên hoa rộng Địa thực vật: cao 1,2 m, thơm Lá có phiến thon nhọn, to 40 x 10 cm; mép cao 2,5 – cm; bẹ không lông Phát hoa cao 15 cm; hoa dài -4 cm; hoa vàng tươi; mơi tam giác, có thùy xoan thon (sống nơi cao 1500 m, Sapa) 9) Hedychium poilanei K lars Ngải tiên Poilane Địa thực vật: Thân cỏ cao 1,3 m Lá có phiến thon he ̣p nho ̣n , to 40x12 cm; mép cao – 1,5 cm, ria nâu Phát hoa dài 12 cm; hoa to 4-5 x 2- cm, hoa thanh, thơm dịu; ống vành dài đến 10 cm Cánh hoa trắng hay ngà Phân bố Bảo Lô ̣c 10) Hedychium stenopetalum Lodd Ngải tiên Cánh hoa hẹp Địa thực vật: cao m, có phiến to , đến 60x10 cm, mặt khơng lơng,mă ̣t có lơng dài, nằm; mép mỏng, cao 1-2 cm, phát hoa chót thân, to, dài đến 35 cm có lá hoa to , gắn thẳng góc vào trục ; hoa trắ ng hoa thơm ngào ngạt ; cánh hoa hẹp; bao phấn dài mm, mơi bầu dục, có thùy, nỗn sào có lơng phún Thường mọc Quảng Trị vào tháng 11) Hedychium villosum Wall Ngải tiên lông Địa thực vật cao 1,5 m Lá có phiế n tròn dài , thon hẹp; mép cao 2-3cm Phát hoa dài 10 – 15 cm, dày; hoa có lơng nhung , nâu hoe, dài 2- 2,5 cm, rộng cm; hoa phụ ngắn , hoa trắ ng, ống đài cm; ống vành dài cm cánh hoa và tiểu nhụy lép dài cm; môi hẹp, thùy sâu; tiểu nhụy cao 4,5 cm bao phấ n khơng dài Có Đèo Btian 12) Hedychium yunnanensis Gagn., Ngải tiên Vân nam Địa thực vật: Lá có phiến thon, to 30x8 -13 cm; mép mỏng,cao 3-6 cm, nâu Phát hoa dài 20 cm, thưa; hoa nhỏ, không lông; hoa trắng hay vàng, thơm; ống đài không lông; ống vành cm, cánh hoa tiểu nhụy lép hẹp, dài cm; tiểu nhụy dài 5,5 cm, bao phấn cam; mơi hình tam giác hẹp, chẻ hai Phân bố Đà Lạt 1.1.2 Thành phần hóa học chi Hedychium Trong thiên nhiên có loại hợp chất : Terpenoit, Steroit, Flavonoit, ancaloit, cacbohidrat, lipit, protit… Nhưng khơng phải lồi thực vật có chứa đủ loại mà tùy loài thực vật mà hợp chất chủ yếu mà lại khơng có loại hợp chất Trong loại thực vật, phận khác có thành phần hóa học khác Đối với loài thuộc chi Ngải (Hedychium) có đặc điểm chung phận thân rễ hoa có mùi thơm đặc biệt Vì người ta ý trước tiên chất dễ bay hơi, chất có mùi, thành phần tinh dầu hai phận Tinh dầu hỗn hợp chất thu chưng cất lơi nước, chúng chất không phân cực hay phân cực, không tan nước hay tan nước Vì nhiệt độ sơi thấp nên dễ bay hơi, có mùi, thành phần chủ yếu Hemiterpen (C5), monoterpen (C10), sesquiterpen (C15), điterpen(C20)… dẫn xuất oxi chúng Thành phần tinh dầu khơng phụ thuộc vào lồi, vào phận mà phụ thuộc vào phương pháp điều chế Quả vậy, nghiên cứu tinh dầu số loài thuộc chi Ngải H ellipticum, H aurantiacum, H.coronarium, H spicatum, Sushil Joshi cộng kết sau: [12] Tinh dầu H.coronarium chứa trans-meta- metha-2,8-diene (25,2%), linalool (21,7%), - tecpineol (10,9%), Terpin-4-ol (4,1%), - pinen (4,0%),- terpinene (3,6%), camphene (3,1%), tổng đóng góp 83,1% xác định tinh dầu thân rễ H ellipticum chứa 30 hợp chất, có 28 thành phần đóng góp chiếm 97,8% tổng hàm lượng tinh dầu, hợp chất 1,8 -cineole (33,0%), sabinene (22,2%), Terpin-4-ol (14,3%), -terpinene (5,3%), -caryophyllene (5,6%) Trong tinh dầu thân rễ H aurantiacum, Terpin-4-ol (24,8%) xác định thành phần quan trọng nhất, với para-cymene (8,2%), bornyl acetate (7,6%), borneol (3,3%), -pinen ( 3,1%), - pinen (2,8%), -tecpineol (2,4%), germacrene D (2,1%), sabinene (2.0%) Trong tinh dầu thân rễ H Spicatum lấy mẫu Jageshwar hợp chất 1,8 –cineole(42,8%); 10 – epi -  - Eudesmol (12,4%);  - Selinene(6,8%); pinen (4%);  - cadinol (2,9%) tổng đóng góp 87,5% xác định thành phần thân rễ Bảng 3.6 Số liệu phổ 1H 13C-NMR hợp chất P7 Vị trí C C (ppm) P7 40,83 C (ppm) villosin [25] 40,9 H (ppm) Độ bội, J(Hz) P7 P7 1,00; 1,40 m H (ppm) villosin [25] 1,00; 1,45 19,11 19,1 1,49; 1,46 m 1,40; 1,51 42,30 42,3 1,51; 1,21 m 1,18; 1,40 33,57 33,6 54,75 54,8 1,09 1,09 23,38 23,4 1,71; 1,38 m 1,71; 1,39 36,75 36,8 2,45; 2,08 m 2,08; 2,44 149,40 149,4 62,22 62,2 2,37 m 2,37 10 39,29 39,3 11 136,87 136,9 6,89 dd(10,13; 10,13) 6,90 12 120,66 120,7 6,10 d (15,84) 6,11 13 129,55 129,6 14 142,34 142,3 7,14 br_s 7,15 15 69,56 69,6 4,8 d(1,6) 4,80; 16 172,31 172,3 17 108,40 108,4 4,5; 4,76 d(1,7); d(1,7) 4,51; 4,76 18 33,38 33,6 0,89 s 0,89 19 21,93 22,0 0,84 s 0,84 20 15,05 15,1 0,87 s 0,87 dd(2,68; 2,68) 3.3.4.2 Xác định cấu trúc phân tử hợp chất P5 Hợp chất P5 chất rắn vơ định hình, khơng màu Phổ IR (xem phụ lục 11 trang 83) cho thấy nhóm - OH (OH 3636 cm-1), vịng - lacton (C=O 1758 cm-1), nhóm exo - 58 metylen (3088, 1674 948 cm-1) liên kết đơi nhóm (1674, 948 cm-1) Phổ 13 C-NMR (xem phụ lục 14 trang 86)cho thấy có 20 nguyên tử cacbon phân tử, có nhóm cacbonyl (170,50 ppm), cacbon olefinic (148,25, 143,48, 124,44 108,07 ppm), nhóm metin, nhóm metylen nhóm metyl MS cho pic phân tử lượng 318(xem phụ lục 12 trang 84) Các số liệu cho phép xác định công thức phân tử P5 C20H30O3 Phổ 1H-NMR lần khẳng định có nhóm vinyliden phân tử P5 thể proton geminal 4,83 ppm (1H, d, J 18.1) 4,37 (1H, d, J 18.2) (xem phụ lục 13 trang 85) Kết luận dựa tương tác proton lên cacbon có 13 C =108,07 ppm qua phổ HSQC (xem phụ lục 16 trang 88) Phổ 1H& C-NMR cho thấy có liên kết đơi nhóm thể C H = 6,72 ppm (1H,br_s) = 143,48 ppm Từ số liệu có cơng thức cấu tạo P5 (hình 3.2) số liệu 1H 13C-NMR bảng 3.7 Hình 3.2 Cơng thức cấu tạo P5 – Coronarin D 59 Bảng 3.7: Số liệu 1H&13C-NMR hợp chất P5 Vị trí C C (ppm) P5 C (ppm) coronarin D [11] H (ppm) P5 39,46 39,12 1,55; 1,15 m 19,25 19,21 1,49; 1,55 m 41,93 41,90 1,50; 1,2 m 33,61 33,57 55,25 55,21 1,16 dd(2,36; 2,36) 24,62 24,42 1,32 m 37,72 37,68 1,73 m 148,25 148,01 56,07 56,02 3,01 1H 2,99 10 39,66 39,94 11 24,00 23,99 2,36-2,39 m,(2H) 2,36-2,40 12 143,48 143,45 6,72 br s,1H 6,69 13 124,44 124,48 14 25,42 25,58 2,71 s,1H 2,71 15 96,42 96,46 5,94 br_s,1H 5,94 16 170,57 170,65 17 108,07 107,52 4,83; 4,37 18 20,98 21,62 0,88 s,3H 0,89 19 19,25 19,21 0,81 s,3H 0,82 20 14,02 14,23 0,71 s,3H 0,71 Độ bội, J(Hz) P5 H (ppm) coronarin D [11] 1,13 4,81; 4,36 Ghi chú: Số liệu phổ bảng 3.7 phù hợp với tài liệu (11,17) Như P5 có tên hóa học 15-hydroxy-8(17),12-labdadien-15(16)-olide có tên khác coronarin D Sự định hướng proton H9, H5, C20 khẳng định nhờ xét tương tác chúng qua phổ NOESY( xem phụ lục 18 trang 90) 60 3.3.4.3 Xác định cấu trúc phân tử H6 Hợp chất H6, dạng dầu không màu, Rf =0,5 (n- hexan/EtOAc 9/1, v/v), màu xanh đen với FeCl3 1M (pH=4) Phổ IR H6 (xem phụ lục 19 trang 91) cho thấy phân tử có vịng lactone có vị trí , - chưa no có C=O 1762 cm-1 C=C 1681 cm-1; nhóm exomethylene C=C 1641 cm-1 , C-H 954 cm-1 nhóm ete C –O-C = 1118cm-1 Phổ 1HNMR ( phụ lục 21 trang 93) cho thấy diện nhóm Etoxy, hiển thị hai cụm triplet (H = 1,12 ppm H = 1,15 ppm ) pic multiplets (H =3,59 ppm; H =3,86ppm) tín hiệu nhóm methyl (H = 0,68 ppm; 0,78ppm; 0,85ppm) H exo-methylene (H = 4,32ppm; 4,37ppm 4,77ppm) Quan sát phổ 13 C – NMR (xem phụ lục số 22a trang 94) cho thấy Cacbon olefin vùng 107 – 147 ppm cặp đôi cacbon olefin liền kề có cường độ Tổng số cacbon hai đồng phân 44 Trong có nhón CH, 16 nhóm CH2, nhóm CH3 (xem phổ DEPT, phụ lục 23 trang 97) Đặc điểm phổ nêu gần với phổ Coronarin D xác định 3.3.4.2 Tất kiện cho phép nghĩ đến cặp đồng phân epime etyl coronarin D ete Điều khẳng định thêm nhờ phổ khối H6 (xem phụ lục 20 trang 92) có pic ion phân tử m/z = 346,4 (M+) , với phân mảnh có điểm ion m/z = 300,6 (M+ – C2H5OH) Tất thỏa mãn với công thức phân tử C22H34O3 Số liệu phổ H6 ghi bảng 3.8 công thức cấu tạo H6 hình 61 O 12 16 13 O 11 14 20 15 21 17 O 22 10 H 19 18 Hình 3.3 Cơng thức cấu tạo H6 – etyl coronarin D ete Bảng 3.8 Số liệu phổ 13C hợp chất H6 Nguyên tử C Số liệu phổ 13C Số liệu phổ 13C epimer Etyl hợp chất H6 coronarin D ete[33] H6/a H6/b 3a 3b 39,19 39,35 39,2 39,3 19,231 19,231 19,3 19,3 41,919 41,919 42,0 42,0 32,844 32,798 33,6 33,6 55,300 55,253 55,3 55,4 24,020 23,999 24,1 24,1 37,704 37,704 37,8 37,8 147,732 147,975 147,8 148,1 56,056 56,056 56,1 56,1 10 39,348 39,197 39,4 39,4 11 25,327 25,327 25,4 25,4 12 142,572 142,700 142,9 143,0 62 13 124,148 124,079 124,1 124,1 14 32,844 32,798 32,9 32,9 15 100,934 100,934 101,0 101,0 16 169,604 169,604 169,8 169,8 17 107,249 107,560 107,3 107,7 18 33,308 33,458 33,6 33,6 19 21,630 21,540 21,7 21,7 20 14,003 14,230 14,3 14,4 21 65 65 65,1 65,1 22 14,260 14,849 15,0 15,0 Để khẳng định thêm độ xác dự đoán cấu tạo hỗn hợp epime etyl coronarium D, kết hợp so sánh liệu phổ 13C H6 với tài liệu 33 Bảng số liệu cho thấy phù hợp phổ 13C- NMR cặp epimer etyl coronarin D ete mà Taveira cộng sự, năm 2005 phân lập xác định cấu trúc từ thân rễ ngải tiên ( Hedychium coronarium J Koening) Braxin[33] 3.3.5 Khảo sát hoạt tính chống ung thư chất phân lập từ thân rễ ngải tiên Như trình bày trên, phân lập chất tinh khiết thân rễ ngải tiên vùng Sapa Ba số xác định cấu trúc phân tử cách chặt chẽ phương pháp phổ đại, là: Villosin; Coronarin D epimer Etyl coronarin D ete Villosin chất có hoạt tính chống ung thư phổi mạnh Các nghiên cứu Kumrit I cộng khẳng định Villosin chống ung thư phổi mạnh so với thuốc chống ung thư phổi tiếng ellipticine Cường độ IC50 villosin 0,40 M, cao so với thuốc ellipticine (IC50 1,79 microM) Hơn nữa, villosin không độc 63 với tế bào Vero ellipticine độc hại tế bào Chính mà villosin có triển vọng phát triển thuốc điều trị ung thư [16] Coronarin D etyl coronarin D có nhiều cơng trình nghiên cứu hoạt tính chống ung thư Các loại ung thư như: ung thư gan Hep-G2, ung thư phổi A 549, ung thư thần kinh SK – N – SH, ung thư vú MCF – 7, ung thư cổ tử cung HeLa [17, 32] thử nghiệm Nhưng dòng ung thư phổi Lu, ung thư vân tim RD chưa thử nghiệm Chúng tơi khảo sát hoạt tính gây độc tế bào ung thư Coronarin D phân lập từ thân rễ ngải tiên vùng Sapa với dòng tế bào ung thư: ung thư gan (Hep-G2), ung thư phổi (Lu) ung thư vân tim (RD) theo phương pháp Skehan cộng (1993), Likhiwitayawuid cộng (1993); phương pháp áp dụng viện ung thư quốc gia Mỹ (NCI) Kết bảng 3.8 bảng 3.9 Bảng 3.8 Hàm lƣợng tế bào ung thƣ sống sót sau thử TT Ký hiệu Các tế bào cịn sống sót CS (%) Kết luận mẫu Hep-G2 Lu RD DMSO 100,0±0,0 100,0±0,0 100,0±0,0 P5 dương Chứng (+) 2,2±0,0 1,8±0,04 0,30±0,03 tính tính P5 0,0±0,0 19,4±0,10 0,00±0,00 dòng Bảng 3.9 Cƣờng độ gây độc tế bào ung thƣ TT Ký hiệu Nồng độ gây độc IC50 (g/ml) Kết luận mẫu Hep-G2 Lu RD Chứng (+) 0,257 0,312 0,188 P5 dương P5 0,788 0,969 0,675 tính dịng Từ kết bảng cho thấy, mẫu P5 (Coronarin D) mà chúng tơi phân lập có tác dụng gây độc tế bào ung thư mạnh dòng ung thư người ung 64 thư gan Hep-G2 ( IC50 0,78 microgam/ml), ung thư phổi Lu(IC50 0,96 microgam/ml) ung thư vân tim RD ( IC500,67 microgam/ml) 65 KẾT LUẬN Qua nghiên cứu hợp chất có hoạt tính sinh học thân rễ ngải tiên (Hedychium coronarium Koenig), chúng tơi có kết luận sau: Đã xây dựng phương pháp thiết bị điều chế tinh dầu thân rễ ngải tiên vùng Sapa cho hiệu suất cao (0,12% so với mẫu tươi) tinh dầu thu từ củ ngải tiên trồng Từ Liêm cho hiệu suất 0,09% so với mẫu tươi Bằng phương pháp GC - MS xác định thành phần hóa học có hàm lượng cao tinh dầu ngải tiên là: Linalool: 23,44%; α-Terpineol: 12,14%; Nerolidol : 11,86%; 1,8- cineole 2.23%; Terpinen-4-ol: 2.12% Kết phân tích cho thấy thành phần tinh dầu ngải tiên Sapa khác tinh dầu ngải tiên trồng thực nghiệm Từ Liêm nhiều Xây dựng quy trình chiết chọn lọc hợp chất  - lacton ,  không no thuộc dãy labdan – điterpen thân rễ ngải tiên cho hiệu tốt Chúng phân lập hợp chất tinh khiết từ cặn EtOAc chất từ cặn n – hexan thân rễ ngải tiên xác định cấu trúc phân tử hợp chất Đó là: Villosin; Coronarin D epimer ete etyl coronarin D Chúng khảo sát hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định mẫu: tinh dầu, cặn H cặn E Kết cho thấy tinh dầu kháng ba loại vi khuẩn: Ecoli loại vi khuẩn nấm mốc: Asp.niger F.oxysporum; cặn H cặn E cho kháng F.oxysporum Chúng khảo sát hoạt tính gây độc tế bào ung thư Coronarin D phân lập từ thân rễ ngải tiên Sapa dòng tế bào ung thư người: ung thư gan Hep-G2, ung thư phổi Lu ung thư vân tim RD nhận thấy Coronarin D có hoạt tính gây độc tế bào mạnh dịng ung thư Chúng tơi cơng bố phần kết luận án báo tạp chí Dược Học, năm 2012, số 429, trang 48 - 52 66 TÀI LIỆU THAM KHẢO TIẾNG VIỆT Đỗ Huy Bích, Đặng Quang Chung, Bùi Xuân Chương, Nguyễn Thượng Dong, Đỗ Trung Đàm, Phạm Văn Hiển, Vũ Ngọc Lộ, Phạm Duy Mai, Phạm Kim Mãn et al (2004), Cây thuốc động vật làm thuốc Việt Nam, tập I, Nxb KH&KT Hà Nội, tr 141-143 Bộ Y tế (2002), Dược điển Việt Nam, Nxb Y học, Hà Nội, tr 141 Võ Văn Chi (1997), Từ điển thuốc Việt Nam, Nxb Y học, TP HCM, tr 821 Phạm Hoàng Hộ (1993) Cây cỏ Việt Nam, NXB Montreal, tâ ̣p 3, tr 558 – 562 Nguyễn Thị Thuỷ, Nguyễn Thị Phương Thảo, Trương Anh Thư, Bùi Văn Thanh (2003)― Thành phần hoá học tinh dầu Ngải tiên (Hedychium coronarium Koenig)‖, Viện Sinh thái & Tài nguyên Sinh vật, Viện KH& CNVN TIẾNG ANH Aziz M A., Habib M R., Karim M R., (2009) ― Antibacterial and Cytotoxic Activities of Hedychium coronarium J Koenig‖ , Research Journal of Agriculture and Biological Sciences, 5(6), pp 969-972 Boukouvalas J., Wang Jian-Xin and Marion O., (2007) ― Expedient synthesis of villosin and its isomer (E)-labda-8(17),12,14-trien-15(16)-olide‖, Tetrahedron Letters,48, pp 7747–7750 Chimnoi N, Pisutjaroenpong S, Ngiwsara L, Dechtrirut D, Chokchaichamnankit D, Khunnawutmanotham N, Mahidol C, Techasakul S., (2008) ― Labdane diterpenes from the rhizomes of Hedychium coronarium‖, Natural Product Research, 22(14),pp 1249–1256 Csurhes, S., Jones M.N, (2008) Pest plant risk assessment, Biosecurity Queensland Department of Primary Industries and Fisheries, Queensland , pp 67 10 Itokawa H, Morita H, Katou I, et al (1987) ― Cytotoxic diterpenes from the rhizomes of Hedychium coronarium‖, Planta Med,54, pp 311 11 Itokawa H, Morita H, Takeya K, Motidome M.(1988) ― Diterpenes from rhizomes of Hedychium coronarium‖, Chem Pharm Bull Tokyo,36, pp 2682–4,54, pp 311–5 12 Joshi S, Chanotiya CS, Agarwal G, Prakash O, Pant AK, Mathela CS, (2008) ― Terpenoid Compositions, and Antioxidant and Antimicrobial Properties of the Rhizome Essential Oils of Different Hedychium Species‖, Chemistry & Biodiversity, 5, p 299 13 Joy, P P., Thomas J., Mathew, S., and Skaria, B P., (1998), Zingiberaceous Medicinal and Aromatic Plants, Aromatic and Medicinal Plants Research Station, Odakkali, Asamannoor P.O.,Kerala, India, pp 23 – 24 14 Joy B, Rajan A, Abraham E., (2007) ― Antimicrobial activity and chemical composition of essential oil from Hedychium coronarium‖, Phytother Res, 21(5), pp 439 – 443 15 Phan Van Kiem , Nguyen Thi Kim Thuy , Hoang Le Tuan Anh , Nguyen Xuan Nhiem , Chau Van Minh , Pham Hai Yen , Ninh Khac Ban , Dan Thuy Hang, Bui Huu Tai, Nguyen Van Tuyen , Vivek Bhakta Mathema , YoungSang Koh , Young Ho Kim, (2011) ― Chemical constituents of the rhizomes of Hedychium coronarium and their inhibitory effect on the proinflammatory cytokines production LPS- stimulated in bone marrow-derived dendritic cells‖ , Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters,21 pp 7460– 7465 16 Kumrit I, Suksamrarn A, Meepawpan P, Songsri S, Nuntawong N., (2010) ―Labdane-type diterpenes from Hedychium gardnerianum with potent cytotoxicity against human small cell lung cancer cells‖, Phytother Res , 24(7), pp 1009-13 68 17 Kunnumakkara AB, Ichikawa H, Anand P, Mohankumar CJ, Hema PS, Nair MS, Aggarwal BB., (2008) ―Coronarin D, a labdane diterpene, inhibits both constitutive and inducible nuclear factor-kappa B pathway activation, leading to potentiation of apoptosis, inhibition of invasion, and suppression of osteoclastogenesis‖, Mol Cancer Ther,7 (10), pp 3306-17 18 Li R and Fan Y., (2011) ―Molecular Cloning and Expression Analysis of a Terpene Synthase Gene, HcTPS2, in Hedychium coronarium‖, Plant Molecular Biology Reporter, 29, pp 35–42 19 Liu X.H., Zhao D.B., Yang C.R., Wang H.Q., (2000) ―New Sesquiterpenoids from Hedychium yunnanense Gagne‖,Chinese Chemical Letters,11(11), pp 1009−1012 20 Lu Y., Zhong C X., Wang L., Lu C., Li X L and Wang P J., (2009), ―Antiinflammation activity and chemical composition of flower essential oil from Hedychium coronarium‖, African Journal of Biotechnology,8 (20), pp 53735377 21 Mabbertey D.J., (1998), The Plant-Book: A Portable Dictionary of the Higher Plants, Cambridge University Press, Cambridge 22 Matsuda H., Morikawa T., Sakamoto Y., Toguchida I and Yoshikawa M., (2002) ― Labdane-type Diterpenes with Inhibitory Effects on Increase in Vascular Permeability and Nitric Oxide Production from Hedychium coronarium‖, Bioorganic & Medicinal Chemistry,10, pp 2527–2534 23 Morikawa T, Matsuda H, Sakamoto Y, Ueda K, Yoshikawa M., (2002) ―New Farnesane-Type Sesquiterpenes, Hedychiols A and B 8,9-Diacetate, and Inhibitors of Degranulation in RBL-2H3 Cells from the Rhizome of Hedychium coronarium‖, Chem Pharm Bull,50(8), pp 1045—1049 24 Nakamura S, Okazaki Y, Ninomiya K, Morikawa T, Matsuda H, Yoshikawa M, (2008) ―Medicinal flowers XXIV Chemical structures and hepatoprotective 69 effects of constituents from flowers of Hedychium coronarium‖, Chem Pharm Bull,56(12), pp 1704—1709 25 Nakatani N., Kikuzaki H., Yamaji H., Yoshio K., Kitora C., Okada K., Padolina W.G., (1994) ―Labdane diterpenes from rhizomes of Hedychium coronarium‖ Phyrochmustry,37(5), pp 1383-1388 26 Oh S, Jeong IH, Shin WS, Lee SA.(2003) ―Study on the synthesis of antiangiogenic (+)-coronarin A and congeners from (+)-sclareolide‖, Bioorg Med Chem Lett, 13, pp 2009 –12 27 Phillipine Medicinal Plants www.stuartxchange.org/Kamia.html 28 Qing Z., Xin H., Yun S.W, Cheng Z., HAO X.J., (2003) ―Two New Diterpenoids from Hedychium forrestii‖, Chinese Chemical Letters,14(11), pp 1141 – 1143 29 Sabulal, B George, V., Dan, M., Pradeep, N.S (2007), ―Chemical composition and antimicrobial activities of the essential oils from the rhizomes of four Hedychium species from South India‖, Journal of essential oil research,19, pp 1-5 30 Sirirugsa, P & Larsen K (1995), ―The genus Hedychium (Zingiberaceae) in Thailand‖ , Nordic Journal of Botany,15(3), pp 301–304 31 Shrotriya S, Ali MS, Saha A, Bachar SC, Islam M.S., (2007) ―Antiinflammatory and analgesic effects of Hedychium coronarium Koen‖, Pak J Pharm Sci., 20(1), pp 42-47 32 Suresh G., Reddy P P., Babu K.S., Shaik T B, Kalivendi S V., (2010), ―Two new cytotoxic labdane diterpenes from the rhizomes of Hedychium coronarium‖, Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters, 20, pp 7544–7548 33 Taveira F.N., Oliveira1 A.B., Souza Filho J.D., Braga F.C, (2005) ―Epimers of labdane diterpenes from the rhizomes of Hedychium coronarium J Koenig‖, 70 Revista Brasileira de Farmacognosia, Brazilian Journal of Pharmacognosy, 15(1), pp 55-59 34 Valkenburg J L C H van & Bunyapraphatsara N,(2002) ―Plant resource of South – east asia‖, Medicinal and poisonous plants ,12(2) 71 PHỤ LỤC Phụ lục Phổ GC – MS tinh dầu thân rễ ngải tiên…………………………73 Phụ lục Kết thử hoạt tính kháng VSVKĐ tinh dầu, cặn E cặn H………………………………………………… 74 Phụ lục Kết thử hoạt tính chống ung thư P5 (Coronarin D)…… … 75 Phụ lục Phổ IR hợp chất P7……………………………………………… 76 Phụ lục 5: Phổ khối hợp chất P7………………………………………… .77 Phụ lục Phổ 1H - NMR hợp chất P7………………………………….…….78 Phụ lục 7: Phổ 13C - NMR hợp chất P7………………………………….… 79 Phụ lục Phổ DEPT hợp chất P7………………………………………….…80 Phụ lục 9: Phổ HSQC hợp chất P7………………………………………….…81 Phụ lục 10 Phổ HMBC hợp chất P7………………………………………….82 Phụ lục 11 Phổ IR hợp chất P5……………………………………………….83 Phụ lục 12: Phổ khối hợp chất P5……………………………………….… 84 Phụ lục 13 Phổ 1H - NMR hợp chất P5…………………………………….85 Phụ lục 14: Phổ 13C - NMR hợp chất P5………………………………… 86 Phụ lục 15 Phổ DEPT hợp chất P5……………………………………… 87 Phụ lục 16: Phổ HSQC hợp chất P5…………………………………….… 88 Phụ lục 17 Phổ HMBC hợp chất P5……………………………………… 89 Phụ lục 18 Phổ NOESY hợp chất P5…………………………………….…90 Phụ lục 19 Phổ IR hợp chất H6………….……………………………… 91 Phụ lục 20: Phổ khối hợp chất H6………………………………………… 92 Phụ lục 21 Phổ 1H - NMR hợp chất H6……………………………………93 Phụ lục 22a: Phổ 13C - NMR hợp chất H6………………………………….94 Phụ lục 22b: Phổ 13C - NMR hợp chất H6…………………………… ….95 Phụ lục 22c: Phổ 13C - NMR hợp chất H6………………………………….96 Phụ lục 23 Phổ DEPT hợp chất H6……………………………………… 97 Phụ lục 24: Phổ HSQC hợp chất H6……………………………………….98 Phụ lục 25 Phổ HMBC hợp chất H6…………………………….…… …99 72 ... Nghiên cứu hợp chất có hoạt tính sinh học củ Ngải tiên (Hedychium coronarium Koenig) 51 3.3.1 Chiết chọn lọc chất có hoạt tính sinh học củ ngải tiên? ?? 51 3.3.2 Khảo sát hoạt tính kháng... 2.4 Các hợp chất có hoạt tính sinh học ngải tiên 29 1.2.4.1 Hoạt tính sinh học tác dụng tinh dầu 29 1.2.4.2 Hoạt tính sinh học chất chiết từ thân rễ 30 2.5 Tình hình nghiên cứu Hedychium. .. pinen 1.1.3 Hoạt chất sinh học thân rễ loài chi Hedychium Vì thân rễ lồi hedychium có tinh dầu, nên nghiên cứu hoạt chất sinh học chất thân rễ trước hết nghiên cứu hoạt tính sinh học tinh dầu