bằng phương pháp trắc nghiệm sinh hóa
4.2.1. Khảo sát sự hiện diện của flavonoid 4.2.1.1. Tác dụng với H2SO4 đậm đặc
Để khảo sát sự hiện diện của hợp chất flavonid, nhỏ 1ml dung dịch H2SO4 đậm đặc vào từng dịch chiết. Kết quả thu nhận được trình bày trong bảng 4.1
Bảng 4.1 kết quả thử nghiệm với dung dịch H2SO4 đậm đặc Dịch chiết Hiện tượng
Hoa sấy khô (M1) Đậm màu
Cành lá tự nhiên (M2) Đậm màu
Mô sẹo trên môi trường MS có bổ sung 0.1
mg/l 2,4-D + 1mg/l BA (M3) Đậm màu
Mô sẹo trên môi trường MS có bổ sung 0.5
mg/l TDZ + 0.05 mg/l IBA (M4) Đậm màu
Hình 4.3 kết quả phản ứng H2SO4 đậm đặc
• M1: mẫu hoa sấy khô.
• M2: mẫu cành lá sấy khô.
• M3: mẫu mô sẹo được nuôi cấy trên môi trường MS có bổ sung 0.1 mg/l 2,4- D, 1 mg/l BA.
• M4: mẫu mô sẹo được nuôi cấy trên môi trường MS có bổ sung 0.5 mg/l TDZ, 0.05 mg/l IBA.
4.2.1.2. Tác dụng với FeCl3 5% trong ethanol
Để khảo sát sự hiện diện của hợp chất flavonid, nhỏ 1ml dung dịch FeCl3 5% vào từng dịch chiết. Kết quả thu nhận được trình bày trong bảng 4.2
Bảng 4.2: kết quả thử nghiệm với FeCl3 5% Dịch chiết Hiện tượng
Hoa sấy khô (M1) Xuất hiện vòng xanh đen Lá cành tự nhiên (M2) Xuất hiện vòng xanh đen Mô sẹo trên môi trường MS có bổ sung 0.1
mg/l 2,4-D + 1mg/l BA (M3) Xuất hiện vòng xanh đen Mô sẹo trên môi trường MS có bổ sung 0.5
mg/l TDZ + 0.05 mg/l IBA (M4) Không đổi màu
ĐC
M1 M2
M4 ĐC
Hình 4.4 kết quả thử nghiệm với FeCl3 5%
• M1: mẫu hoa sấy khô.
• M2: mẫu cành lá tự nhiên sấy khô.
• M3: mẫu mô sẹo được nuôi cấy trên môi trường MS có bổ sung 0.1 mg/l 2,4- D, 1 mg/l BA.
• M4: mẫu mô sẹo được nuôi cấy trên môi trường MS có bổ sung 0.5 mg/l TDZ, 0.05 mg/l IBA. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
• ĐC: là dịch chiết các mẫu ban đầu
4.2.1.3. Phản ứng Cyanidin của Wilstatter
Phản ứng dựa trên sự khử bằng bột Mg trong HCl/ethanol trên các dẫn xuất flavonoid. Kết quả thu nhận được trình bày trong bảng 4.3
Bảng 4.3 kết quả thử nghiệm phản ứng Cyanidin Dịch chiết Hiện tượng
Hoa sấy khô (M1) Xuất hiện màu đỏ đậm Lá cành tự nhiên (M2) Xuất hiện màu đỏ Mô sẹo trên môi trường MS có bổ sung 0.1
mg/l 2,4-D + 1mg/l BA (M3) Không đổi màu Mô sẹo trên môi trường MS có bổ sung 0.5
mg/l TDZ + 0.05 mg/l IBA (M4) Không đổi màu ĐC
M2
Hình 4.5 kết quả thí nghiệm Cyanidin
• M1: mẫu hoa sấy khô.
• M2: mẫu cành lá tự nhiên sấy khô.
• M3: mẫu mô sẹo được nuôi cấy trên môi trường MS có bổ sung 0.1 mg/l 2,4- D, 1 mg/l BA sấy khô.
• M4: mẫu mô sẹo được nuôi cấy trên môi trường MS có bổ sung 0.5 mg/l TDZ, 0.05 mg/l IBA.
• ĐC: là dịch chiết mẫu ban đầu.
ĐC ĐC
ĐC
M1 M2
M3 M4
4.2.1.4. Kết luận sơ bộ
Bảng 4.4 tóm tắt kết quả khảo sát sự hiện diện của hợp chất flavonoid bằng phương pháp trắc nghiệm hóa sinh
H2SO4 đậm đặc FeCl3 5% Phản ứng Cyanidin
Mẫu hoa sấy khô Đậm màu Xanh đen Đỏ
Mẫu cành lá tự nhiên
Đậm màu Xanh đen Đỏ
Mẫu mô sẹo trên môi trường MS có bổ sung 0.1 mg/l 2,4-D + 1mg/l BA
Đậm màu Xanh đen Không đổi màu
Mô sẹo trên môi trường MS có bổ sung 0.5 mg/l TDZ + 0.05 mg/l IBA
Đậm màu Không đổi màu Không đổi màu
Theo Nguyễn Kim Phi Phụng (2007) đã ghi nhận rằng, nếu dịch chiết có chứa hợp chất flavonoid thì:
+ Dịch chiết đậm màu lên khi tác dụng với dung dịch H2SO4 đậm đặc, + Dịch chiết xuất hiện màu xanh đen khi tác dụng với FeCl3 5% . + Dịch chiết xuất hiện màu đỏ trong phản ứng Cyanidin (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Từ kết quả của các thí nghiệm (bảng 4.4) cho thấy, trong dịch chiết của hoa sấy khô, cành lá tự nhiên đều cho kết quả dương tính với các phản ứng dung dịch FeCl3 5%, dung dịch H2SO4 đậm đặc và phản ứng Cyanidin . Điều này chứng tỏ, trong dịch chiết của hoa sấy khô có thể có sự hiện diện của hợp chất flavonoid. Kết quả này phù hợp với kết quả nghiên cứu của Đỗ Tất Lợi (2004),trong hoa, cành lá cây Kim ngân có chứa lonicerin là hợp chất thuộc nhóm flavonoid. Phạm Thanh Kỳ và cộng sự (2002) cũng đã ghi nhận hoa, cành lá tự nhiên của cây Kim ngân chứa flavonoid, chất chính là luteolin-7-rutinosid. Bằng phương pháp HPLC Wie-Jong Kwak cùng cộng sự (2005) đã xác định được hàm lượng loganin từ 13.9%-41.4% thuộc nhóm flavonoid trong cành lá của cây Kim Ngân.
Dưới sự kích thích của các chất điều hòa sinh trưởng thực vật khác nhau, mô sẹo hình thành cũng khác nhau về hình thái và màu sắc. Trên môi trường có bổ sung 0.1 mg/l 2,4-D + 1mg/l BA mô sẹo hình thành có màu nâu, xốp, thành khối. Còn trên môi trường có bổ sung 0.5 mg/l TDZ + 0.05 mg/l IBA mô sẹo hình thành có màu xanh lục, tạo thành khối, cứng.
Qua ba phản ứng đặc trưng để khảo sát sự có mặt của nhóm hợp chất flavonoid thì có thể tạm thời kết luận rằng trong dịch chiết mô sẹo trên môi trường MS có bổ sung 0.1 mg/l 2,4-D + 1mg/l BA có thể có sự hiện diện của nhóm flavonoid.
Dịch chiết mô sẹo trên môi trường MS có bổ sung 0.5 mg/l TDZ + 0.05 mg/l IBA cho kết quả âm tính với phản ứng FeCl3 5% và phản ứng Cyanidin nhưng lại dương tính với phản ứng H2SO4 đậm đặc. Tuy nhiên không thể kết luận mô sẹo này có chứa nhóm flavonoid vì H2SO4 đậm đặc là acid mạnh nên có thể có tính phân hủy mạnh đối với một số hợp chất khác ngoài nhóm flavonoid dẫn tới dương tính giả. Từ đó kết luận rằng, dịch chiết mô sẹo trên môi trường MS có bổ sung 0.5 mg/l TDZ + 0.05 mg/l IBA có thể không có sự hiện diện của nhóm hợp chất flavonoid.
4.2.2. Khảo sát sự hiện diện của triterpenoid saponin bằng phản ứng Liebermann-Burchard
Trong mỗi ống nghiệm chứa 1ml dịch chiết mẫu thêm vào đó: 1ml anhydrid acetic, 1ml cloroform, làm lạnh ống nghiệm rồi thêm 1 giọt H2SO4 đậm đặc. Nếu dịch chiết mẫu đổi thành màu xanh dương lục, cam hoặc đỏ; màu này bền không đổi là dương tính. Kết quả thu nhận được trình bày trong bảng 4.5
Bảng 4.5 Kết quả thử nghiệm phản ứng Liebermann – Burchard Dịch chiết Hiện tượng
Hoa sấy khô (M1) Xuất hiện màu cam đỏ ở mặt phân cách Lá cành tự nhiên (M2) Xuất hiện màu cam đỏ ở
mặt phân cách Mô sẹo trên môi trường MS có bổ sung 0.1
mg/l 2,4-D + 1mg/l BA (M3)
Xuất hiện màu cam đỏ ở mặt phân cách Mô sẹo trên môi trường MS có bổ sung 0.5
Hình 4.6 kết quả phản ứng Liebermann – Burchard
• M1: mẫu hoa sấy khô.
• M2: mẫu cành lá sấy khô.
• M3: mẫu mô sẹo được nuôi cấy trên môi trường MS có bổ sung 0.1 mg/l 2,4- D, 1 mg/l BA.
• M4: mẫu mô sẹo được nuôi cấy trên môi trường MS có bổ sung 0.5 mg/l TDZ, 0.05 mg/l IBA.
Kết quả thí nghiệm cho thấy:
- Trong dịch chiết mẫu hoa sấy khô, cành lá tự nhiên có sự xuất thiện vòng cam đỏ. Kết quả cho thấy có thể có sự hiện diện của triterpenoid saponin trong mẫu. Kết quả này phù hợp với kết quả nghiên cứu của Đỗ Tất Lợi (1964), trong Kim ngân có nhiều saponin. Wie Jong Kwak và cộng sự (2003) phát hiện Loniceroside C là những hợp chất thuộc nhóm triterpenoid saponin trong Kim ngân bằng phương pháp HPLC.
- Dịch chiết của mẫu mô sẹo trên môi trường MS có bổ sung 0.1 mg/l 2,4-D + 1 mg/l BA có sự xuất hiện vòng cam đỏ ở mặt phân cách. Điều này chứng tỏ rằng có thể có sự hiện diện của nhóm hợp chất saponin triterpenoid trong mô sẹo này.
- Dịch chiết của mẫu mô sẹo trên môi trường MS có bổ sung 0.5 mg/l TDZ + 0.05 mg/l IBA trong phản ứng Liebermann-Burchad không đổi màu. Điều này chứng tỏ có thể không có sự hiện diện của nhóm hợp chất saponin triterpenoid trong mô sẹo này.
4.3. Thí nghiệm 2: khảo sát thành phần flavonoid và saponin triterpenoid bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng (TLC)
4.3.1. Khảo sát sự hiện diện flavonoid
Sắc ký lớp mỏng rất hữu dụng đối với tất cả các loại flavonoid. Các aglycon của flavonol và flavon dễ dàng tách xa nhau (Nguyễn Kim Phi Phụng, 2007). Vì vậy chỉ cần trong dịch chiết mẫu có một lượng rất nhỏ hợp chất flavonoid thì bằng sắc ký lớp mỏng (TLC) vẫn có thể phát hiện được bằng cách hiện ra các vết màu đặc trưng với thuốc thử đặc trưng.
Hệ dung môi: CHCl3 : metanol = 89 : 11.
Hệ dung môi này giúp tách các thành phần flavonoid, anthranoid, coumarin, phenolcarbocyclic acid dưới dạng glycosid có trong dịch chiết (Nguyễn Thị Bích, 2006). Bản sắc ký sau khi được giải ly sẽ được nhúng qua thuốc thử đặc trưng là FeCl3 5% /ethanol. Kết quả thu được được trình bày ở bảng 4.7
Dịch chiết Hiện tượng
Hoa sấy khô (M1) Vết màu xanh đen
Cành lá tự nhiên (M2) Vết màu xanh đen Mô sẹo trên môi trường MS có bổ sung 0.1
mg/l 2,4-D + 1mg/l BA (M3) Vết màu xanh đen Mô sẹo trên môi trường MS có bổ sung 0.5 (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
mg/l TDZ + 0.05 mg/l IBA (M4) Không có vết
Hình 4.7 bản sắc ký sau khi nhúng thuốc thử FeCl3 5%
• M1: mẫu hoa sấy khô.
• M2: mẫu cành lá tự nhiên.
• M3: mẫu mô sẹo được nuôi cấy trên môi trường MS có bổ sung 0.1 mg/l 2,4- D, 1 mg/l BA .
• M4: mẫu mô sẹo được nuôi cấy trên môi trường MS có bổ sung 0.5 mg/l TDZ, 0.05 mg/l IBA.
Hệ dung môi: etyl acetate : methanol : nước = 100 : 17 : 13
Hệ dung môi trên giúp tách phần lớn các acid phenolic, coumarin và flavonoid dưới dạng aglycon (Nguyễn Thị Bích, 2006). Bản sắc ký sau khi được giải
ly đã được nhúng qua thuốc thử là FeCl3 5% / ethanol. Kết quả thu nhận được trình bày ở bảng 4.8.
Bảng 4.8: kết quả của thí nghiệm khảo sát hợp chất flavonoid bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng (TLC)
Dịch chiết Hiện tượng
Hoa sấy khô (M1) Vết màu xanh đen
Cành lá tự nhiên (M2) Vết màu xanh đen Mô sẹo trên môi trường MS có bổ sung 0.1
mg/l 2,4-D + 1mg/l BA (M3) Vết màu xanh đen Mô sẹo trên môi trường MS có bổ sung 0.5
mg/l TDZ + 0.05 mg/l IBA (M4) Không có vết
Hình 4.8 bản sắc ký sau khi nhúng thuốc thử FeCl3 5%
• M1: mẫu hoa sấy khô.
• M2: mẫu cành lá sấy khô.
• M3: mẫu mô sẹo được nuôi cấy trên môi trường MS có bổ sung 0.1 mg/l 2,4- D, 1 mg/l BA.
• M4: mẫu mô sẹo được nuôi cấy trên môi trường MS có bổ sung 0.5 mg/l TDZ, 0.05 mg/l IBA.
Nhận xét: 2 hệ dung mô khảo sát đều rất phù hợp vì hệ đều cho các vết chính hiện diện trong khoảng 1/3 đến 2/3 chiều dài triển khái bản mỏng (Nguyễn Kim Phi Phụng, 2007).
Nguyễn Kim Phi Phụng (2007) đã ghi nhận các hợp chất thuộc nhóm flavonoid có màu xanh đen đối với thuốc thử đặc trưng là FeCl3 5% . Do vậy từ bảng kết quả 4.7, bảng 4.8 có thể kết luận:
+ Dịch chiết hoa, cành lá tự nhiên, dịch chiết mô sẹo trong môi trường MS bổ sung 0.1 mg/l 2,4-D, 1 mg/l BA có thể có sự hiện diện của nhóm hợp chất flavonoid.
+ Còn dịch chiết mô sẹo trong môi trường MS có bổ sung 0.5 mg/l TDZ, 0.05 mg/l IBA có thể không có sự hiện diện của nhóm hợp chất flavonoid
4.3.2. Khảo sát sự hiện diện triterpenoid
Hệ dung môi: CHCl3 : MeOH : H2O = 65 : 35 : 10
Hệ dung môi trên giúp tách các thành phần saponin, terpenoid dạng glycosid, alkaloid (Nguyễn Kim Bích, 2006). Bản sắc ký sau khi giải ly được nhúng qua thuốc thử là H2SO4 10% / ethanol và sau đó đem sấy ở 110oC từ 5 – 10 phút. Kết quả thu nhận được trình bày trong bảng 4.9
Bảng 4.9: kết quả của thí nghiệm khảo sát hợp chất saponin triterpenoid bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng (TLC)
Dịch chiết Hiện tượng
Hoa sấy khô (M1) Vết màu tím đen (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Cành lá tự nhiên (M2) Vết màu tím đen Mô sẹo trên môi trường MS có bổ sung 0.1
mg/l 2,4-D + 1mg/l BA (M3) Vết màu tím đen Mô sẹo trên môi trường MS có bổ sung 0.5
Hình 4.8 bản sắc ký sau khi sấy
• M1: mẫu hoa sấy khô.
• M2: mẫu cành lá sấy khô.
• M3: mẫu mô sẹo được nuôi cấy trên môi trường MS có bổ sung 0.1 mg/l 2,4- D, 1 mg/l BA.
• M4: mẫu mô sẹo được nuôi cấy trên môi trường MS có bổ sung 0.5 mg/l TDZ, 0.05 mg/l IBA.
Hệ dung môi n-Butanol : acid acetic : H2O = 4 : 1 : 5
Hệ dung môi trên giúp tách các thành phần đường của saponin triterpenoid, thành phần acid amin, các thành phần phân cực khác (Nguyễn Kim Bích, 2006). Bản sắc ký sau khi giải ly được nhúng qua thuốc thử là H2SO4 10% / ethanol và sau đó đem sấy ở 110oC từ 5 – 10 phút. Kết quả thu nhận được trình bày trong bảng 4.10.
Bảng 4.10: kết quả của thí nghiệm khảo sát hợp chất saponin triterpenoid bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng (TLC)
Dịch chiết Hiện tượng
Hoa sấy khô (M1) Vết màu tím đen
Cành lá tự nhiên (M2) Vết màu tím đen Mô sẹo trên môi trường MS có bổ sung 0.1
mg/l 2,4-D + 1mg/l BA (M3) Vết màu tím đen Mô sẹo trên môi trường MS có bổ sung 0.5
mg/l TDZ + 0.05 mg/l IBA (M4) Có vết màu không rõ ràng
Hình 4.9 bản sắc ký sau khi sấy
• M1: mẫu hoa sấy khô.
• M2: mẫu cành lá sấy khô.
• M3: mẫu mô sẹo được nuôi cấy trên môi trường MS có bổ sung 0.1 mg/l 2,4- D, 1 mg/l BA.
• M4: mẫu mô sẹo được nuôi cấy trên môi trường MS có bổ sung 0.5 mg/l TDZ, 0.05 mg/l IBA.
Nhận xét: 2 hệ dung mô khảo sát đều rất phù hợp vì hệ đều cho các vết chính hiện diện trong khoảng 1/3 đến 2/3 chiều dài triển khái bản mỏng (Nguyễn Kim Phi Phụng, 2007).
Nguyễn Kim Phi Phụng (2007) đã ghi nhận rằng các hợp chất thuộc nhóm saponin triterpenoid hay dẫn xuất của terpen có vết màu tím trên bản sắc ký với thuốc thử đặc trưng là H2SO4 10%. Do vậy từ kết quả của bảng 4.9, bảng 4.10 có thể kết luận sơ bộ:
+ Dịch chiết hoa, cành lá tự nhiên, dịch chiết mô sẹo trong môi trường MS bổ sung 0.1 mg/l 2,4-D, 1 mg/l BA có thể có sự hiện diện của nhóm hợp chất sapoin triterpenoid.
+ Còn dịch chiết mô sẹo trong môi trường MS có bổ sung 0.5 mg/l TDZ, 0.05 mg/l IBA có thể không có sự hiện diện của nhóm hợp chất saponin triterpenoid.