Khảo sát khả năng đối kháng của vi khuẩn bacillus spp đối với vi khuẩn gây bệnh cháy bìa lá lúa xanthodomonas oryzae pv oryzae và hiệu quả phòng trị trong điều kiện nhà lưới

đối với nấm gây bệnh đốm vằn trên lúa Rhizoctonia solani Kuhn và hiệu quả phòng trị trong điều kiện nhà lưới” Luận văn thạc sĩ chuyên ngành Bảo vệ Thực vật, Khoa Nông Nghiệp & Sinh Học ứ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÀN THƠ KHOA NÔNG NGHIỆP & SHƯD

LƯU THẾ HÙNG

KHẢO SÁT KHẢ NĂNG ĐỐI KHÁNG CỦA

CÁC CHỦNG VI KHUẨN BACILLUS SPP ĐÓI

VỚI NẤM GÂY BỆNH ĐỐM YẰN HẠI LÚA

(RHIZOCTONIA SOLANIKUHN) YÀ KHẢ

NĂNG PHÒNG TRỊ TRONG ĐIỀU KIỆN NHÀ LƯỚI

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP CAO HỌC NGÀNH BẢO VỆ THỰC VẬT

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÀN THƠ KHOA NÔNG NGHIỆP & SHƯD

LƯU THẾ HÙNG

KHAO SÀT KHA NẢNG ĐÔI KHÀNG CÜA

CÁC CHỦNG VI KHUẨN BACILLUS SPP ĐÓI

VỚI NẤM GÂY BỆNH ĐỐM YẰN HẠI LÚA

(RHIZOCTONIA SOLANIKUHN) YÀ KHẢ

NĂNG PHÒNG TRỊ TRONG ĐIỀU KIỆN NHÀ LƯỚI

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP CAO HỌC • • • NGÀNH BẢO VỆ THựC VẬT • « •

Mã số 60 62 01 12

CÁN Bộ HƯỚNG DẪN Ts

TRẦN VŨ PHÉN

CHẤP THUẬN CỦA HỘI ĐỒNG

Luận văn này, với đề tựa là “Khảo sát khả năng đối kháng của vi khuẩn Bacillus spp đối với nấm gây bệnh đốm vằn trên lúa {Rhizoctonia solani Kuhn) và hiệu quả phòng trị trong điều kiện nhà

lưới” do Lưu Thế Hùng thực hiện theo sự hướng của TS Trần Vũ Phến Luận văn đã báo cáo và được hội đồng chấm luận văn thông qua ngày

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam kết luận văn này được hoàn thành dựa trên các kết quả nghiên cứu của tôi trong khuôn khổ của đề tài “ứng dụng vi khuẩn vùng thân, lá và vùng rễ lúa kết hợp với dẫn xuất chitosan để phòng trừ một số bệnh hại quan trọng và kích thích tăng trưởng trên lúa” Dự án có quyền sử dụng kết quả của luận văn này để phục vụ cho dự án

Tác giả luận văn

Lưu Thế Hùng

LỜI CẢM TẠ

Kính dâng lên Ba, Mẹ

Người đã suốt đời nuôi dưỡng, dạy dỗ và hy sinh tất cả để nuôi con khôn lớn nên người Những người thân đã giúp đỡ, động viên tôi trong suốt thời gian qua

Chân thành biết ơn Thầy hướng dẫn khoa học:

TS Trần Vũ Phến đã tận tình hướng dẫn các nội dung, phương pháp và truyền đạt kiến thức chuyên môn, giúp đỡ và động viên tôi rất nhiều trong suốt thời gian thực hiện và hoàn thành luận văn này

Anh/chị, các bạn học viên khóa 18 lớp Cao học Bảo Vệ Thực Vật đã giúp đỡ và chia sẻ những khó khăn với tôi trong thời gian qua

Sở Khoa Học và Công Nghệ Hậu Giang đã hỗ trợ kinh phí cho đề tài của chúng tôi

Sau cùng, xin kính chúc quý Thầy, Cô và Anh, Chị lời chúc sức khỏe, hạnh phúc và thành đạt trong cuộc sống!

Tác giả luận văn

LÝ LỊCH KHOA HỌC

I LÝ LỊCH Sơ LƯỢC

Ngày, tháng, năm sinh: 05/03/1989 Nơi sinh: Long Xuyên, An Giang

Chỗ ở hiện nay: 3/C Đinh Công Tráng, p Xuân Khánh, Q Ninh Kiều, TPCT

Chỗ ở hiện nay: 3/C Đinh Công Tráng, p Xuân Khánh, Q Ninh Kiều, TPCT

Chỗ ở hiện nay: 3/C Đinh Công Tráng, p Xuân Khánh, Q Ninh Kiều, TPCT

II QUÁ TRÌNH HỌC TẬP

- Từ năm 2007 đến 2011: Học Đại học chuyên ngành Trồng Trọt tại trường Đại Học Cần Thơ

- Từ năm 2011 đến nay: Học Cao học chuyên ngành Bảo Vệ Thực Vật tại Khoa Nông Nghiệp và Sinh Học ứng Dụng, trường Đại học cần Thơ

Ngày tháng năm 2014 Người khai ký tên

Lưu Thế Hùng

DANH SÁCH CHỮ VIẾT TẮT

B amyloliquefaciens Bacillus amyloliquefaciens CSB

Chỉ số bệnh

R solani Rhizoctonia solani

trên giống OM 4900

Lưu Thế Hùng (2014), “Khảo sát khả năng đối kháng của vi khuẩn Bacillus spp đối với nấm gây bệnh đốm vằn trên lúa (Rhizoctonia solani Kuhn) và hiệu quả phòng trị trong điều kiện nhà lưới”

Luận văn thạc sĩ chuyên ngành Bảo vệ Thực vật, Khoa Nông Nghiệp & Sinh Học ứng Dụng, Trường Đại học cần Thơ

Cán bộ hướng dẫn: Ts Trần Vũ Phến

TÓM TẮT

Đe tài được thực hiện tại Bộ Môn Bảo Vệ Thực Vật, Khoa Nông Nghiệp & Sinh Học ửng Dụng, Trường Đại Học cần Thơ, nhằm mục tiêu chọn lọc các chủng vi khuẩn đối kháng có khả năng kiểm soát bệnh đốm vằn, và bước đầu tìm hiểu cơ chế đối kháng với nấm Rhizoctonia solani của các chủng vi khuẩn đổi kháng triển vọng Nấm gây bệnh Rhizoctonia solani được thu thập từ những cây bệnh trong ruộng và được thử khả năng gây bệnh qua quy trình Koch, 3 dòng nấm R solani Rhiz- CTA2, Rhiz-LM1, Rhiz-PH2 và có khả năng gây bệnh cao và được sử dụng làm nguồn nấm gầy bệnh cho các thí nghiệm tiếp theo

Kết quả tuyển chọn đã xác định một sổ chủng vi khuẩn đổi kháng có khả năng đối kháng với nấm Rhizoctonia solani gây bệnh đốm vằn, trong đó 17 chủng có biểu hiện đổi kháng tot với nấm Rhizoctonia solani Khảo sát hiệu quả tác động của 17 chủng vi khuẩn đổi với 3 dòng nấm Rhiz- CTA2, Rhiz-LM1 và Rhiz-PH2 đã chọn được 3 chủng có khả năng đối kháng tốt là LM2.15et, LM3.16et, PH5.8et với bán kính vòng vô khuẩn tương ứng là 310 mm, 330 mm và 310 mm

Kấ quả đánh giá hiệu quả kiểm soát bệnh đốm vằn trong điều kiện nhà lưới, cho thấy cả 3 chủng LM2.15et, LM3.16et, PH5.8et đều có khả năng kiểm soát bệnh tương đương với vi khuẩn Bacillus amyloliquefaciens và cho hiệu quả giảm bệnh tương đương với đối chứng dương thuốc Carbenda Supper 50SC Ở thời điểm 14 ngày sau khi lây bệnh, nghiệm thức được xử lý với 3 chủng Bacillus PH2.6t LM2.15et, LM3.16et, PH5.8et có hiệu quả giảm bệnh là 45,67%, 43,81% và 47,59% khi xử

lý bằng biện pháp phun sau tương đương vói hiệu quả giảm bệnh của vi khuẩn B amyloliquefaciens về biện pháp xử lý, hiệu quả giảm bệnh của xử lý phun sau (45,25%) cao hơn so với xử lý phun 1 ngày trước khi lây bệnh (27,37%) và áo hạt (26,91%)

Khảo sát cho thấy 3 chủng LM2.15et, LM3.16et, PH5.8et có biểu hiện khả năng phân giải chitin với bán kính quầng trong suốt trên môi trường chitin agar với bán kính lần lượt là 14,67 mm, 14,33 mm

và 17,67 mm

Luu The Hung (2014), "Investigation of the antagonistic capability of Bacillus bacteria against

Rhizoctonia solani Kuhn and their effectiveness in the control of rice sheath blight disease in the

screen house condition" M.Sc Thesis in Plant Protection, College of Agriculture and Applied biology, Can Tho University Supervisor: Dr Tran Vu Phen

SUMMARY

The research was carried out from October 2012 to October 2013 in the Department of Plant protection, College of Agriculture and Applied Biology, Can Tho University, aim to screen bacteria able to manage rice sheath blight of rice disease and to preliminarily understand the antagonistic mechanism of some prospecting bacteria strains versus Rhizoctonia solani Fungal pathogens, R solani were isolated from diseased plant and were tested their pathogenicity on rice by Koch's postulates, the result showed that three isolaties namely Rhiz-CTA2, Rhiz- LM1 and Rhiz-PH2 were high pathogenic and were used as a inoculation source moution in next experiments The results have identified a number of bacterial antagonists capable of inhibitiing the growth of R solani in which seventeenth expressed outstanding isolates were selected to test their antagonistic effects against three R solani i.e Rhiz-CTA2, Rhiz-LMl and Rhiz-PH2 Results had showed three strong bacterial antagonists were LM2.15et, LM3.16et, and PH5.8et with inhibition zone radius reached

310 mm, 330 mm and 310 mm, respectively Result of screen house experiment for rice sheath blight control, showed that all three bacterial antagonist strains LM2.15et, LM3.16et, PH5.8et were potential biocontrol agents of the rice sheath blight disease equally to Bacillus amyloliquefaciens and equal to Carbenda Supper 50SC fungicide At 14 days after infection, the treatment with Bacillus strain LM2.15et, LM3.16et, or PH5.8et by spraying one day after inoculation with pathogen retained disease suppression of 45,67%, 43,81% va 47,59%, respectively and not significantly different to B amyloliquefaciens Treatment of antagonists by spraying one day after inoculation with pathogen have disease suppression by 45.25%, higher in comparison with one day before pathogen inoculation treatment (27.37%) or seed-coating treatment (26.91%) Chitinase activity assay on chitin medium showed that three bacterial strains LM2.15et, LM3.16et, PH5.8et have expressed the chitinolytic activity, with the chitin lysed halo radius of 14.67 mm, 14.33 mm and 17.67 mm, respectively at twenty days after testing

Keywords: bacterial antagonists, biocontrol, R solani, rice sheath blight disease

MUC LUC « •

2.10 Hiệu quả và triển vọng phòng trừ sinh học của vi khuẩn ^ Bacillus amylolique/aciens

3.1.1 Thời gian thực hiện đề tài 19

3.2.2 Thí nghiệm 1: Đánh giá khả năng gây bệnh đốm vằn trên lúa

do nấm Rhizoctonia solani của các mẫu bệnh thu thập được (thực 21

hiện quy trình Kock)

3.2.3 Thí nghiệm 2: Đánh giá khả năng đối kháng của các chủng

vi khuẩn có lợi đối với nấm Rhizoctonia solani trong điều kiện in 23

vitro

3.2.4 Thí nghiệm 3: Khảo sát khả năng phân giải chitin của các 26

dòng vi khuẩn đối kháng có triển vọng trong điều kiện in vitro

3.2.5 Thí nghiệm 4: Đánh giá khả năng kiểm soát bệnh đốm vằn

in vivo

hại cao nhất trong điều kiện nhà lưới

4.2 Tuyển chọn các chủng vi khuẩn Bacillus đối kháng với nấm

R solani trong điều kiện in vitro

4.2.1 Bán kính vòng vô khuẩn ở các thời điểm 3 NSTN, 5 NSTN,

7 NSTN

4.2.2 Hiệu suất ức chế ở các thời điểm 3 NSTN, 5 NSTN, 7

NSTN

spp có triển vọng trên môi trường chitin agar

phòng trừ sinh học trong điều kiện nhà lưới

4.4.1 Ảnh hưởng của các tác nhân xử lý đến chỉ số bệnh ở các

thời điểm 4, 6, 8, 10, 12 và 14 NSLB

4.4.2 Ảnh hưởng của các tác nhân xử lý đến hiệu quả giảm bệnh ở

các thời điểm 4, 6, 8, 10, 12 và 14 NSLB

3

2 3

2 3

6 4

5 5

0

DANH SÁCH BẢNG Bảng _ Tựa bảng _ Trang

thu thập ở 3 huyện Châu Thành A, Long Mỹ và Phụng Hiệp

với nấm R solani trên môi trường PDAP ở thời điểm 3 NSTN

với nấm R solani trên môi trường PDAP ở thời điểm 5 NSTN

với nấm R solani trên môi trường PDAP ở thời điểm 7 NSTN

R solani trên môi trường PDAP ở thời điểm 3 NSTN

R solani trên môi trường PDAP ở thời điểm 5 NSTN

R solani trên môi trường PDAP ở thời điểm 7 NSTN

triển vọng trên môi trường chitin agar qua các thời điểm khảo sát

nghiệm trong điều kiện nhà lưới khi quan sát ở vật kính 100X

DANH SÁCH HÌNH

và thuốc đối với nấm R solani trên môi trường PDAP

gieo

trường PDA

R solani là (A) Rhiz-CTA2, (B) Rhiz-LMl va (C) Rhiz-PH2 ơ thời điểm 14 NSCB

thời điểm 7 ngày sau thí nghiệm trên môi trường PDAP

PH5.8et ở 20 ngày sau khi thử fren môi trường chitin agar

nhân kiểm soát bệnh

Chương 1 GIỚI THIỆU

Việt Nam là nước sản xuất lúa gạo đứng thứ hai trên thế giới Trong đó, đồng bằng Sông Cửu Long (ĐBSCL) được xem là vùng thâm canh lúa trọng điểm với diện tích trồng lúa lớn nhất cả nước Để đạt được các sản phẩm có chất lượng cao, người nông dân phải canh tác ít nhất hai hay ba vụ mỗi năm Việc canh tác ữên đã tạo điều kiện cho nhiều loại dịch bệnh bộc phát và gây hại (Võ Thanh Hoàng và Nghuyễn Thị Nghiêm, 1993) Trong đó, bệnh đốm vằn do

nấm Rhizoctonia solani Kuhn gây hại trên lúa được xem là bệnh quan trọng đứng thứ hai sau bệnh đạo ôn ừong việc giảm năng suất và phẩm chất (Park và ctv., 2008) Nấm này phát triển

mạnh ở vùng nhiệt đới như ở Việt Nam, nhất là vùng ĐBSCL, nơi có điều kiện khí hậu nóng

ẩm và điều kiện canh tác thuận lợi cho sự phát triển và gây hại của nấm này là vấn đề cần được quan tâm

Để hạn chế sự bộc phát của bệnh đốm vằn, có rất nhiều biện pháp được áp dụng như chương trinh IPM, 3 giảm 3 tăng Trong đó, biện pháp hóa học cho đến nay vẫn là biện pháp tích cực nhất, đa số nông dân vẫn dùng cách này và thường có thói quen sử dụng quá liều khuyến cáo Điều này làm gia tăng chi phí sản xuất, gây ô nhiễm môi trường và ảnh hưởng đến sức khỏe cộng đồng; ngoài ra, dư lượng thuốc hóa học làm giảm chất lượng gạo, làm sản phẩm của khó có thể đi vào các thị trường lớn của thế giới vốn rất khổ tính (Trần Quốc Tuấn, 2011) Chính vì vậy, nông dân cần có biện pháp phòng trừ dịch bệnh hiệu quả hơn để khắc phục các nhược điểm nêu trên, ứng dụng các biện pháp quản lý bệnh dựa trên cơ sở sinh học là một lựa

chọn hợp lý và trở thành yêu cầu cấp thiết Hiện nay, phòng trừ nấm Rhizoctonia solanỉ bằng

biện pháp sinh học đang được xem là biện pháp thay thế và khắc phục các nhược điểm của biện

pháp trên (Shekhawat và ctv., 1993) Theo Lại Văn Ê (2003), chỉ có con đường phòng trừ sinh

học kết hợp cải thiện về kỹ thuật canh tác là cho hiệu quả cao Ở nước ta phòng trừ sinh học bệnh hại cây trồng là một lĩnh vực còn rất mới, chưa được quan tâm đúng mức, đây là một hướng nghiên cứu có triển vọng và manh tính khả thi cao Phòng trừ sinh học còn là một trong các biện pháp chủ yếu của chương trình IPM Trong số các tác nhân xử lý ữên cây trồng được

biết đến, thì vi khuẩn thuộc chi Bacillus được xem như là tác nhân sinh học an toàn và có tiềm năng cao trong phòng trừ sinh học (Silo-suh và ctv., 1994) Điều này có ý nghĩa rất lớn trong

việc duy trì sự cân bằng sinh học và hệ sinh thái tự nhiên (Alabouvette & Cordier., 2011) Như vậy, phòng trừ bệnh đốm vằn dựa trên các chủng vi khuẩn có lợi là một công cụ tiềm năng có thể thay thế và giúp giảm sự phụ thuộc nhiều vào thuốc

hóa học Từ đố đề tài “Khảo sát khả năng đối kháng của các chủng Bacillus spp đối vói nấm

gây bệnh đốm vằn hại lúa (Rhizoctonia solani Kuhn) và khả năng phòng trị trong điều kiện nhà lưói” được thực hiện nhằm xác định các chủng Bacillus có triển vọng để kiểm soát bệnh

đồng thời khảo sát cơ chế có liên quan đến sự kiểm soát bệnh

Chương 2 LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 2.1 Bệnh đốm vằn hại lúa

2.1.1 Lịch sử và phân bố:

Bệnh đốm vằn được Miyake mô tả vào năm 1910 tại Nhật Bản, nhưng sau đó được biết

là bệnh này đã được Shirai mô tả vào năm 1906 Sau đó, bệnh cũng được mô tả là có sự hiện diện ở Philippines, Srilanka, Trung Quốc và nhiều quốc gia Châu Á khác (Ou, 1985) Bệnh đốm vằn là một bệnh hại quan trọng cho các vùng trồng lúa trên thế giới Theo Nguyễn Thị Nghiêm (1996) ở Việt Nam bệnh được phát hiện vào năm 1974 và đã trở thành bệnh hại quan trọng nhất trên cây lúa đồng thời diện tích nhiễm bệnh tăng đến 10 lần ữong 5 năm (từ 21.000

ha của năm 1985 tăng lên 200.000 ha trong năm 1990 và 1991) ngay tại ĐBSCL (Lê Hữu Hải, 2008)

cm Dưới điều kiện thích hợp như thừa đạm, trời mát, ẩm độ cao, bệnh sẽ từ từ phát triển lên lá

và có thể gây hại cả bông (Carmen và ctv., 1989)

Kích thước và màu sắc của đốm bệnh có thể thay đổi theo điều kiện môi trường, nếu trồi ẩm khuẩn ty sẽ phát triển như tơ trắng lên bề mặt vết bệnh và có thể lan truyền nhiều cm trong một ngày Bệnh thường gây hại khi cây lúa được 45 ngày tuổi và phát triển khá mạnh lúc cây lúa được 60 ngày tuổi (Võ Thanh Hoàng và Nguyễn Thị Nghiêm, 1993) vết bệnh có thể

có màu xanh xám hoặc xám ữắng hoặc có màu sắc khác, có vẻ vằn vện và rìa của vết bệnh có màu nâu Bệnh nhẹ làm cho thân cây bị yếu, lúa dễ đổ ngã khi sắp chín Bệnh nặng, lá bệnh khô chết lụi làm cây cằn cỗi, khó ữổ, nghẹn đòng, khi trổ được thì lép nhiều, có thể làm cây lúa cháy khô thành từng chòm trước khi lúa chín (Phạm Văn Kim và Lê Thị Sen, 1993) Nấm tấn công vào giai đoạn làm đòng khoảng 45 ngày sau khi sạ trở về sau vì ở giai đoạn này điều kiện ẩm độ trong ruộng rất thích hợp cho hạch nấm nẩy mầm và xâm nhiễm (Võ Thanh Hoàng và Nguyễn Thị Nghiêm, 1993)

Theo Ou (1985), bệnh có thể gây thiệt hại năng suất lên đến 25-50% nếu lá cờ của các giống nhiễm bị bệnh hại Tại Nhật Bản, bệnh có thể gây thất thu năng suất đến 20% (Kozaka,1970) Tại Hoa Kỳ đã có trường hợp thiệt hại năng suất đến 50% khi trồng các giống nhiễm nặng (Lee và Rush, 1983)

2.13 Tác nhân gây ra bệnh đốm vằn:

Nấm R solanỉ là tác nhân gây bệnh trên nhiều loại cây trồng Kozaka (1970) đã báo cáo rằng có 188 loài thực vật thuộc 32 họ có thể bị tấn công bởi nấm R solanỉ gây hại trên lúa Tsai (1970) nhận thấy nấm R solani gây hại trên lúa cũng xâm nhiễm trên 20 loài cỏ thuộc 11 họ,

Roy (1973) và Sharma & Mukherjee (1978) quan sát thấy rằng loài nấm này cũng xuất hiện trên một vài loài cỏ trong tự nhiên

Nấm R solanỉ còn gây hại hầu hết các loại cây trồng khác, kể cả cây rừng Các bệnh

héo cây con trên đậu nành, đậu xanh, thuốc lá, bạch đàn con đều do nấm gây ra Nấm còn tấn công và ẩn náu trên tất cả các loài cỏ dại trong ruộng hay ven bờ ruộng (Phạm Văn Kim và Lê Thị Sen, 1993)

2.1.4 Đặc tính của nấm bệnh

2.1.4.1 Đặc điểm sinh học của nấm Rhizoctonm solani

Nấm R solanỉ có rất nhiều loài, thuộc nhóm nấm bất toàn (Derteromycetes) là loài gây

bệnh phổ biến ữên nhiều loại cây trồng, ở giai đoạn sinh sản hữu tính này có tên gọi là

Thanatephorus cucumerỉs (Frank) Donk thuộc nhóm nấm đảm (B asidiomycetes)

Nấm R solani có thể lưu tồn trong đất trong nhiều tháng và là nguồn bệnh quan trọng cho các vụ lúa và hoa màu Hạch nấm R solani gây bệnh đốm vằn ở gốc lúa thường rơi vãi ừên

mặt đất sau khi thu hoạch lúa, chúng cũng có thể sống và phát triển trong xác bã thực vật (Phạm Văn Kim, 2000)

Nhiệt độ có ảnh hưởng đến sự phát triển của nấm thay đổi theo chủng nấm Hemmi và

Yokogi (1927) cho rằng nhiệt độ tốt nhất cho sợi nấm R solanỉ phát triển là 30°c, nhiệt độ cao

nhất là 40-42°C, ở nhiệt độ 10°c sợi nấm phát ừiển rất ít hay không phát triển Matsumoto và

ctv (1932) cho rằng nhiệt độ tốt nhất nằm trong khoảng 28-31°C Kết quả nghiên cứu của

Hashiba và ctv., (1974) cho thấy rằng các chủng thu thập ở vùng nhiệt độ cao thi phát triển tốt

trên môi trường Potato Dexữose Agar (PDA) ở 35°c và phát triển kém ở 12°c

Misawa (1965) đã báo cáo rằng sử dụng nguồn carbon làm ảnh hưởng đến pH của môi

trường Endo (1935) đã xác định pH thích họp cho sự phát triển nấm R solanỉ là 5,4-6,7, có thể

phát triển ở pH thấp nhất là 2,5 và cao nhất là 7,8

2.1.4.2 Sự lưu tồn, lan truyền và xâm nhiễm của nguồn bệnh

Là một loài nấm sống được trong đất và xác bả thực vật nên chúng có thể lưu tồn trong điều kiện tự nhiên khá dài khi không có sự hiện của cây kí chủ Chúng thường lưu tồn ữong tự nhiên dưới hai hình thức chính: một là dạng hạch nấm, khuẩn ty nấm phát triển trong một thời gian dài hay khi gặp điều kiện bất lợi cuộn lại thành một khối cứng gọi là hạch nấm (cương hạch), hạch nấm có kích thước to hay nhỏ tùy theo nhóm và roi xuống đất khi gặp điều kiện thuận lợi chúng lại nẩy mầm và bắt đầu một chu trình sống mới Hình thức thứ hai là dạng khuẩn ty sống trên những vết bệnh của cây đã bị nhiễm còn sót lại sau thu hoạch

Endo (1931) cho rằng loài nấm này có thể sống qua mùa đông nhờ hạch nấm hay sợi nấm Hạch nấm có thể mất khả năng sống sau 21 tháng Park và Bertus (1932) ở Sri-Lanka quan sát khả năng sống sót của hạch nấm ở các điều kiện khác nhau: trong phòng, đất khô ráo

và đất ẩm ướt, nhận thấy: chúng có khả năng sống ít nhất 130 ngày và 224 ngày khi chúng được ngâm sâu 3 inches dưới vòi nước chảy

Nhiều kết quả quan sát khác về khả năng sống sót của hạch nấm cho thấy khả năng sống sót thay đổi tùy theo điều kiện của môi trường như nhiệt độ, ẩm độ, tính chất lý, hóa của đất, nơi hạch nấm lưu trú Kết quả nghiên cứu ở Philippines hạch nấm có khả năng sống chỉ vài tháng hay hạch nấm có khả năng sống 9 tháng ở trong phân ữâu, bò (Ou, 1985)

Tỷ lệ nẩy mầm của hạch nấm thay đổi tùy theo vị trí của hạch nấm cư ngụ trong đất Mori và Anraku (1971) nhận thấy khả năng hạch nấm nảy mầm là 60- 70% khi hạch nấm chôn vùi trong đất không quá 1 em, hạch nấm có tỷ lệ nẩy mầm 30-50%, ở độ sâu 1 cm Ngoài ra,

việc bón phân đạm quá nhiều cũng làm ảnh hưởng đến bệnh khá lớn, theo Yamaguchi và ctv.,

(1971) ước tính có khoảng 57 hạch nấm được hình thành trên một bụi lúa ở ruộng bón nhiều phân và bị bệnh nặng có khoảng 40% hạch nấm được hình thành ở trên cây trôi nổi trên mặt nước sau khi đi sục bùn hay nhổ cỏ ừong mộng Chúng sẽ bị lôi cuốn đi hay ữôi dạt và khi tiếp xúc được với cây lúa chúng sẽ nẩy mầm và bắt đầu sự xâm nhiễm gây bệnh cho lúa Trước khi xâm nhiễm, nấm thành lập hai cơ cấu là khối khuẩn ty cầu và các gối xâm nhiễm Từ hai cấu trúc này hình thành nên vòi xâm nhiễm Nấm xâm nhập vào bên trong lúa chủ yếu bằng các vòi xâm nhiễm này (Ou, 1985)

Phòng bệnh đốm vằn một cách hợp lý nhất là phải tiêu hủy nguồn bệnh sau thu hoạch góp phần làm giảm bớt khả năng bộc phát của dịch bệnh Thu gom xác bạ rơm rạ lúa bệnh đem tiêu hủy, vệ sinh cỏ trong ruộng và quanh bờ, đặc biệt là thành phần lúa chét trong mộng và bờ

bao và chọn thời điểm thích hợp để gieo trồng (Phạm Văn Kim và ctv., 2003) Không gieo sạ

với mật độ dày và phải điều chỉnh lượng phân N, p, K họp lý (Sharma, 2006) nhằm tạo điều kiện thuận lợi cho vi sinh vật đối kháng hoạt động tốt, các biện pháp luân canh, xen canh cũng

có hiệu quả trong việc làm giảm đáng kể dịch bệnh

Nhiều công trì nil nghiên cứu về giống kháng đối với bệnh khô vằn ở nhiều nước trên thế giới cho thấy chưa có giống lúa nào thể hiện tính kháng cao Phản ứng của các giống lúa đều nằm trong phạm vi từ nhiễm nặng tới tương đối chống chịu (Vũ Triệu Mân và Lê Lương

Tề, 1998) Những giống cây thấp, đẻ nhánh nhiều, lá đứng thường nhiễm bệnh nặng hơn nững giống cao cây, đẻ nhánh ít (Ou, 1985)

2.2.2 Biện pháp sinh học

Phòng trừ sinh học là một biện pháp rất hiệu quả tạo sự cân bằng sinh thái giữa tác nhân gây bệnh và vi sinh vật đối kháng đồng thòi thay thế biện pháp hóa học trong phòng trừ bệnh cây khi sử dụng biện pháp hóa học không hiệu quả hay không kinh tế Theo Phạm văn kim (2000) biện pháp sinh học trong phòng trừ bệnh cây là điều kiện môi trường, cây trồng và vi sinh vật đối kháng một cách thích hợp, để tạo nên một thế cân bằng sinh học cần thiết giúp giảm mật số mầm bệnh xuống dưới ngưỡng gây hại, nhờ đó bệnh cây trồng chỉ xuất hiện ở mức

độ nhẹ, không gây ảnh hưởng nghiêm trọng về mặt kinh tế

Sử dụng những vi sinh vật không gây bệnh để kích thích tính kháng bệnh của cây trồng hay cạnh tranh về nơi cư trú về thức ăn với tác nhân gây bệnh Chẳng hạn như nhóm vi khuẩn

Bacillus và Pseudomonas có khả năng làm giảm nguồn bệnh bằng cách tiết ra kháng sinh, các

enzyme phân hủy các tế bào nấm gây bệnh, hay cạnh tranh dinh dưỡng và nới ở của vi sinh vật gây bệnh (Agrios, 2005)

Có thể ứng dụng rất nhiều sinh vật tồn trong tự nhiên như nhóm nấm đối kháng Trichoderma spp., Glỉocladium spp., Pénicillium spp ; nhóm xạ khuấn Streptomyces spp.; và nhổm vi khuẩn đối kháng như Baccỉllus subtilis, Pseudomonas aeruginosa, p fluorescens trong phòng

ừị bệnh do nấm/?, solani gây ra trên nhiều loại cây trồng như cây củ cải, cây bông vải, cây dâu tây, cây họ đậu, cây họ cà, cây lúa (Ghaffer, 1988; Devi VÀ ctv., 1989) Vi khuẩn Burkholderỉa

cepacia có khả năng hạn chế sự phát ữiển khuẩn ty của nấm R solani và ức chế hình thành hạch

nấm do chúng phát triển yếu đi Hiện tượng này có thể là do vi khuẩn tiết ra bacteriocin hay enzyme phân hủy vách tế bào làm chậm phát triển sợi nấm hay làm chết đi sợi nấm (Nguyễn Thị Thu Nga, 2003) Nhóm vi sinh vật đối kháng này có khả năng làm giảm hoạt động, sức sống và mật độ nguồn bệnh bằng tác động tiết kháng sinh hay enzyme phân hủy vách tế bào của tác nhân gây bệnh, hoặc cạnh tranh dinh dưỡng chỗ ở (Ghaffer, 1988)

2.2.3 Biện pháp hóa học

Theo Sharma (2006), có thể phòng trị bệnh đốm vằn bằng các gốc thuốc như Iprodione, Triazole, Mancozeb + Thiobencarb, Iprodione + Carbendazim, và các gốc thuốc vi sinh như Validamycin, Polyxin Tuy nhiên việc xử lý bằng biện pháp hóa học có thể rất tốn kém và lâu dài sẽ có ảnh hưởng bất lợi đến sự cân bằng sinh thái

2.3 Vi sinh vật vùng rễ và nội sinh

2.3.1 Khái niệm:

Vùng rễ (Rhizosphere) là vùng bao quanh bộ rễ của thực vật Khái niệm này được Hiltner đề ra năm 1904, tuy nhiên chúng ta vẫn chưa có phương pháp thống nhất xác định phạm

vi của bộ rễ (Phạm Văn Kim, 2006)

Theo Antoun và Prévost (2005), rhizosphere là thể tích vùng rễ bao quanh và chịu ảnh hưởng của rễ cây, và rhizoplane là diện tích bề mặt rễ cây có ái lực mạnh với các phần tò đất Trong các nghiên cứu về vi sinh vật đất, thuật ngữ rhizosphere bao hàm cả phần rhizoplane Những vi khuẩn sống, định vị có khả năng phát triển chiếm các ổ sinh thái ở rễ vào mọi giai đoạn phát triển của cây được gọi là vi khuẩn vùng rễ (Rhizobacteria) (Antoun và Prévost, 2005) Có khoảng 2-5% vi khuẩn vùng rễ khi được chủng vào đất có hệ vi sinh vật cạnh tranh, biểu hiện có lợi cho sự tăng trưởng của cây được gọi là vi khuẩn vùng rễ kích thích tăng trưởng thực vật (plant growth promoting rhizobacteria-PGPR) (Kloepper và Schroth, 1978)

Theo ghi nhận của Nguyễn Thơ (2004) thì các loài vi sinh vật (VSV) tồn tại trong đất rất đa dạng, chúng gồm có: vi khuẩn, nấm, xạ khuẩn, tuyến trùng, virus Phần lớn vsv trong đất

là những sinh vật có ích sống theo kiểu ngoại sinh, chỉ một số ít là có hại, gây bệnh cho cây trồng sống theo kiểu vừa ký sinh (gây bệnh cho thực vật) vừa hoại sinh., số lượng quần thể vsv

có trong đất chiếm ưu thế hơn rất nhiều lần so với vsv gây bệnh Một số vsv vùng rễ có thể tiết

ra C02 acid hữu cơ, chuyển các khoáng chất khó tan thành dễ tan, giúp cây hấp thụ dinh dưỡng tốt hơn, góp phần bảo vệ cây trồng, làm giảm tác hại của ký sinh gây bệnh Trong đó có một số lượng rất lớn vsv đối kháng ngăn chặn sự phát triển của các vsv gây bệnh cho cây trồng rất hữu hiệu Như vậy, quần thể hoạt động của quần thể vsv có ích và vsv đối kháng trong đất có vai

ừò rất quan trọng ữong đời sống của cây trồng

Theo Vessay (2003) có hai kiểu vi sinh vật có mối liên hệ với cây ký chủ: vsv vùng rễ

và vsv nội sinh rễ

2.3.2 Vi sinh vật quanh rễ cây

Nhiều vùng của rễ non được định cư bởi vi khuẩn, nơi đây có nhiều hốc sinh thái thích

họp mà những vi khuẩn thuộc các loài như Azotobacter, Arthrobacter, Bacillus và

Pseudomonas có thể phát triển Những vi khuẩn này ngăn chặn vi sinh vật có hại Nhiều bài báo

về vi khuẩn vùng rễ cho thấy ảnh hưởng có lợi của vi khuẩn vùng rễ lên sự tăng trưởng của cây

là do chúng có khả năng kiềm chế hay chiếm chỗ của mầm bệnh (Lambert và ctv., 1987)

2.3.3 Vi sinh yật nội sinh rễ

Vi sinh vật vùng rễ là các vi khuẩn sống tự do, nhưng một số loài có thể xâm nhập vào

mô cây sống mà không làm cây biểu hiện triệu chứng bị xâm nhiễm, được gọi là các vi khuẩn nội sinh rễ (endophytic bacteria), để xâm nhập vào rễ trước hết chúng phải là những vi khuẩn vùng rễ (Antoun và Prevost, 2005)

Vi khuẩn nội ký sinh rễ thường là những vi khuẩn được tách ra từ mô cây đã khử trùng

bề mặt hay được tách ra từ phía trong của rễ cây (Kloepper và Ryu, 2006)

2.4 Vai trò của vi khuẩn vùng rễ trong phòng trừ sinh học

Rễ cây hỗ trợ sự tăng trưởng và hoạt động của nhiều loài vi sinh vật sống ở vùng rễ và

có thể có một vài ảnh hưởng đáng kể đến sự tăng trưởng và hoạt động của những vi sinh vật này Trong số đó, có nhiều loài có thể có hại, có lợi, hoặc trung tính đối với cây trồng Các vi khuẩn có lợi, có tác động kích thích sự tăng

trưởng của cây trồng được gọi là vi khuẩn vùng rễ kích thích tăng trưởng thực vật (PGPR) (Somers và Vanderleyden, 2004; Antoun và Prévost, 2005)

Sự hiện diện một cách dồi dào của các sinh vật đối kháng có thể kiềm giữ sự phát ữiển của mầm bệnh và làm cho dịch bệnh không thể xảy ra, nhất là các bệnh trong đất (Phạm Văn Kim, 2000) Việc sử dụng vi khuẩn đối kháng để kiểm soát mầm bệnh là một hình thức phòng trừ sinh học thân thiện với môi trường Vi khuẩn có lợi là một kẻ thù tự nhiên của mầm bệnh vì các sản phẩm thứ cấp có tác dụng đối kháng với mầm bệnh mà nó tạo ra có khả năng lan rộng

ra môi trường xung quanh, trong khi phần lớn các hóa chất sử dụng trong nông nghiệp thì không có khả năng lan rộng ra môi trường xung quanh Hơn nữa, các chất có nguồn gốc sinh học có khả năng phân huỷ nhanh hơn so với các hóa chất được sử dụng trong nông nghiệp Biện pháp phòng trừ sinh học không chỉ được sử dụng để kiểm soát bệnh ở cây đang sống mà còn để kiểm soát các bệnh sau thu hoạch (Lugtenberg B và Kamilova, 2009)

2.4.1 Phân giải

Theo Berg và Hallmann (2006) thì phân giải vách tế bào nấm gây bệnh là một cơ chế tiềm năng mà các vi khuẩn nội ký sinh có thể kiểm soát nấm gây bệnh, là một trong những cơ chế phòng trừ sinh học nấm gây bệnh bằng vi khuẩn vùng rễ Một số vi sinh vật sản xuất các phân giải enzyme, có thể làm phá vở vách tế bào của các sinh vật khác Khả năng sản xuất các lytic enzym do nấm hay vi khuẩn đã được chứng minh là một trong những cơ chế phòng trừ sinh học bệnh cây trồng Các vi sinh vật có khả năng tiết chitinase được xem là những vi sinh vật có khả năng đối kháng với nấm gây bệnh hiệu quả hơn do tác động trực tiếp của chitinase hoặc kết hợp với các hợp chất kháng nấm được sản xuất bởi các vi sinh vật đối kháng

(Macagnan và ctv., 2008)

Nghiên cứu của Krechel và ctv., (2002) trên các vi khuẩn vùng rễ được phân lập từ rễ

khoai tây cho thấy chúng có khả năng tiết các enzyme thủy phân như cellulase, chitinase và glucanase

2.4.1.1 Sự phân giải chitin và vai trò của chitinase

Chitin là hợp chất polymer khó hòa tan có liên kết P-l,4-N- acetylglucosamine (GlcNAc), là thành phần cấu tạo vách tế bào của nhiều loại nấm, bộ xương ngoài của côn trùng

và vỏ bọc của các loài giáp xác Chitinase xúc tác phản ứng phân giải chitin và được tìm thấy nhiều trong sinh vật kể cả vi khuẩn, nấm, và nhiều hơn ở cây trồng và chúng giữ nhiều vai trò khác nhau Nhiều nghiên

cứu cho thấy chitinase được sản xuất bởi vi sinh vật là một tác nhân sinh học để quản lý nhiều bệnh do nấm trên cây trồng (Huang, 2005)

Các dòng vi khuẩn gram dương có đối kháng được tìm thấy chủ yếu thuộc chi Bacillus

và chúng thường được phân lập từ vùng đất hoặc vùng rễ và cả nội ký sinh cây trồng Một số

kết quả nghiên cứu cho thấy Bacillus cereus 65 có khả năng tiết chitinase phân hủy vách tế bào nấm Rhizoctonia solanỉ và kiểm soát bệnh do nấm Verticillium dahliae và Plectosporium

tabacỉnum gây ra (Berg và Hallmann, 2006) Vi khuẩn phát huỳnh quang Pseudomonas sản

xuất chitinases với khối lượng phân tử 43 kDa kháng được nấm Fusarium oxysporumf sp

dỉanthỉ gây bệnh héo mạch dẫn trên cây cẩm chướng (Ajit và ctv., 2006)

Vi khuẩn phát huỳnh quang Pseudomonas sản xuất chitinases với khối lượng phân tò

43 kDa kháng được nấm Fusarium oxysporum f sp dianthi gây bệnh héo mạch dẫn ừên cây cẩm chướng (Ajit và ctv., 2006)

Ngoài ra, chitinase cũng giúp tạo ra các chitin-oligosaccharide, có vai trò là chất gợi trong phản ứng kích kháng (Trần Vũ Phến và Phạm Văn Kim, 2003)

Vách tế bào nấm sẽ bị làm mỏng do P-l,3-glucanse xúc tác phản ứng thủy phân các liên kết P-l,3-glucan và chitinase xúc tác phản ứng thuỷ phân các nối của P-l,4-N-acetyl-D-glucosamine polymer của chitin thành phần chính của vách tế bào nấm (Mohamadi và Karr, 2002) Theo Du và Wang (1992) chitinase tinh chiết từ lúa có khả năng làm thuỷ phân vách tế

bào của khuẩn ty và ức chế sự nẩy mầm của bào tử nấm Pyrỉcularỉa oryzae Sacc

Theo Yoshikawa và ctv (1993) chitinase được tạo ra trong cây khi có sự xâm nhập của

mầm bệnh hay chất hoá học từ bên ngoài, sẽ ức chế sự phát triển của nấm, và phóng thích chất gọi là oligosaccharide được tạo ra qua phản ứng của phytoalexins là tín hiệu liên quan đến kích kháng của cây trồng, vì vậy chitinase có vai trò chính trong tính kích kháng của cây đối với một

số tác nhân gây hại cho cây trồng

2.5 Vi sinh yật vùng thân, lá:

Bề mặt của thực vật trên mặt đất, được biết đến là diện tích lá hay bề mặt của lá (phyllosphere) là môi trường sống có rất nhiều vi khuẩn, nấm sợi, nấm men và tảo tạo thành 1 quần thể trên lá, chúng thường được gọi là các vi sinh vật biểu sinh hoặc là biểu sinh (Hữano và Upper, 1983) Những loài này thường xuyên nằm ở dọc bó mạch, đặc biệt là ở các vùng trũng giữa các vách có nếp lồi ở các tế bào biểu bì

Các vi sinh vật cư trú trên bề mặt cây trồng thích nghi để tồn tại và phát triển trong môi trường sống này Nếu các vi sinh vật đã được tìm thấy có khả năng đối kháng hiệu quả đối với mầm bệnh, thì sau đó chúng sẽ được sử dụng cho mục đích kiểm soát sinh học nhiều hơn so với các sinh vật từ các môi trường khác mà có thể có tính đối kháng như nhau đối với tác nhân gây bệnh

Một số của các thí nghiệm đã sử dụng vi khuẩn làm tác nhân kiểm soát sinh học đã cho kết quả không mong muốn, bởi vì nó đã được chứng minh là không thể để duy trì số lượng tế bào ở mức độ đủ cao để cung cấp cho việc kiểm soát, đặc biệt là trong điều kiện khô khi có ánh

sáng mặt trời (Leben và ctv., 1965; Sleesman và Leben, 1976) Các thí nghiệm của Spurr (1981), có liên quan đến các vi khuẩn được sử dụng là loài Bacillus từ môi trường sống không

phải trên lá Những vi khuẩn này có khả năng hình thành bào tử có thể cho phép quần thể cao hơn để tồn tại ừên lá Việc ứng dụng các vi khuẩn đối kháng trên lá có thể gặt hái thành công lớn hơn về việc kiểm soát các vi khuẩn gây bệnh ở thực vật hơn là nấm (Beer và Rundle, 1980)

Theo Beer và Rundle (1980) cho thấy một số chủng Envinia herbỉcola thu được từ cây

ăn quả đã sản xuất ra bacteriocin - giống như các chất ức chế sự tăng trưởng của E amylovora trong ống nghiệm Một phân lập của vi khuẩn Erwinia và của Pseudomonas có thể ức chế sự phát ừiển của bệnh sọc nâu ữên lúa do vi khuẩn Xanthomonas translucen fsp oryzicola khi các

vi sinh vật đối kháng được áp dụng trên lá 24 giờ trước khi có bệnh xuất hiện (Rao và Pavgi, 1976) Không chỉ vi khuẩn hoại sinh mà còn có các chủng không tương thích của dòng vi khuẩn gây bệnh đã được chứng minh là có tính kiểm soát sinh học

Các chủng không tương thích của X oryzae đã ức chế sự phát triển của vết bệnh ừên lá lúa do những chủng tương thích của cùng 1 dòng vi khuẩn (Watanabe và ctv., 1976) Các vi khuẩn không gây bệnh như loài Pseudomonas, Xanthomonas, và Corynebacterỉum spp có thể

mang lại tác dụng tương tự Những nỗ lực sử dụng vi khuẩn để kiểm soát nấm gây bệnh nhiều hơn so với việc sử dụng vi khuẩn để ức chế bệnh do vi khuẩn gây ra

2.6 Đặc tính chung của vi khuẩn thuộc chi Bacỉllus

về đặc điểm phân loại thuộc ngành: Firmicutes, lớp: Bacilli, bộ: BaciUales, họ:

Bacillaceae, chi: Bacỉllus (Cook và Baker, 1989)

Vi khuẩn thuộc chi Bacỉllus thường có hình que, kích thước 1-1,2x3-5 ịim, gram dương, không có lớp capsul, hiếu khí Vi khuẩn tạo nội bào tử có kích thước 1x1,5um (Cook và Baker,

2000) Khuẩn lạc thường có màu hoặc không màu,

nhăn Theo Phạm Văn Kim (2000), nội bào tử có khả năng lưu tồn rất lâu khi gặp điều kiện bất lợi, ở 100°c nội bào tô của 1 loài Bacillus có thể chịu đựng được từ

2,5 - 1200 phút

Theo Cook và Baker (1989) thì nhiệt độ thích họp cho sự phát triển của Bacillus là

35-45°C, các dòng vi khuẩn này có thể được chọn lọc từ xử lý dịch trích trong đất với nước nóng

80°c trong vòng 10 phút hay xử lý trong đất bằng cách xông hơi nước 60°c trong 30 phút đối với các vi khuẩn hiếu khí

Theo Silo-suh và ctv (1994), Bacillus phân bố rộng rãi trong đất, có khả năng chịu

đựng ở nhiệt độ cao, có thể phát triển nhanh trong môi trường lỏng và hình thành nội bào tử trong điều kiện khắc nghiệt Sự hình thành nội bào tà bắt đầu từ sự phân chia bất đối xứng tế bào thành hai phần không bằng nhau, phần nhỏ hơn được gọi là prespore và phần lớn được gọi

là tế bào mẹ Tiếp đó, tế bào mẹ sử dụng tất cả các nguồn chất dinh dưỡng và thành phần của tế bào mẹ để hình thành lớp vỏ rắn chắc có thể bảo vệ prespore, do đó tối đa hóa cơ hội sống sót cho các nội bào tử trưởng thành Nội bào tử có thể tồn tại dưới tác động của các tác nhân diệt khuẩn như nhiệt độ cao (có thể lên tới 100°C), bức xạ ion hóa, dung môi hóa chất, chất tẩy rửa

và enzyme (Errington, 2003) Nội bào tử có thể tồn tại trong một thời gian dài cho đến khi điều kiện môi trường thuận lợi cho sự tăng trưởng (Phạm Văn Kim, 2000) Nhiều kết quả nghiên

cứu cho thấy vi khuẩn Bacillus spp có khả năng sản xuất một lượng lớn các chất kháng sinh

như gramicidin s, polymyxin, tyrotricidin, bacilysin, chlotetaine, iturin A, mycobacillin, bacilomycin, mycosubtilin, fungistatin và subsporin có thể kiểm soát các bệnh cây trồng (Intana

và ctv., 2008)

2.7 Vai trò của vi khuẩn Bacillus'

Bacillus được đánh giá là có khả năng giúp cây trồng cải thiện sự tăng trưởng thực vật

theo hai cơ chế là gián tiếp và trực tiếp Theo cơ chế gián tiếp, vi khuẩn Bacillus tiết ra chất

kháng sinh chống lại vi khuẩn gây bệnh, làm giảm sắt hữu dụng đến mầm bệnh thực vật (phytopatogen) trong vùng rễ, tổng họp các enzyme phân hủy vách tế bào nấm và cạnh tranh

chỗ ở (vị trí ở rễ cây) với vi sinh vật gây hại Còn với cơ chế trực tiếp, vi khuẩn Bacillus còn

giúp cho sự tăng trưởng, bao gồm tác động giải phóng phosphate hữu dụng sinh học giúp cho cây ữồng hấp thu, cố định nitơ cho cây trồng hấp thu, giúp cây trồng có thể sử dụng Fe hữu hiệu hơn thông qua việc tạo siderophore, là một hợp chất có trọng lượng phân tử thấp (400-1000 daltons) có ái lực cao với Fe3+, hòa tan rất kém ở nhiều loại đất (Glick, 1995; Glick và ctv.,

1999, trích dẫn bởi Nguyễn Thị Thu Hằng, 2008)

2.7.1 Quá trình khoáng hóa chất hữu Cff chứa đạm

Vi khuẩn Bacỉllus sp tham gia vào sự khoáng hóa các protein Ngoài ra còn tham gia vào quá trình khoáng hóa phân urea, trong đó có các loài sau đây được nghiên cứu nhiều: B

pasteurii, B.freudenrichii (Phạm Văn Kim, 2006)

Vi khuẩn Bacỉllus licheniformis còn tham gia vào quá trình khử nitrat trong đất (Phạm

Văn Kim, 2006)

2.7.2 Sự chuyển hóa lân trong đất

Các chất hữu cơ chứa p sẽ được vô cơ hóa do các men, tiết ra từ vi sinh vật trong đất Trong quá trình sống của chúng, vi sinh vật cần phân hủy các chất hữu cơ này, nhờ các men của

vi sinh vật tiết ra, các họp chất hữu cơ chứa p, phóng thích p với dạng phosphate Như ữong sự phân hủy acid phytic, vi sinh vật tiết ra men phytase, nhờ men này acid phytic được phân ra làm một phân tò inositol và 6 phân tử H3PO4 (Phạm Văn Kim, 2006)

2.7.3 Chuyển hóa Kali khố tan thành dạng dễ tan:

Một số vi sinh vật có khả năng phân giải aluminosilicat kali để phóng thích kali chứa

ữong ấy cho cây sử dụng Alcksandrov và ctv., (1950) (trích dẫn bởi Phạm Văn Kim, 2006) làm thí nghiệm với loài vi khuẩn Bacỉllus siliceous, trên cây bắp và lúa mì trồng ữong đất thanh trùng là đất sạch và đất có chủng vi khuẩn, kết quả trên đất có chủng vi khuẩn B sỉlỉceous và

không bón kali, cả bắp và lúa mì đều gia tăng năng suất tương ứng với lô trồng ở đất có thanh trùng và bón thêm kali Để phóng thích kali khỏi họp chất không tan, aluminosilicat, vi khuẩn tiết ra các chất acid hữu cơ như acid carbonic, acid nitric, acid sulfuric và một số acid hữu cơ khác Các acid hữu cơ này tác dụng lên aluminosilicat và phóng thích kali thành dạng dễ tan (Phạm Văn Kim, 2006)

Chúng được xem như là những tác nhân sinh học an toàn và có tiềm năng cao trong phòng trừ sinh học và kích thích tầng trưởng

Baciilus subtỉlỉs (NJ-18) được ứng dụng rộng rãi trên toàn thế giới, là tác nhân sinh học

phòng trị với nhiều loại bệnh trên cây trồng, chúng được ứng dụng ữong phòng thí nghiệm và

nhà lưới có khả năng ức chế sợi nấm R solani và Sclerotinia sclerotỉorum Chủng NJ-18 có khả

năng tiết ra kháng sinh và lên men ở nồng độ 5 X 107 cfu/ml Chủng B subtỉlỉs cũng tiết ra các hợp chất kháng sinh như lipopeptide và bacisubin kháng nấm Nhóm vi khuẩn Bacillus có lợi

thế hơn các nhóm vi khuẩn khác trong việc phòng trừ bệnh ở rễ Chúng có khả năng tạo ra hợp

chất kháng sinh và hình thành nội bào tử (Dongjing Yang và ctv., 2009)

Bacỉllus amyỉoỉique/aciens có hiệu quả đối với việc kiểm soát bệnh thối củ gừng do vi

khuẩn R solanacearum (Trần Văn Nhã, 2011) Vi khuẩn này có khả năng kiểm soát bệnh cháy bìa lá do vi khuẩn Xanthomonas oryzae pv oryzae (Lê Văn Đức, 2012) và bệnh đạo ôn do nấm

Pyrỉcuìarỉa oryzae Cavara (Lý Khe Ma Ra, 2012) trên lúa

ctv., 1999; Cunha và ctv., 2006) PGPR kích thích tăng trưởng thực vật theo hai cơ chế trực tiếp

và gián tiếp

- Theo cơ chế trực tiếp bao gồm tác động giúp giải phóng phosphate hữu dụng cho cây trồng hấp thu, cố định nitơ cho cây trồng sử dụng, tiết ra các phức chất ái lực với sắt (siderophore) để lấy sắt không hữu dụng trong môi trường thành sắt hữu dụng cho vi khuẩn, do đặc điểm này sẽ tạo nên sự phát triển bất lợi cho các vi sinh vật khác (những vi sinh vật không

có khả năng tạo ra phức chất này) đặc biệt là mầm bệnh Ngoài ra, nhiều loài PGPR còn sản xuất các phytohormone như auxin, cytokinin và gibberellins kích thích sự phát ữiển cây ữồng (Bashan và Levanony, 1991) Khả năng kích thích tăng trưởng của PGPR được thể hiện qua sự gia tăng về tỉ lệ nảy mầm, tăng trưởng rễ, sản lượng, diện tích lá, lượng chất diệp lục, magnesium, nitrogen, protein, khả năng hấp thu nước, chịu đựng khô hạn, ữọng lượng của cành

và rễ, và làm chậm quá trình lão hóa của cây (Antoun và Prévost, 2005)

- Cơ chế kích thích tăng trưởng thực vật gián tiếp được thể hiện qua khả năng làm giảm tác động có hại của các mầm bệnh đối với cây trồng PGPR có khả năng làm giảm bệnh như tác nhân phòng trừ sinh học, khi chúng có khả năng kích thích sự cộng sinh có lợi khác Dựa trên các hoạt động của chúng, Somers và ctv (2004) phân loại PGPR thành nhiều nhóm như: phân bón sinh học (làm gia tăng các chất dinh dưỡng sẵn có cho cây trồng), phytostimulators (thúc đẩy tăng trưởng

cây trồng, thường là do sản xuất phytohormones), rhizoremediators (làm giảm các chất ô nhiễm hữu cơ) và biopesticides (kiểm soát dịch hại, chủ yếu do sự tiết chất kháng sinh và các chất chuyển hóa kháng nấm)

Trên cùng một dòng vi khuẩn cũng có thể có sự hiện diện của cùng lúc nhiều cơ chế của tác động kích thích tăng trưởng của cây trồng, thí dụ như kết quả nghiên cứu của Lăng

Ngọc Dậu và ctv (2007) trên Azospỉrìllum sp cho thấy vi khuẩn này có khả năng cố định đạm

ưong không khí thành đạm hữu dụng và phân giải lân khổ tiêu (CaHP04, Ca3HP04, Ca50HP04,

AIPO4, FeP04) ứong đất thành lân dễ tiêu (H3PO4) cung cấp cho cây trồng, ngoài ra chúng còn có khả năng tạo ra kích thích tố tăng trưởng IAA (Indole-3-acetic acid) và Cytokinins giúp cho

phát triển dài của bộ rễ cây trồng Hiện nay Azospỉrìllum sp cùng với Pseudomonas sp đã được

sản xuất dạng thương mại với tên phân vi sinh Dasvila

2.9 Vi sinh vật cố khả năng sản sinh IAA

Có 80% vi khuẩn phân lập từ vùng rễ có khả năng sản sinh indol-acetic- acid (IAA) chúng không chỉ có hiệu ứng sinh lý lên cây ữồng mà còn có thể có vai ừò của phytohormone đáp ứng sự tương tác vi khuẩn - thực vật Một số chất kích thích tố tăng trưởng này có sẵn trong đất nhưng với nồng độ rất thấp, chưa có ảnh hưởng đến cây, tuy nhiên nếu bón phân hữu cơ cho đất, chúng ta làm gia tăng mật số vi sinh vật ữong đất, tức gia tăng nồng độ chất kích thích tố

sinh trưởng, điều này có tác động tốt đối với bộ rễ thực vật (Phạm Việt Cường và ctv., 2003)

IAA do vi khuẩn tạo ra có khả năng kích thích sự phát triển hệ thống rễ, làm gia tăng số lượng

rễ bên và lượng lông hút trên rễ, qua đó tăng cường sự hấp thu chất dinh dưỡng và nước do đó làm tăng hiệu quả tăng trưởng cũng như năng suất của cây trồng (Mantelin và Touraine, 2004) Nồng độ IAA ngoại sinh do vi khuẩn vùng rễ tạo ra có thể có tác dụng kích thích hoặc ức chế

sự phát triển của cây trồng (Persello-Cartieux và ctv., 2003)

2.10 Hiệu quả và triển vọng phòng trừ sinh học của vi khuẩn Bacillus amyĩoliqueýacừns

B amyloliqueýaciens có dạng hình que, kích thước 0,7-0,9 X 1,8-3 /um , các tế bào

thường kết thành chuỗi, các tiêm mao được đính ở đỉnh Nhiệt độ tối ưu cho sự tăng trưởng là 30-400C, ngừng tăng trưởng ở nhiệt độ dưới 15°c hoặc trên 500C (Priest và ctv., 1987, trích

dẫn bởi Trần Thị Thúy Ái, 2011)

Đây là một trong những loài vi khuẩn có hiệu quả phòng trừ sinh học đối với nhiều

bệnh cây trồng có nguồn gốc từ đất (Leclere và ctv., 2005, trích dẫn bởi

Huỳnh Thị cẩm Vân, 2010) hoặc các tác nhân gây bệnh sau thu hoạch (Kotan và ctv., 2009)

B amyloliquefaciens có khả năng kích kháng phổ rộng, kháng lại với mầm bệnh do

virus, vi khuẩn và nấm gây ra Có hiệu quả cao trong kiểm soát bệnh héo xanh do vi khuẩn

Ralstonm solanacearum và héo do nấm Fusarium spp trên cà chua (Park và ctv., 2003)

Hỗn hợp vi khuẩn B amyloliquefaciens và B pumilus cho hiệu cho cao ứong việc kiểm soát bệnh do Sclerotium rolfsii, R solanacearum ứên cà chua và S rolfsii, Colletotrichum trên

tiêu Hàm lượng tổng số Superoxide dismutase (SOD) và peroxidase (PO) cao hơn 25-30% so

với đối chứng trước khi xử lí với tác nhân gây bệnh (Jetiyanon và ctv., 2003) Ba loài vi khuẩn

B subtilis, B amyloliquefaciens và B megaterium đối kháng với Phytophthora palmivora gây

bệnh thói đọt dừa Trong đó B amyloliquefaciens cho hiệu quả cao nhất trong điều kiện invitro

(Jayasuja và Iyer, 2003)

B amyloliquefaciens có liên quan đến cơ chế kích kháng lưu dẫn (induced systemic

resistance-ISR) Chất L-Tyr được tìm thấy sau khi xử lí với B.amyloliquefaciens và đã được

chứng minh có liên quan đến kích hoạt các phản ứng tự vệ của cây trồng chống lại mầm bệnh trong nghiên cứu kích kháng chống bệnh thán thư ừên cây dưa leo Hợp chất 2,3-butanediol

cũng đã được chứng minh là có liên quan đến sự kích kháng lưu dẫn của B amyloliquefaciens (Park và ctv., 2008)

Sự tác động đến cơ chế ISR của vi khuẩn B amyloliquefaciens được kiểm soát bởi gen srfA và pps, cơ chế kích thích tăng trưởng thực vật (plant growth promoting Rhizobacteria- PGPR) được kiểm soát bởi gen alsS và alsD (Hardoim et al., 2008) Kháng sinh Iturin A2 tiết ra

từ vi khuẩn B amyloliquefaciens RC_2 có khả năng ức chế nấm Rosellina necatrix, P oryzae,

và vi khuấn Agrobacterium tumefaciens, Xanthomonas campestris pv campestris, đã cho thấy

B amyloliquefaciens RC_2 có tác dụng phổ rộng đối với bệnh hại cây trồng (Yoshida và ctv.,

2002)

Vi khuẩn Bacillus amyfoliquefaciens hội đủ các điều kiện của tác nhân kích kháng sinh học và là tác nhân có triển vọng để thương mại hóa (Hu và Hi, 2010) Sử dụng vi khuẩn B

amyloliquefaciens cho hiệu quả tương đương với thuốc hóa học là Aliette 800WP trong việc

kiểm soát bệnh thói đọt do Phytophthora cactorum gây ra trên dâu tây (Jayamani, 2006)

B amyloliquefaciens GAI có thể tạo đồng thòi surfactin, iturin A, fengycin A và

fengycin B Đây là những lipopeptides vòng (CLP) gồm bảy (surfactin và iturin A) hoặc 10 amino axit (fengycins) liên kết với một-amino ß (iturins) hoặc ß-hydroxy (surfactins và fengycins) axit béo có thể thay đổi từ C-13 thành C-16 tạo surfactins, từ C-14 thành C-17 tạo

q-iturins và từ C-14 thành C-18 tạo fengycins (Arguelles-Arias và ctv., 2009)

Nghiên cứu của Luz (2003) chứng minh vi khuẩn B amyloliquefaciens cho kết quả cao

vói việc giúp cây lúa mì ở Brazil tăng năng suất từ 459 đến 594 kg/ha và có liên quan đến kích kháng, hạn chế sự gây hại của những vi sinh vật gây bệnh từ 17,3 đến 22,4 %

Ngoài việc kiểm soát bệnh do Phytophthora và Fusarium gây ra,vi khuẩn vùng rễ B

amyloliquefaciens giúp lá ớt tăng 22,8% chiều dài lá so với đối chứng và có thể sống đến 50

ngày sau khi chủng Vi khuẩn B amyloliquefaciens hội đủ những điều kiện của tác nhân kích kháng sinh học và là tác nhân có triển vọng có thể thương mại hóa (Hu và ctv., 2010)

2.11 Thuốc trừ bệnh Carbenda Supper 50 sc

Tên hoạt chất: Carbendazim, hàm lượng 500 g/lít

Tên hóa học: (2 - (Methoxyl - carbamoyl) - 2 - benzimidazol) methyl

benzimidazole carbamate

Công thức cấu tạo: carbendazim

Nhóm hóa học: carbamate

Đặc tính: Thuốc tác dụng nội hấp, lưu dẫn mạnh Hấp thu qua rễ và phần xanh của cây

và vận chuyển trong mạch gỗ, có tính hướng ngọn Nhóm độc IV ít độc với ong và cá Phổ tác dụng rộng, phòng trị các nhóm nấm thuộc lớp nấm: Nang (Ascomycetes), Bất toàn (fungi imperfecti hay Deuteromycetes) và Đảm (Basidiomycetes), trừ nhóm nấm Noãn (Oomycetes) không có hiệu quả Thời gian cách ly 7 ngày

Công dụng: Phòng trị hiệu quả các loại bệnh như: Lem lép hạt, vàng lá, khô vằn, đốm nâu hại lúa; Thán thư hại xoài; Đốm lá đậu phộng; Thối cổ rễ dưa hấu; thối củ hành

Khuyến cáo sử dụng: đối với bệnh khô vằn trên lúa cần sử dụng với liều lượng 0,6 lít/ha, phun

400-500 lít nước/ha khi tỉ lệ bệnh >5% (Chau Mô Nô Rôm,

2013)

CHƯƠNG 3 PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP 3.1 PHƯƠNG TIỆN

3.1.1 Thời gian thực hiện đề tài: đề tài được thực hiện từ tháng 10/2012 đến tháng 10/2013 3.1.2 Địa điểm: Thí nghiệm được thực hiện tại phòng thí nghiệm và khu nhà lưới của bộ môn

Bảo Vệ Thực Vật, khoa Nông Nghiệp và Sinh học ứng dụng, trường Đại Học Cần Thơ

3.1.3 Vật liệu thí nghiệm

- Giống lúa: giống lúa OMCS 2000 sản phẩm cấp xác nhận, được cung cấp bởi Viện Lúa Đồng bằng sông Cửu Long

- Bacillus amyloliquefaciens (đối chứng dương) và 17 chủng vi khuẩn đối kháng: được

cung cấp bởi phòng tín nghiệm phòng trừ sinh học, Bộ môn BVTV, KNN & SHƯD, trường Đại Học cần Thơ

- Dụng cụ: đĩa petri, ống nghiệm, cân điện tò, phân bón, ống eppendoft l,5ml, cối, chày nghiền mẫu, chậu thí nghiệm, bình tam giác, que chà, đũa cấy, đèn cồn, kéo

- Thiết bị: Autoclave, tủ thanh trùng khô, tủ cấy, máy đo pH (Janway pH Meter 3150 Anh), máy lắc ngang, tủ định ôn (Menmert B700, Đức)

- Hóa chất: dung dịch PBS (Phosphate - Buffered Saline), Tween 20, Chlorine (Ca(OCl)2)

- Các môi trường sử dụng trong thí nghiệm:

+ Môi trường King’s B đặc (Atlas, 2004) Peptone

K2HP04

MgS04

Agar

20 g 1.5 g 1.5 g

1000ml

7 + Môi trường King’s B lỏng (Atlas, 2004) Peptone

K2HPO4

20 g 1.5 g

+ Môi trường PDA (Atlas, 2004)

3.2.1 Thu mẫu và phân lập nguồn bệnh

- Địa điềm: 3 huyện Châu Thành, Long Mỹ và Phụng Hiệp thuộc tỉnh Hậu

+ Chọn mộng có diện tích >1000 m2, mỗi ruộng thu một mẫu có triệu chứng điển hình cho vào bọc nilon có giữ ẩm, ghi nhận địa điểm, giống lúa, tuổi lúa, ngày thu

+ Phân lập nguồn bệnh: Mầu thân lúa bệnh đốm vằn được cắt thành từng đoạn

thời gian 1 phút, rửa lại bằng nước cất vô trùng 3 lần, ủ ữên giấy thấm ẩm vô trùng trong đĩa petri, để trong tủ định ôn 30°c Theo dõi mẫu bệnh nếu thấy sợi nấm hoặc hạch nấm xuất hiện ữên vết bệnh tiến hành phân lập nấm trên môi trường PDA

+ Cách đặt tên cho các dòng nấm gây bệnh: dựa vào địa điểm thu mẫu và giống lúa

Nấm sau khi xác định được tồn trữ ở 4°c trong đĩa petri có chứa môi

trường PDA

Bảng 3.1 Sự hiện diện của các dòng nấm R solanỉ trên các giống lúa được thu thập ở 3

huyện Châu Thành A, Long Mỹ và Phụng Hiệp

code

3.2.2 Thí nghiệm 1: Đánh giá khả năng gây bệnh đốm vằn trên lúa do nấm Rhizoctonm

solani của các mẫu bệnh thu thập được (thực hiện quy trình Kock)

* Mục tiêu:

Tuyển chọn các dòng nấm Rhizoctonm solani có khả năng gây bệnh cao nhất để sử

dụng làm tác nhân gây bệnh trong các thí nghiệm sau

* Tiến hành:

- Chuẩn bị giống và chăm sóc:

+ Giống lúa OMCS 2000 được sử dụng làm thí nghiệm được xử lý nước muối 15% từ 5-10 phút để loại bỏ hạt lép lửng, ngâm trong nước ấm (3 sôi 2 lạnh) trong vòng 15 phút rồi được hong khô lại Sau đó ngâm trong nước cất 24 giờ rồi đem ủ 48 giờ trong tủ úm ở nhiệt độ 30°c Hạt nẩy mầm được gieo trong chậu nhựa có đường kính 25 cm (diện tích mặt đấơchậu s= 0,049 m2) 10 hạưchậu

+ Chăm sóc: Lượng phân bón được áp dụng theo khuyến cáo của Sở KH & CN tỉnh Hậu Giang với tỷ lệ 100N - 60P205 - 45K20 Phân được hoà vào nước tưới đều cho tất cả các chậu, quy trình bón phân như sau:

- Bón lót: toàn bộ lượng phân Lân và Vĩ lượng kali (2 ngày trước khi gieo)

- Bón thúc đợt 1 (7 ngày sau sạ): bón l Á lượng đạm

- Bón thúc đợt 2 (20 ngày sau sạ): bón V 2 lượng đạm

- Bón thúc đợt 3 (45 ngày sau sạ): bón Vi lượng đạm và ¥1 lượng kali còn

+ Lây bệnh nhân tạo: Thực hiện chủng bệnh vào thời điểm cây lúa 40 ngày sau khi gieo bằng cách rải đều môi trường trấu gạo có chứa nấm được nhân nuôi vào gốc lúa (0,25 lít môi trường/chậu X 4 chậu) Sau đó, đem vào phòng ủ bệnh (ẩm độ khoảng 98% và nhiệt độ khoảng 25°C) để trong vòng 24 giờ Tiếp theo đem ra nhà lưới có che mát (80% ánh sáng tự nhiên), tưới nước mỗi ngày để tạo ẩm độ (mực nước ữong chậu luôn ở mức khoảng 2 cm)

+ Chỉ tiêu theo dõi:

- Đánh giá thời gian bắt đầu xuất hiện bệnh

- Đếm số cây bị nhiễm bệnh, tính chỉ số bệnh kể từ lúc 7, 9 và 14 sau khi xuất hiện bệnh đầu tiên cụ thể được trình bày ở bảng 3.2 như sau:

Bảng 3.2 Bảng đánh giá cấp bệnh (IRRI, 2002)

3.2.3 Thí nghiệm 2: Đánh giá khả năng đối kháng của các chủng vi khuẩn có lợi đối vói nấm

Rhizoctonia soỉani trong điều kiện in vitro

* Mục tiêu: Tuyển chọn một số dòng vi khuẩn có lợi có khả năng đối kháng tốt với

nấm Rhizoctonia solani

Bảng 3.3 Các chủng vi khuẩn được sử dụng trong in vitro

* Tiến hành:

- Thí nghiệm được tiến hành trong đĩa petri (chứa môi trường PDAP), 4 lần lặp lại, bố

trí hoàn toàn ngẫu nhiên với 2 nhân tố (nhân tố A: các chủng vi khuẩn Bacillus có triển vọng +

vi khuẩn Bacillus amyloliquefaciens được cung cấp từ phòng thí nghiệm bộ môn Bảo vệ thực

vật và thuốc Carbenda Supper 50SC có biểu hiện đối kháng tốt theo kết quả thí nghiệm của

Chau Mô Nô Rôm (2013) trong đó vi khuẩn Bacillus amyloliquefaciens và thuốc Carbenda Supper 50SC được sử dụng làm đối chứng dương, nhân tố B: 3 dòng nấm Rhizoctonia solanỉ

được chọn từ kết quả thí nghiệm 1)

- Vi khuẩn được nhân mật số trong bình tam giác 500 ml có chứa môi trường King’s B lỏng trên máy lắc ngang (150 vòng/phút) trong khoảng thời gian 48 giờ và điều chỉnh về mật số

108 cfu/ml bằng nước cất vô trùng

- Khoanh khuẩn ty nấm Rhizoctonia solanỉ được lấy từ rìa khuẩn lạc được nuôi 6-7

ngày trên môi trường PDA

- Khoanh khuẩn ty nấm Rhizoctonia soỉani (0 = 5mm) được cấy ở tâm, 4 khoanh giấy

thấm có VKĐK, thuốc và nước cất vô trùng (0 = 5mm) được cấy làm 4 điểm xung quanh cách

Nấm R S(

o o o - ►

Khoanh giấy thấm thuốc, VKĐK

Đối chú

âm

Hình 3.1: Phương pháp trắc nghiệm khả năng đối kháng của vi khuẩn đối kháng và thuốc đối

với nấm R solanỉ tiên môi trường PDAP

* Các chỉ tiêu theo dõi:

- Đo bán kúih vành khăn vô khuẩn do nấm gây bệnh bị ức chế

- Đo bán kính (nun) khuẩn lạc của nấm phát triển hướng về phía nghiệm thức có vi khuẩn thử đối kháng hoặc thuốc và về phía đối chứng âm (nước cất) để tính hiệu suất đối kháng Ngưng ghi nhận chỉ tiêu khi khuẩn ty hướng về đối chứng khuẩn ty phát triển tiếp xúc thành đĩa

- Hiệu suất đối kháng được tính theo công thức:

Ghi chú:

HSƯC: Hiệu suất ức chế

BKKLđc: Bán kmh khuẩn lạc về phía đối chúng

BKKLvk/thuốc: Bán lánh khuẩn lạc về phúi VKĐK hoặc thuốc

- Bán kính vùng vô khuẩn được đánh giá theo thang đáng giá của Jackson

- Hiệu suất đối kháng được đánh giá theo thang đánh giá của Soytong (1988) trích bởi Noveriza và Quimio (2004)

3.2.4 Thí nghiệm 3: Khảo sát khả năng phân giải chỉtin của các dòng vi khuẩn đối kháng cố

triển vọng trong điều kiện in vitro

* Mục tiêu: Khảo sát khả phân giải chitin của các dòng vi khuẩn có lợi để tìm hiểu xem việc tiết chitinase có lien quan đến cơ chế ức chế nấm bệnh hay không

* Bố trí thí nghiệm: thí nghiệm bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên, 4 lặp lại, mỗi nghiệm thức

là một dòng vi khuẩn có hiệu quả tốt từ thí nghiệm 2

* Cách thực hiện: thí nghiệm được thực hiện dựa trên môi trường chitin agar theo phương pháp của Hsu và Lockwood (1975) Vi khuẩn khảo sát khả năng phân giải chitin được nhân nuôi trên môi trường King’s B lỏng ở 48 giờ được cấy thành 5 điểm, mỗi điểm là khoanh giấy thấm 0 = 5 mm tẩm huyền phù vi khuẩn (huyền phù được chuẩn về mật số 108 cfu/ml) trên đĩa petri có môi trường chitin agar (4% colloidal chitin)

* Chỉ tiêu theo dõi: đo bán kính vòng phân giải và thời gian chitin bị phân giải biểu hiện qua bán kính vòng trong suốt mà nó tạo ra trên môi trường chitin agar‘ _

3.2.5 Thí nghiệm 4: Đánh giá khả năng kiểm soát bệnh đốm vằn do nấm Rhizoctonia soỉanỉ của các chủng Bacillus trong điều kiện in vivo

* Mục tiêu: Khảo sát khả năng kiểm soát bệnh đốm vằn do nấm Rhizoctonia solani của các chủng Bacillus trong điều kiện ỉn vivo

* Chuẩn bị:

- Vi khuẩn được nhân mật số trong bình tam giác 500 ml có chứa môi trường King’s B lỏng trên máy lắc ngang (150 vòng/phút) trong khoảng thời gian 36 - 48 giờ và điều chỉnh về mật số 108cfu/mlbằng nước cất vô trùng

- Chuẩn bị giống và chăm sóc: giống như ở thí nghiệm 1

* Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên 2 nhân tố với 4 lần lặp lại

+ Nhân tố A (6 mức độ): tác nhân kiểm soát bệnh

- 3 chủng vi khuẩn Bacillus có biểu hiện đối kháng tốt được chọn từ thí nghiệm

trước

- 1 loại thuốc hóa học (Carbenda Supper 50SC) có biểu hiện đối kháng mạnh

trong điều kiện in vitro

- 1 chủng vi khuẩn Bacìllus amyloliqueỷaciens được cung cấp từ phòng thí

nghiệm bộ môn Bảo vệ thực vật

-1 đối chứng âm không xử lý + Nhân tố B (3 mức độ): thời điểm xử

lý tác nhân kiểm soát bệnh

- Áo hạt với 4 chủng vi khuẩn 12 giờ trước khi gieo

- Xử lý ở thời điểm 38 NSKG (2 NTKLB)

- Xử lý ở thời điểm 42 NSKG (2 NSKLB) Thuốc Carbenda Supper 50SC được xử lý bằng cách phun với liều lượng khuyến cáo của nhà sản xuất nhưng chỉ áp dụng cho biện pháp phun sau khi chủng bệnh Riêng đối với biện pháp phun trước và áo hạt có nghiệm thức riêng thay thế để theo dõi bệnh

+ Chuẩn bị nguồn nấm và lây bệnh nhân tạo tương tự như ở thí nghiệm 1

Hình 3.2: Phương pháp rải trấu gạo bào gốc lúa ở giai đoạn 40 ngày sau khi gieo

+ Chỉ tiêu theo dõi và chỉ số bệnh (% CSB): tương tự như ở thí nghiệm 1 + Hiệu quả giảm bệnh so với đối chứng:

HQGB (%) = - — - x l 0°

CSB đối chứng