CHƯƠNG 3: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIấN CỨU
3.2.3.1. Chuẩn bị húa chất và thuốc thử:
Cụng thức tớnh phospho:
m: khối lượng mẫu ban đầu (g) V: thể tớch mẫu được lấy (ml)
3.2.3. Phương phỏp định lượng Phospho vụ cơ [Chen et al; Analytical Chemistry, 1956 ]
3.2.3.1. Chuẩn bị húa chất và thuốc thử:
- H2SO4 6N
- 2.5% ammonium molybdate
- 10% ascorbic acid (mỗi lần pha sử dụng trong 7 tuần và bảo quản ở nhiệt độ 0–5 °C). - 12.5%TCA + 25mM MgCl2: kết hợp 250ml 50% TCA và 5.08g MgCl2 , sau đú hũa
tan với nước cất cho đủ 1 lớt.
- Dung dịch KH2PO4 1mM: cõn 0.1361g KH2PO4 hũa tan với nước cất và định mức đến 1 lớt.
- Dung dịch KH2PO4 0.5mM: lấy chớnh xỏc 100ml dung dịch KH2PO4 1mM định mức lờn 200ml bằng nước cất.
- Thuốc thử: 1 thể tớch H2SO4 6N, 1 thể tớch 2.5% ammonium molybdate, 1 thể tớch 10% ascorbic acid và 2 thể tớch nước khử khoỏng. Sau đú lắc đều hỗn hợp thuốc thử (thuốc thử chỉ sử dụng trong 24 giờ). - Mẫu Trắng : hỳt 10ml hỗn hợp 12.5%TCA + 25mM MgCl2 định mức đến 25ml bằng nước cất. 3.2.3.2. Dựng đường chuẩn STT 0 1 2 3 4 V P( 0,1mg/ml), ml 0 1 2 3 4 mg P/25ml 0 0,1 0,2 0,3 0,4 V molybdovanadate, ml 5ml Nước cất Định mức thành 25ml
TT 0 1 2 3 4 5 6 7 8 Thể tớch KH2PO4 0.5mM (ml) 0 0.04 0.1 0.2 0.3 0.46 0.6 0.9 1 Nước cất (ml) 1 0.96 0.9 0.8 0.7 0.54 0.4 0.1 0 Thuốc thử (ml) 1 1 1 1 1 1 1 1 1 Pi (μg) 0 0.62 1.55 3.1 4.65 7.13 9.3 13.9 5 15.5 3.2.3.2. Cỏch tiến hành
- Cõn khoảng 0,5g mẫu (mẫu đó được sấy ở nhiệt độ 700C hơn 3 ngày) vào ống nghiệm 15ml.
- Bổ sung 10 ml dung dịch (12,5% TCA + 25mM MgCl2), đậy nắp lại và lắc kỹ. Sau đú chuyển qua mỏy lắc tại nhiệt độ lạnh khoảng 40C trong vũng 24 giờ (Phụ lục).
- Lấy ống nghiệm ra khỏi mỏy lắc, tiến hành ly tõm lạnh (40C) tại 5000 vũng/ phỳt trong 15 phỳt và chuyển phần dịch nổi vào bỡnh định mức 25ml. Sau đú định mức đến 25ml bằng nước cất rồi lắc đều.
- Hỳt 1ml dịch mẫu và 1ml thuốc thử vào ống nghiệm. sau đú lắc đều và ủ ở nhiệt độ 370C trong 1 giờ. (Mẫu trắng là 10ml dung dịch (12,5% TCA + 25mM MgCl2) định mức đến 25ml sau đú hỳt 1ml hỗn hợp dung dịch vừa định mức và 1ml thuốc thử) - Sau khi ủ xong đem đo mật độ quang ở bước súng 820nm.
- Hàm lượng Pi được tớnh theo cụng thức sau:
m: khối lượng mẫu ban đầu (g) V: thể tớch mẫu được lấy (ml)