Nghiên cứu nuôi trồng và khảo sát một số hợp chất có hoạt tính sinh học của nấm ophiocordyceps sobolifera TT

ĐẠI HỌC HUẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TRẦN VĂN KHOA NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG VÀ KHẢO SÁT MỘT SỐ HỢP CHẤT CĨ HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA NẤM Ophiocordyceps sobolifera Ngành: Hóa Hữu Mã số: 944.01.14 TĨM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ HÓA HỮU CƠ HUẾ - NĂM 2021 Cơng trình hồn thành Khoa Hóa học, Trường Đại học Khoa học, Đại học Huế Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS Trần Thị Văn Thi GS.TSKH Trịnh Tam Kiệt Phản biện 1: PGS.TS Giang Thị Kim Liên Viện nghiên cứu đào tạo Việt-Anh, Đại học Đà Nẵng Phản biện 2: PGS.TS Tống Thị Thanh Hương Trường Đại học Mỏ - Địa chất Hà Nội Phản biện 3: TS Lê Hoàng Duy Trung tâm nghiên cứu ứng dụng đậu nành Vinasoy Luận án bảo vệ trước Hội đồng cấp sở Trường Đại học Khoa học vào lúc 14 giờ, ngày 22 tháng 03 năm 2021 Có thể tìm hiểu luận án thư viện: Trường Đại học Khoa học, Đại học Huế ĐẶT VẤN ĐỀ Việc sử dụng loài nấm ký sinh côn trùng để tạo hoạt chất có tác dụng cải thiện sức khỏe đem lại thành có ý nghĩa khoa học thực tiễn Xu hướng không ngừng phát triển qua hàng ngàn năm từ thuốc dân tộc, dân gian cơng trình hóa dược đại Trong tự nhiên, tương tác nấm côn trùng đa dạng, tương tác sản sinh sản phẩm hợp chất tự nhiên thứ cấp có vai trị quan trọng đời sống: hợp chất nguồn dinh dưỡng, hợp chất mang độc tố, hợp chất kích hoạt hay tác nhân bảo vệ [93] Cordyceps chi nấm Theo phân loại hình thái học sinh học, có 500 lồi Cordyceps tồn giới [108], riêng Trung Quốc tìm thấy 90 lồi [139] Cordyceps chi nấm ký sinh, ghi nhận lần Trung Quốc vào năm 620 trước công nguyên Các nhà khoa học phương Tây biết đến cách rộng rãi chi từ hội nghị khoa học Paris vào năm 1726 [42] Ban đầu, chi Cordyceps phát nhiều nơi núi cao, đất giàu khống chất với khơng khí lỗng, áp suất cao, nhiệt độ thấp, tia cực tím cao Himalaya, Tây Tạng, Nepal Chúng tồn phát triển môi trường khắc nghiệt Ngày nay, người ta phát nhiều loài thuộc chi Cordyceps hay Ophiocordyceps ký sinh lên nhiều loại côn trùng khác mơi trường khắc nghiệt hơn, chủ động ni cấy dưỡng dần lồi nấm tự nhiên mơi trường phịng thí nghiệm Một số loài thuộc chi Cordyceps như: Cordyceps sinensis, Cordyceps militaris hai loài nấm tiếng nghiên cứu ni cấy phổ biến khắp giới, cịn gọi Đông trùng hạ thảo, bào tử nấm chúng thường ký sinh ấu trùng chi Thitarodes (Thitarodes baimaensis Thitarodes armoricanus) thuộc họ Hepialidae Ophiocordyceps sobolifera loài nấm chưa phổ biến, ký sinh ve sầu dạng ấu trùng khơng cánh Các lồi ln “tích lũy” hợp chất thứ cấp, hợp chất chuyển hố có hoạt tính sinh học thú vị độc đáo, sinh tổng hợp điều kiện phịng thí nghiệm [42] Trong y học cổ truyền Trung Quốc, loài thuộc chi Cordyceps Cordyceps sinensis (syn Ophiocordyceps sinensis [28]), Cordyceps militaris Ophiocordyceps sobolifera (syn Cordyceps sobolifera) vị thuốc vô quý giá, có khả bổ sung cho thận làm dịu phổi, chữa bệnh ho, bệnh ho lao, nơn máu, hen suyễn, viêm thận mãn tính, rối loạn chức thận bệnh gan Các nghiên cứu dược lý đại cho thấy lồi nấm có lợi cho số hoạt động thể người: tim mạch, hơ hấp, tuần hồn hệ thống hematogenic, giúp điều chỉnh hệ thống thần kinh, hạ sốt giảm đau, tăng cường chức thận, chống ung thư, chống u, cải thiện hệ thống máu, chống mệt mỏi, hạ lipid máu tăng huyết áp [18],[21] Một vài nghiên cứu gần công bố Ming Feng Wu cộng cho thấy dịch chiết nước từ nấm Ophiocordyceps sobolifera có khả cải thiện tình trạng rối loạn chức thận lipopolysaccharide gây chuột Theo công bố Chun-Hung Chiu cộng sự, polysaccharide có khả làm giảm nội độc tố làm tổn thương thận chuột Sangdee cộng thông báo dịch chiết từ nấm Ophiocordyceps sobolifera có khả kháng khuẩn, kháng nấm [97] Thành phần hóa học lồi nấm đa dạng, bao gồm nhóm chất sơ cấp thứ cấp: polysaccharide, cordycepin, cyclosporine, adenosine, protein, hợp chất sterol, acid béo, vitamin, enzyme [42] Trong đó, polysaccharide polymer thiên nhiên thuộc nhóm carbohydrate, có cấu trúc đa dạng, phức tạp nghiên cứu nhiều giới hoạt tính sinh học quý giá chúng như: chống oxy hóa, bảo vệ gan, tăng cường miễn dịch, kháng khuẩn, kháng virus (kể virus HIV), chống nghẽn tĩnh mạch, kháng ung thư [96],[111], chống oxy hóa [18],[21]… Hầu hết nghiên cứu trước tập trung vào loài Cordyceps sinensis Cordyceps militaris, hai lồi phát từ lâu, có nhiều cơng bố hai loài tiếng Hiện nay, người ta mở rộng khai thác tự nhiên, Cordyceps sinensis có nguy cạn kiệt Trong đó, Cordyceps sinensis Ophiocordyceps sobolifera có thành phần hố học hoạt tính sinh học tương tự [132], có cơng bố nghiên cứu Ophiocordyceps sobolifera[18] Đặc biệt Việt Nam, theo tìm hiểu chúng tơi chưa có nghiên cứu lồi Ophiocordyceps sobolifera chưa thấy có mặt thị trường Với lý trên, đề tài lựa chọn luận án : NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG VÀ KHẢO SÁT MỘT SỐ HỢP CHẤT CÓ HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA NẤM Ophiocordyceps sobolifera Phạm vi luận án: Trong luận án này, quan tâm nghiên cứu nấm Ophiocordyceps sobolifera với phạm vi nuôi trồng nấm dạng sinh khối, làm nguyên liệu cho trình nghiên cứu thành phần hố học số hợp chất có hoạt tính sinh học Ý nghĩa khoa học thực tiễn: Nghiên cứu nuôi trồng khảo sát thành phần hoá học số hợp chất có hoạt tính sinh học thay đổi nguồn dinh dưỡng nuôi trồng nấm để tối ưu số lượng chất lượng hoạt tính sinh học mong muốn Từ đây, chủ động mở rộng sản xuất sinh khối nấm Ophiocordyceps sobolifera thực tiễn, góp phần phong phú thêm nguồn dược liệu, bảo vệ sức khoẻ, nâng cao chất lượng sống ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN Đây cơng trình nghiên cứu cách có hệ thống ni trồng, thành phần hóa học hoạt tính sinh học lồi nấm Ophiocordyceps sobolifera Lần đầu tiên, điều kiện nuôi trồng nấm Ophiocordyceps sobolifera khảo sát qua bố trí ma trận thí nghiệm, thu phương trình mơ hình khảo sát tối ưu hóa để đạt hàm lượng hoạt chất cao Cao nước từ Ophiocordyceps sobolifera thể tác dụng bảo vệ thận in vivo chuột nhắt trắng theo hướng chống oxy hóa tương tự quercetin, dựa việc giảm hàm lượng creatinin malondialdehyde hồi phục số giá trị sinh lý bình thường Đây kết bước đầu đáng khích lệ hoạt tính sinh học Ophiocordyceps sobolifera nuôi cấy Việt Nam Cho đến nay, chưa tìm thấy cơng bố khác hàm lượng hoạt chất phenol có hoạt tính chống oxy hóa mạnh: gallic acid, quercitrin, quercetin hesperidin loài Cordyceps luận án Hai cấu trúc polysaccharide lần xác định loài Ophiocordyceps sobolifera Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tổng quan loài ophiocordyceps sobolifera chi cordyceps 1.2 Tổng quan hoạt tính chống oxy hóa 1.3 Tổng quan hợp chất có hoạt tính chống oxy hóa 1.4 Tổng quan polysaccharide 1.5 Tổng quan ứng dụng phương pháp thiết kế tối ưu 1.6 Nhận định tình hình nghiên cứu trước ophiocordyceps sobolifera Chương ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU Giống nấm Ophiocordyceps sobolifera mua từ Aloha Medicinal,Inc Mỹ, nuôi trồng tạo sinh khối, làm nguyên liệu cho nghiên cứu luận án 2.2 HÓA CHẤT VÀ THIẾT BỊ 2.3 MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU Cung cấp thông tin điều kiện nuôi trồng nấm Ophiocordyceps sobolifera để thu nhận khối lượng sinh khối, hàm lượng hoạt chất polysaccharide, hợp chất phenol flavonoid cao Cung cấp thơng tin số hoạt tính sinh học nấm Ophiocordyceps sobolifera ni trồng: hoạt tính chống oxy hóa in vitro, hoạt tính chống oxy hóa- bảo vệ thận in vivo chuột nhắt trắng Cung cấp thơng tin cấu trúc, hàm lượng hoạt tính chống oxy hóa số hoạt chất phenol polysaccharide nấm Ophiocordyceps sobolifera nuôi trồng 2.4 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU Khảo sát điều kiện nuôi trồng nấm Ophiocordyceps sobolifera đến khối lượng sinh khối hàm lượng hoạt chất polysaccharide, hợp chất phenol flavonoid Khảo sát số hoạt tính sinh học nấm Ophiocordyceps sobolifera: hoạt tính chống oxy hóa in vitro, hoạt tính chống oxy hóa- bảo vệ thận in vivo chuột nhắt trắng Định tính, định lượng hoạt tính chống oxy hóa số hoạt chất phenol nấm Ophiocordyceps sobolifera Xác định cấu trúc, định lượng hoạt tính chống oxy hóa polysaccharide nấm Ophiocordyceps sobolifera 2.5 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.5.1 Phương pháp chuẩn bị mẫu nguyên liệu 2.5.2 Phương pháp tách chiết cao nước cao ethanol 2.5.3 Phương pháp đánh giá hoạt tính chống oxy hóa 2.5.4 Phương pháp nghiên cứu hoạt tính bảo vệ thận thể động vật 2.5.5 Phương pháp Folin- Ciocalteu - trắc quang để định lượng tổng hợp chất phenol 2.5.6 Phương pháp tạo phức với muối nhôm môi trường kiềmtrắc quang để định lượng tổng hợp chất flavonoid 2.5.7 Phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC) định lượng hợp chất phenol 2.5.8 Phương pháp tách chiết tinh chế polysaccharide 2.5.9 Phương pháp xác định cấu trúc Chương KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 KHẢO SÁT ĐIỀU KIỆN NUÔI TRỒNG NẤM Ophiocordyceps sobolifera 3.1.1 Điều kiện hình thành kích thước sợi nấm 3.1.1.1 Ảnh hưởng pH Phương pháp ANOVA yếu tố (ANOVA single factor) sử dụng để đánh giá sai khác giá trị kích thước nấm sau thời gian phát triển ngày theo pH Với mức ý nghĩa α = 0,05, kết cho thấy giá trị kích thước pH từ đến khác mặt thống kê với F(4)= 766, p< 0,0001 cho thấy pH mơi trường ni cấy ảnh hưởng đến kích thước phát triển sợi nấm Đồng thời, pH = cho sợi nấm phát triển tốt nhất, pH = chọn cho nghiên cứu 3.1.1.2 Ảnh hưởng nhiệt độ Nấm nuôi trồng môi trường đệm phosphat (pH=7) điều kiện nhiệt độ khác khảo sát khoảng từ 23 oC đến 29oC Kết cho thấy thay đổi nhiệt độ từ 23oC đến 25oC kích thước sợi nấm tăng dần (Hình 3.2) Tuy nhiên, nhiệt độ cao 25oC kích thước sợi nấm lại giảm Vì vậy, nhiệt độ thích hợp cho việc ni trồng nấm để thu sản phẩm có kích thước lớn 25oC Mẫu thu hoạch sau 21 ngày rửa nước cất, sau tiến hành sấy lạnh máy sấy thăng hoa Harvest right đến khối lượng không đổi 3.1.2 Điều kiện tách chiết định lượng hoạt chất polysaccharide (PS), hợp chất phenol flavonoid mẫu nấm 3.1.2.1 Điều kiện tách chiết định lượng polysaccharide Điều kiện tốt để chiết polysaccharide là: nhiệt độ chiết: 100°C; tỉ lệ mẫu: thể tích nước (g/mL) 1:60, thời gian giờ/1 lần chiết, chiết lần, tỉ lệ ethanol 96°/dịch chiết là: 4/1 (v/v) 3.1.2.2 Điều kiện tách chiết định lượng hợp chất phenol flavonoid Điều kiện thích hợp để chiết hợp chất phenol từ mẫu nấm: dung môi chiết ethanol 70°, nhiệt độ chiết 70°C, tỉ lệ mẫu so với dung môi 1:50 (g/mL); thời gian chiết 90 phút/lần, số lần chiết: 3.1.3 Ảnh hưởng yếu tố dinh dưỡng môi trường nuôi cấy đến khối lượng sinh khối hàm lượng hoạt chất polysaccharide, hợp chất phenol flavonoid nấm Phương pháp khảo sát đơn biến thường có sai lệch giá trị hàm mục tiêu, mặt khác khơng thể rõ vai trị tác động yếu tố ảnh hưởng đến hàm mục tiêu Vì vậy, luận án này, phương pháp quy hoạch hóa thí nghiệm mơ hình Box-Behnken Design (BBD) sử dụng để khảo sát hàm mục tiêu là: hàm lượng polysaccharide, khối lượng sinh khối nấm, hàm lượng tổng hợp chất phenol, hàm lượng tổng flavonoid với 04 yếu tố ảnh hưởng khối lượng glucose (x1), khối lượng KH2PO4 (x2), khối lượng MgSO4 (x3), thể tích dịch chiết ve sầu (x4) Từ phần mềm minitab, sử dụng tối ưu hóa đáp ứng (response optimizer) để tìm điều kiện tối ưu cho 04 hàm mục tiêu (Hàm lượng PS, khối lượng sinh khối nấm, hàm lượng tổng hợp chất phenol hàm lượng tổng flavonoid) vùng khảo sát Kết hình 3.12 cho thấy hàm mục tiêu đạt giá trị cực đại sau: hàm lượng PS đạt 5,418 g, khối lượng sinh khối nấm đạt 0.870 g, hàm lượng tổng hợp chất phenol đạt 12,778 mg GA/g, hàm lượng tổng flavonoid đạt 8,112mg QE/g Với điều kiện thí nghiệm sau: khối lượng Glucose: 47,12 g, khối lượng KH2PO4: 1,69 g, khối lượng MgSO4: 0,74 g, thể tích dịch chiết ve sầu: 52,2 mL Để kiểm chứng độ mơ hình, thí nghiệm thực lặp lại lần với điều kiện điểm tối ưu dự đốn, kết cho thấy mơ hình BBD đánh giá tốt thí nghiệm khảo sát 3.2 KHẢO SÁT MỘT SỐ HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA NẤM Ophiocordyceps sobolifera Mẫu lựa chọn để khảo sát mẫu nuôi cấy điều kiện tối ưu mục 3.1.3, với glucose (x1): 47,12 g; KH2PO4 (x2): 1,69 g; MgSO4 (x3): 0,74 g; dịch chiết ve sầu (x4): 52,2 mL 3.2.1 Hoạt tính chống oxy hóa in vitro mơ hình hóa học 3.2.1.1 Hoạt tính chống oxy hóa theo mơ hình phosphor molybdenum Lực chống oxy hóa mẫu thể cao nồng độ 0,5 mg/mL Hàm lượng chất chống oxy hóa sau: Trong cao nước: 7,87 ± 0,11 mg ascorbic acid/g mẫu (n=3) Hoặc 12,72 ± 0,29 mg gallic acid/g mẫu (n=3) Trong cao ethanol: 3,55 ± 0,37 mg ascorbic acid/g mẫu (n=3) Hoặc 5,37 ± 0,91 mg gallic /g mẫu (n=3) Hàm lượng chất chống oxy hóa cao nước O sobolifera cao gấp lần so với cao ethanol O sobolifera cho thấy tiềm chống oxy hóa cao nước cao so với cao ethanol mơ hình khảo sát 3.2.1.2 Hoạt tính chống oxy hóa theo mơ hình bắt gốc tự DPPH Qua bảng 3.9, nhận thấy rằng, khả bắt gốc tự mẫu khảo sát tăng theo nồng độ Giá trị IC50 cho thấy cao ethanol có hoạt tính cao cao nước khơng nhiều Ở nồng độ mg/mL, cao chiết bắt 70 % gốc tự DPPH, chứng tỏ mẫu nghiên cứu có hoạt tính chống oxy hóa cao loài Cordyceps sinensis nghiên cứu [26] (bắt 60 % gốc DPPH) Thực nghiệm cho thấy cao ethanol O sobolifera ni cấy có hoạt tính cao nấm Linh chi (Ganoderma lucidum) công bố [100]: nồng độ mg/mL tỉ lệ bắt gốc tự DPPH 54,14 % Như vậy, cao nước cao ethanol từ nấm O sobolifera có hoạt tính chống oxy hóa xấp xỉ mơ hình khảo sát Hoạt tính chống oxy hóa mẫu cao so với loài Cordyceps sinesis G lucidum nghiên cứu trước 3.2.2 Hoạt tính bảo vệ thận in vivo nấm Ophiocordyceps sobolifera chuột nhắt trắng bị gây tổn thương thận cisplatin 3.2.2.1 Kết định lượng creatinine Cao nước O.sobolifera có tác dụng tương tự chất đối chiếu quercetin, thể tác dụng bảo vệ thận, làm giảm hàm lượng creatinine bị tăng mơ hình gây độc thận cisplatin, hồi phục trở giá trị bình thường 3.2.2.2 Kết định lượng BUN Cao chiết nước O.sobolifera chưa thể tác dụng theo hướng hồi phục hàm lượng BUN giá trị bình thường mơ hình gây độc thận cisplatin 3.2.2.3 Kết xác định hàm lượng malondialdehyde (MDA) thận chuột Cao nước O sobolifera thể tác dụng hồi phục hàm lượng MDA giá trị bình thường, thể tác dụng bảo vệ thận theo hướng chống tổn thương peroxy hóa tế bào mơ hình gây độc thận cisplatin Khả chống oxy hóa- bảo vệ thận cao nước O sobolifera tương đương quercetin 3.2.2.4 Kết khảo sát mô học thận chuột Kết vi phẫu thận chuột cho thấy sau tiêm cisplatin ngày, mô thận bị tổn thương nhẹ Điều thời gian ngắn (3 ngày), chưa thể quan sát thấy tổn thương điển hình cisplatin mặt mô học Như vậy, dịch chiết nấm O sobolifera thể tác dụng bảo vệ thận theo hướng kháng oxy hóa tương tự quercetin hàm lượng creatinin malondialdehyd, hồi phục số giá trị sinh lý bình thường 3.3 ĐỊNH TÍNH, ĐỊNH LƯỢNG VÀ HOẠT TÍNH CHỐNG OXY HĨA CỦA MỘT SỐ HOẠT CHẤT PHENOL TRONG NẤM Ophiocordyceps sobolifera 3.3.1 Định tính - Thăm dị sắc ký mỏng TLC, phát vệt có diện tích lớn cả, Đối chiếu hệ số lưu Rf chất chuẩn phenol để dự đoán tên hợp chất phenol tương ứng - Tiến hành sắc ký lỏng hiệu cao HPLC: khẳng định cấu tử gallic acid, quercetin, quercitrin hesperidin 3.3.2 Định lượng 3.3.2.1 Đánh giá phương pháp định lượng Sự tương quan tuyến tính chặt chẽ nồng độ chất phân tích diện tích peak thể hệ số tương quan R> 0,996 Độ thu hồi gallic acid, quercetin, quercitrin hesperidin 95,59 % đến 98,54 %, Kết sở để tiến hành định lượng hợp chất mẫu nghiên cứu phương pháp HPLC 3.3.2.2 Hàm lượng gallic acid, quercetin, quercitrin, hesperidin mẫu Bảng 3.16 Hàm lượng số hợp chất phenol mẫu nghiên cứu Gallic TA4CQuercetin Quercitrin hesperidin Mẫu acid (HPLC)* (µg/g) (µg/g) (µg/g) (µg/g) (µg/g) 193,60 142,07 ± 544,53 ± 110,08 ± O sobolifera 990,27 ± 0,02 0,02 0,03 0,01 *Tổng hàm lượng chất Kết phân tích HPLC dịch chiết nấm Ophiocordyceps sobolifera chứa số hợp chất phenolic điển hình 3.3.2.3 Hoạt tính chống oxy hóa gallic acid, quercetin, quercitrin, hesperidin Bảng 3.17 Khả bắt gốc tự DPPH hợp chất phenol nghiên cứu Tỷ lệ bắt gốc tự DPPH (%) nồng độ (µg/ mL) STT Hợp chất IC50 100 20 0,8 (µg/ mL) Quercetin 98,72 85,16 75,52 48,23 1,93 Quercitrin 95,28 81,54 69,64 31,18 2,35 Gallic acid 90,15 82,63 40,82 29,16 7,51 Hesperidin 82,39 68,46 38,24 20,16 10,23 Chất chuẩn ascorbic acid 95,91 94,17 77,50 29,27 2,08 Chất chuẩn curcumin 81,26 40,64 29,07 20,19 38,34 Các giá trị IC50 cho thấy phenol chất chống oxy hóa tốt, tốt nhiều so với curcumin, đặc biệt quercetin cịn có hoạt tính tốt ascorbic acid 10 3.4 XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC, ĐỊNH LƯỢNG VÀ HOẠT TÍNH CHỐNG OXY HĨA CỦA POLYSACCHARIDE TRONG NẤM Ophiocordyceps sobolifera 3.4.1 Xác định cấu trúc polysaccharide mẫu PS chiết nhiệt độ 100°C (mẫu PS-T100) 80°C (mẫu PS-T80) 3.4.1.1 Tinh chế kiểm tra độ tinh khiết polysaccharide thu Từ mẫu O sobolifera lựa chọn, tiến hành tách chiết polysaccharide 100oC, sau tinh chế theo quy trình 2.5.8.2 thu mẫu polysaccharide (ký hiệu mẫu PS-T100) Tiếp tục thủy phân PS-T100, sau phân tích HPLC để định tính định lượng amino acid có mẫu Sắc ký đồ thu thể hình 3.2 3.3 Khơng phát amino acid, mẫu PST100 khảo sát không liên kết với thành phần protein 3.4.1.2 Khối lượng phân tử PS-T100 Sắc ký đồ PS-T100 thu sắc ký thẩm thấu gel hiệu cao (GPHPLC) Khối lượng phân tử trung bình PS-T100 khoảng 2,29 ×105 Da Tỷ lệ Mw/Mn, đại diện cho số phân tán cung cấp dấu hiệu sơ độ rộng phân bố, khoảng 1,30, giá trị biểu thị mẫu PS có đa phân tán khối lượng phân tử, hay nói PS-T100 hetero polysaccharide 3.4.1.3 Xác định thành phần monosaccharide vị trí liên kết glycoside thơng qua q trình methyl hóa Phân tích GC-MS thành phần monosaccharide PS-T100 cho thấy PS-T100 heteropolysaccharide với xuất hai dẫn xuất đường methyl hóa : 1,3,5-tri-O-acetyl-2,4,6-tri-O methylglucitol 1,3,5-tri-O-acetyl-2,4,6-tri-O-methylmannitol cho thấy diện D-glucose D-mannose khung PS Từ dẫn xuất thu được, cho thấy có hai loại liên kết: glucosyl (1 → 3) liên kết mannosyl (1 → 3), tồn PS-T100 3.4.1.4 Phổ hồng ngoại (phổ IR) Thông tin phổ hồng ngoại PS-T100, peak nằm khoảng 3446 cm-1 gán cho dao động hóa trị liên kết O-H polysaccharide Các dải vùng 2933 cm-1 có liên quan đến dao động hóa trị C-H, dải vùng 1647 cm-1 nước liên kết bề mặt [133] Các dải hấp thụ mạnh 1413 cm-1 dao động hóa trị liên kết C-O Hơn nữa, hấp thụ đặc trưng 1045 cm-1 dạng cấu hình β tồn glucan [47], dải hấp thụ 802 cm-1 gán cho liên kết glycosidic loại α [68] Số sóng 11 peak phổ FT-IR mẫu PS-T100 phù hợp với cơng trình [132] Từ kết phổ hồng ngoại kết hợp với kết GC-MS bảng 3.11, cấu hình mẫu PS-T100 nghiên cứu có liên kết β-D-glucan α-D-mannose 3.4.1.5 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân chiều chiều PS-T100 Phổ 1H-NMR PS-T100 cho thấy tín hiệu hai proton anomer độ dịch chuyển hóa học: δH 4,55ppm (d, J = Hz, liên kết dạng β proton anomer G) 5,13 ppm (d, J = Hz, liên kết dạng α anomer M) tín hiệu H2 đến H6 nằm độ chuyển dịch hóa học từ 3,13 - 3,82 ppm Đây dấu hiệu cho thấy diện hai thành phần đường đơn vị hexasaccharide Dựa vào tỉ lệ cường độ cho thấy, đoạn mạch PS-T100 có xuất đường M 1,5 đường G Có thể nhận thấy rằng, cấu trúc phân đoạn PST100 có loại liên kết α-D-Mannose β-D-Glucose với tỷ lệ α-DMannose: β-D-Glucose = 1:1,5 Kết hoàn toàn phù hợp với tỷ lệ dẫn xuất monosaccharide phân tích GC-MS Phổ 13C-NMR PS-T100 có tín hiệu hai carbon anomer độ chuyển dịch hóa học 95,9 ppm 92,1 ppm tương ứng với cấu hình β-anomeric đơn vị đường glucopyranosyl (Glcp) C-1 đường α-D-Manp, tương ứng Các tín hiệu C2 - C6 nằm vùng có độ chuyển dịch hóa học từ δC 60,6 - 76,0 ppm Dữ liệu từ1H NMR kết phân tích methyl hóa xác định diện β-D-glucose α-D-mannose đơn vị lặp lại PS-T100 Kết phổ HSQC cho thấy, peak carbon δC 95,9; 92,1; 76,0; 75,8; 74,2; 72,8; 71,5; 71,5; 69,7; 69,6; 60,8 60,6 ppm có tương tác tương ứng với proton δH 4,55; 5,13; 3,37; 3,32; 3,15; 3,62; 3,39; 3,74; 3,30; 3,29; 3,81 3,79 ppm Điều cho phép xác định vị trí proton nối trực tiếp với nguyên tử carbon cấu trúc phân tử PS-T100 Những tương tác 1H → 1H phổ COSY PS-T100 tương tác proton carbon cận kề cấu trúc PS-T100 Các tương tác bao gồm tương tác G H-2 (δH 3,32)/G H-3 (δH 3,62), G H-4 (δH 3,79)/G H-3 (δH 3,62)/ G H-5 (δH 3,81), G H-5 (δH 3,81)/ G H-6 (δH 3,30); M H-3 (δH 3,15)/M H-2 (3,39)/M H-4 (3,37), M H-5 (δH 3,74)/M H-4 (δH 3,37)/M H6 (δH 3,29) 12 Tương tự tương tác từ 1H → 13C phổ HMBC, cho thấy tương tác proton với carbon cận kề nhau, tương tác G H-1(δH 4,55)/ G C-2 (δC 75,8); G H-2 (δH 3,32)/G C-3 (δC 72,8); G H-3 (δH 3,62)/ G C-4 (δC 60,6)/ G C-2 (75,8); G H-4 (δH 3,79)/ G C-5 (δC 60,8)/G C-3 (δC 72,8); G H-5 (δH 3,81)/ G C-6 (δC 69,7); M H-1(δH 5,13)/ M C-2 (δC 71,5); M H-3 δH 3,15)/ M C-4 (δC 76,0)/ M C-2 (71,5); M H-5 (δH 3,74)/ M C-4 (δC 76,0)/ M C-6 (δC 69,6) Kết cho phép thiết lập trật tự liên kết hydrogen carbon thành phần đường phân tử PS-T100 Bảng 3.21 Độ chuyển dịch C H thành phần đường PS-T100 từ nấm Ophiocordyceps sobolifera ghi D2O Thành phần đường G →3)-β- D-glucopyranoside-(1→ H-1 H-2 H-3 H-4 H-5 H-6 4,55 3,32 3,62 3,79 3,81 3,30 M →3)-α-D- mannopyranoside-(1→ 5,13 3,39 3,15 3,37 3,74 3,29 Thành phần đường G →3)-β- D-glucopyranoside-(1→ C-1 C-2 C-3 C-4 C-5 C-6 95,9 75,8 72,8 60,6 60,8 69,7 M →3)- α-D- mannopyranoside-(1→ 92,1 71,5 74,2 76,0 71,5 69,6 Trong phổ HMBC PS-T100 xuất tương tác proton anomer G H-1(δH 4,55) với carbon M C-3 (δC 74,2); proton anomer M H-1 (δH 5,13) với carbon G C-3 (δC 72,8) mối liên kết glycoside cấu trúc PS-T100 tương ứng G(1→3)M M(1→3)G Như vậy, cấu trúc đoạn mạch polysaccharide tách chiết 100oC từ mẫu O sobolifera lựa chọn có khối lượng phân tử trung bình 2,29 ×105 Da biểu diễn dạng: Hình 3.27 Cấu trúc đoạn mạch polysaccharide PS-T100 13 3.4.1.6 Xác định cấu trúc đoạn mạch polysaccharide mẫu PS-T80 Cấu trúc đoạn mạch PS-T80 xác định theo phương pháp tương tự Các kết methyl hóa, sắc ký lọc gel, phổ IR, phổ cộng hưởng từ hạt nhân chiều chiều thể phụ lục cho thấy: Khối lượng phân tử trung bình PS-T80 khoảng 7,4×104 Da Tỷ lệ Mw/Mn khoảng 1,83, cho thấy mẫu PS-T80 có đa phân tán khối lượng phân tử Do đó, nói PS-T80 hetero polysaccharide Q trình methyl hóa cho thấy xuất hai dẫn xuất đường methyl hóa chính:1,3,5-tri-O-acetyl-2,4,6-tri-O -methylglucitol 1,3,5-tri-O-acetyl-2,4,6-tri-O-methylmannitol cho thấy diện D-glucose D-mannose khung PS-T80 Từ dẫn xuất thu được, cho thấy có hai loại liên kết: glucosyl (1 → 3) liên kết mannosyl (1 → 3), tồn PS-T80 Bốn dải hấp thụ đặc trưng polysaccharide hiển thị phổ IR: peak nằm khoảng 3383 cm-1 gán cho dao động kéo dài liên kết O–H PS Các dải vùng 2893 cm-1 2924 cm1 dao động kéo giãn C-H, dải vùng 1637 cm1 cho dao động nước liên kết [124],[133] Các dải hấp thụ mạnh 1408 cm-1 dao động kéo giãn C-O Ngồi ra, vị trí tương đối nhóm axial equatorial (OH) polysaccharide nằm dãy dao động từ 1100 đến 1000 cm-1 Bên cạnh đó, dao động đặc trưng 1043 cm-1 tồn cấu hình β glucan [47] Hơn nữa, dao động 889 cm-1 gán cho liên kết glycosidic loại β, dao động 1076 cm-1 gán cho nhóm trục (OH) vị trí C-2 C-4 mannose [47] Phổ 1H-NMR PS-T80 cho thấy tín hiệu hai proton anomer độ dịch chuyển hóa học: δH 4,56 ppm (d, J = Hz, proton anomer G, cấu hình dạng β) 5,15 ppm (d, J = Hz, proton anomer M, cấu hình dạng α ) tín hiệu H2 đến H6 nằm độ chuyển dịch hóa học từ 3,16 - 3,80 ppm Đây dấu hiệu cho thấy diện hai thành phần đường đơn vị hexasaccharide Dựa vào tỉ lệ cường độ cho thấy, đoạn mạch PS-T80 có xuất đường M đường G Những kết phù hợp với phổ hồng ngoại kết 14 H-NMR loại polysaccharide khác Các chuyển dịch hóa học proton anome (nhỏ 5,0 ppm) gán cho proton anome gốc liên kết β mô tả tài liệu [5],[15],[34],[37] Các giá trị proton H1 vượt ppm cho thấy cấu hình loại α Phổ 13C-NMR PS-T80 có tín hiệu hai carbon anomer độ chuyển dịch hóa học 95,9 ppm 92,1 ppm tương ứng với cấu hình β-anomeric đơn vị đường glucopyranosyl (Glcp) C-1 đường α-D-Manp, tương ứng Các tín hiệu C2 - C6 nằm vùng có độ chuyển dịch hóa học từ δC 60,6 - 76,0 ppm 12 đỉnh đường cắt ngang phổ HSQC giúp xác định vị trí nguyên tử carbon proton PS-T80 Thành phần đường G biểu thị tín hiệu 4,56 / 95,9, 3,33 / 75,8, 3,63 / 72,8, 3,65 / 60,8, 3,80 / 60,6 3,32 / 69,7 ppm Hơn nữa, tín hiệu 5,15 / 92,1, 3,45 / 71,5, 3,16 / 74,2, 3,42 / 76,0, 3,75 / 71,5 3,38 / 69,6 gán cho đường M Số lượng đỉnh chéo vùng nhóm methylen gợi ý monosaccharide dạng hexose G H-2 (δ 3.33)/G H-3 (δ 3.63), G H-4 (δ 3.65)/G H-3 (δ 3.63)/G H-5 (δ 3.80), G H-5 (δ 3.80)/G -6 (δ 3.32) Những tương tác 1H → 1H phổ COSY PS-T80 tương tác proton carbon cận kề cấu trúc PS-T80 Các tương tác bao gồm tương tác G H-2 (δ 3,33)/G H-3 (δ 3,63), G H-4 (δ 3,65)/G H-3 (δ 3,63)/G H-5 (δ 3,80), G H-5 (δ 3,80)/G -6 (δ 3,32); M H-3 (δ 3,16)/M H-2 (δ 3,45)/M H-4 (δ 3,42), M H-5 (δ 3,75)/M H-4 (δ 3,42)/M H-6 (δ 3,38) Tương tự tương tác từ 1H → 13C phổ HMBC, cho thấy tương tác proton với carbon cận kề nhau, tương tác G H-1(δ 4,56)/G C-2 (δ 75,8); G H-2 (δ 3,33)/G C-3 (δ 72,8); G H-3 (δ 3,63)/G C-4 (δ 60,8)/G C-2 (75,8); G H-4 (δ 3,65)/G C-5 (δ 60,6)/G C-3 (δ 72,8); G H-5 (δ 3,80)/G C-6 (δ 69,7); M H-1(δ 5,15)/M C-2 (δ 71,5); M H-3 (δ 3,16)/M C-4 (δ 76,0)/M C-2 (δ 71,5); M H-5 (δ 3,75)/M C-4 (δ 76,0)/M C-6 (δ 69,6) Kết cho phép thiết lập trật tự liên kết hydrogen carbon thành phần đường phân tử PS-T80 15 Bảng 3.22 Độ chuyển dịch C H thành phần đường PS-T80 từ O sobolifera Thành phần đường H-1 H-2 H-3 H-4 H-5 H-6 G →3)-β- D-glucopyranoside-(1→ 4,56 3,33 3,63 3,65 3,80 3,32 M →3)-α-D- mannopyranoside-(1→ 5,15 3,45 3,16 3,42 3,75 3,38 C-1 C-2 C-3 C-4 C-5 C-6 95,9 75,8 72,8 60,8 60,6 69,7 M →3)- α -D- mannopyranoside-(1→ 92,1 71,5 74,2 76,0 71,5 69,6 Thành phần đường G →3)-β- D-glucopyranoside-(1→ Như vậy, cấu trúc đoạn mạch polysaccharide tách chiết 80 C từ mẫu O sobolifera có khối lượng phân tử trung bình 7,4 × 104 Da biểu diễn dạng: o Hình 3.28 Cấu trúc đoạn mạch polysaccharide PS-T80 Cho đến nay, có nhiều cơng trình phân lập xác định cấu trúc polysaccharide từ loài Cordyceps, cơng trình nghiên cứu O sololifera nuôi cấy Việt Nam phát hai cấu trúc khác hẳn với công bố cấu trúc polysaccharide O sobolifera trước 3.4.2 Định lượng polysaccharide Hàm lượng polysaccharide mẫu nghiên cứu dao động khoảng 4,478 % đến 5,384% Hàm lượng polysaccharide đạt giá trị cao 5,561% mẫu kiểm chứng thí nghiệm lần (Bảng 3.7), tương ứng với điều kiện thí nghiệm ni trồng tối ưu: - Khối lượng glucose: 47,12 g - Khối lượng KH2PO4: 1,69 g - Khối lượng MgSO4: 0,74 g - Thể tích dịch chiết ve sầu: 52,2 mL 16 3.4.3 Hoạt tính chống oxy hóa polysaccharide từ nấm Ophiocordyceps sobolifera Hàm lượng hợp chất polysaccharide cao nước chiếm từ 72 -86 % (khối lượng polysaccharide *100 /khối lượng cao nước), cho thấy hoạt tính kháng oxy hóa cao nước polysaccharide định Polysaccharides thu hút ý lớn nhà khoa học thập kỷ qua Sự đa dạng cấu trúc chức sinh học tiềm chúng mang lại đặc tính độc đáo, PS coi nguồn dinh dưỡng có đặc tính sinh học vơ quý giá Các nghiên cứu trước cho thấy, polysaccharides chiết xuất từ Ophiocordyceps sobolifera cung cấp hoạt tính sinh học đáng kể kháng oxy hóa, làm giảm tổn thương thận chuột Vì vậy, chúng tơi tiến hành đánh giá hoạt tính polysaccharide từ nấm Ophiocordyceps sobolifera Các cao chiết nước nhiệt độ khác chứa polysaccharide có cấu trúc khác nhau, nhiệt độ chiết yếu tố định hoạt tính polysaccharide thu Các mẫu polysaccharide thu nhiệt độ chiết i (oC) khác ký hiệu PS-Ti 3.4.3.1 Lực chống oxy hóa tổng theo mơ hình phosphor molybdenum mẫu PS-Ti Kết thực nghiệm lực chống oxy hóa mẫu PS-Ti tăng đáng kể với gia tăng nồng độ từ 0,1 đến 1,5 mg/mL (hình 3.16) Khi tăng nhiệt độ chiết i từ 60°C đến 80°C lực chống oxy hóa mẫu PS-Ti tăng Tuy nhiên, tăng nhiệt độ chiết i từ 90°C lên 100°C, lực chống oxy hóa tổng PS-Ti có giảm khơng đáng kể Hoạt tính polysaccharide chịu ảnh hưởng cấu trúc không gian khối lượng phân tử chúng Sự gia tăng nhiệt độ chiết tăng hiệu suất chiết, đồng thời thu polysaccharide có khối lượng phân tử cao Lượng chất chống oxy hóa biểu thị lượng tương đương gallic acid ascorbic acid mẫu PSTi nồng độ 1,5 mg/mL trình bày Bảng 3.24 Theo kết xác định mục 3.2.1.1., nồng độ 0,5mg/mL hàm lượng chất chống oxy hóa 1g cao nước 12,72 ± 0,29 mg gallic acid /g mẫu) (n=3) 17 7,87 ± 0,11mg ascorbic acid/g mẫu (n=3) Về mặt khối lượng, polysaccharide chiếm 86% cao nước Số liệu bảng cho thấy polysaccharide tinh khiết cung cấp lượng chất chống oxy hóa cao cao nước, chứng tỏ polysaccharide thành phần chủ yếu tạo nên hoạt tính chống oxy hóa cao nước 3.4.3.2 Khả bắt gốc tự DPPH mẫu PS-Ti Hoạt tính chống oxy hóa mẫu polysaccharide chiết nhiệt độ khác khác Khi chiết nhiệt độ cao khoảng từ 60°C đến 80°C nhận polysaccharide có hoạt tính chống oxy hóa cao hoạt tính chống oxy hóa bắt đầu giảm xuống từ nhiệt độ 90°C 100°C Điều thể Bảng 3.24, cách tương đối có tương ứng hoạt tính chống oxy hóa đóng góp hàm lượng chất chống oxy hóa có mẫu PS-Ti Ở nồng độ 2,5mg/mL, mẫu PS-Ti bắt 75% gốc tự do, chứng tỏ mẫu PS thể hoạt tính chống oxy hóa Giá trị IC50 PS-Ti nằm khoảng từ 0,97 mg/mL đến 1,06 mg/mL Mặt khác, mẫu PS-T100 có giá trị IC50 1,05 ± 0,01 mg/mL khối lượng chiết nhiều Mẫu PS-T80 có hoạt tính cao với giá trị IC50 0,97 ± 0,01 mg/mL Nên chọn hai mẫu PS-T100 PS-T80 để xác định cấu trúc mục 3.4.1 l 18 KẾT LUẬN Từ kết nghiên cứu, Luận án đạt số nội dung sau: Ở điều kiện pH =7, nhiệt độ 25°C, thành phần môi trường nuôi cấy glucose: 47,12g; KH2PO4: 1,69g; MgSO4: 0,74g; dịch chiết ve sầu: 52,2 mL thu nhận khối lượng sinh khối nấm O Sobolifera từ 0,806 ÷ 0,880 g, chứa hàm lượng PS từ 5,119 ÷ 5,561%, tổng hợp chất phenol từ 12,025 ÷12,933mg GA/g tổng flavonoid từ 7,920÷ 8,309 mg QE/g Cao nước cao ethanol từ O sobolifera thể hoạt tính chống oxy hóa in vitro gần mơ hình: phosphor molybdenum (thơng qua lực chống oxy hóa tổng), mơ hình bắt gốc tự DPPH (thông qua giá trị IC50) gần với Ganoderma lucidum trồng Thừa Thiên Huế, Việt Nam Hoạt tính chống oxy hóa mẫu cao so với lồi Cordyceps sinensis G lucidum cơng bố trước Mặt khác, lượng chất chống oxy hóa cao nước cung cấp nhiều khoảng lần so với cao ethanol Cao nước từ O sobolifera thể tác dụng bảo vệ thận in vivo chuột nhắt trắng theo hướng chống oxy hóa tương tự quercetin, dựa việc giảm hàm lượng creatinin malondialdehyde hồi phục số giá trị sinh lý bình thường Đã phát hợp chất phenol có hàm lượng lớn cao tồn phần O sobolifera xây dựng quy trình phân tích định lượng chúng phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao Đó gallic acid 193,6 ± 0,02µg/g; hàm lượng quercetin 142,07 ± 0,02µg/g; hàm lượng quercitrin 544,53 ± 0,03µg/g; hàm lượng hesperidin 110,08 ± 0,01µg/g Tổng hợp chất phenol 990,27 µg/g Quercetin, quercitrin, gallic acid, hesperidin chất chống oxy hóa mạnh với IC50 tương ứng 1,93; 2,35; 7,51; 10,23 µg/mL, mạnh nhiều so với curcumin, riêng hoạt tính quercetin cịn mạnh ascorbic acid Hoạt tính chống oxy hóa mẫu polysaccharide chiết nhiệt độ khác khác nhau, với giá trị IC50 khoảng từ 0,97mg/mL đến 1,06mg/mL gần giống kết 19 nghiên cứu trước loài Cordyceps Khi tăng nhiệt độ chiết từ 60°C đến 80°C, mẫu polysaccharide thu tương ứng có hoạt tính tăng lên, tiếp tục tăng nhiệt độ chiết 90 °C đến 100 °C hoạt tính chống oxy hóa polysaccharide thu có giảm không đáng kể Mẫu chiết nhiệt độ 100°C PS-T100, có giá trị IC50 1,05 ± 0,01 mg/mL khối lượng chiết nhiều nhất, có cấu trúc hetero polysaccharide, bao gồm đơn vị lặp lại giống D-glucose D-mannose với khối lượng phân tử trung bình khoảng 2,29 ×105 Da Các kết phổ FT-IR, 1D 2D NMR polysaccharide từ O sobolifera, bao gồm đơn vị [→ 3) -β-DGlcp- (1 → 3) -α-D-Manp- (1 → 3) -β-D-Glcp- (1 → 3) -α-D-Manp(1 → 3) -β-D-Glcp- (1 →]n Mẫu chiết nhiệt độ 80°C PS-T80, có giá trị IC50 0,97 ± 0,01 mg/mL, có hoạt tính chống oxy hóa cao mẫu PS-Ti, có thành phần monosaccharide bao gồm đơn vị lặp lại giống D-glucose D-mannose với khối lượng phân tử trung bình khoảng 7,4 ×104 Da, có đơn vị cấu trúc [→3)-β-Dglucopyranoside-(1→;→3)-α-D-mannopyranoside-(1→;→3)-β-Dglucopyranoside-(1→]n Cả hai cấu trúc polysaccharide lần xác định lồi Ophiocordyceps sobolifera 20 DANH MỤC CÁC CƠNG TRÌNH NGHIÊN CỨU KHOA HỌC CƠNG BỐ * Tạp chí quốc tế Le Trung Hieu, Tran Van Khoa, Le Lam Son, Huynh Thi Ngoc Diep, Nguyen Minh Nhung, Ho Xuan Anh Vu, Tran Thi Van Thi (2019), Preliminary study of the antioxidant properties of Ophiocordyceps sobolifera, IAJPS 2019, 06 (05), 10111-10116 (ISSN 2349-7750) Thi Van Thi Tran; Van Khoa Tran; Xuan Anh Vu Ho; Lam Son Le; Trung Hieu Le; Thi Hong Chuong Nguyen; Chinh Chien Nguyen; Soo Young Kim, Quyet Van Le (2021), Chemical structure of a novel heteroglycan polysaccharide isolated from the biomass of Ophiocordyceps sobolifera, Journal of Molecular Structure, 1232,129986 (Q2, IF: 2.600) * Tạp chí nước Trần Văn Khoa, Lê Trung Hiếu, Lâm Lê Sơn, Trịnh Tam Kiệt, Trần Thị Văn Thi (2019), Extraction optimisation of Ophiocordyceps sobolifera polysaccharides with antoxidant activities, Tạp chí Hoá học,57(4E3,4),pp 313-318 Khoa Van Tran, Hieu Trung Le, Son Lam Le, Vu Xuan Anh Ho, Kiet Tam Trinh, Thi Thi Van Tran (2019), Effect of extraction temperatures on in vitro antioxidant activities of polysaccharides from Ophiocordyceps sobolifera, vol 128, No 1D (2019): Hue University Journal of Science: Natural Science Trần Văn Khoa, Lê Trung Hiếu, Trần Thanh Minh, Hồ Xuân Anh Vũ, Trần Thị Văn Thi (2020), Ảnh hưởng hệ dung môi chiết đến hàm lượng tổng hợp chất Phenol, tổng flavonoic hoạt tính chống oxy hoá cao chiết từ nấm Ophiocordyceps sobolifera Tập 17, số 2, trang 11-23, Tạp chí khoa học công nghệ Trường Đại Học Khoa học Huế  ... hoá học số hợp chất có hoạt tính sinh học Ý nghĩa khoa học thực tiễn: Nghiên cứu nuôi trồng khảo sát thành phần hố học số hợp chất có hoạt tính sinh học thay đổi nguồn dinh dưỡng nuôi trồng nấm. .. chưa có nghiên cứu lồi Ophiocordyceps sobolifera chưa thấy có mặt thị trường Với lý trên, đề tài lựa chọn luận án : NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG VÀ KHẢO SÁT MỘT SỐ HỢP CHẤT CĨ HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA NẤM... trồng 2.4 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU Khảo sát điều kiện nuôi trồng nấm Ophiocordyceps sobolifera đến khối lượng sinh khối hàm lượng hoạt chất polysaccharide, hợp chất phenol flavonoid Khảo sát số hoạt