Xây dựng quy trình định lượng silybin trong dược liệu hạt Cúc gai và chế phẩm từ Cúc gai (Silybum marianum (L.) Gaertn) bằng phương pháp HPLC

Xây dựng quy trình định lượng silybin trong dược liệu hạt Cúc gai Silybum marianum (L.) Gaertn. và chế phẩm từ hạt cúc gai bằng phương pháp HPLC.

XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG SILYBIN TRONG

DƯỢC LIỆU HẠT CÚC GAI VÀ CHẾ PHẨM TỪ CÚC GAI

(SILYBUM MARIANUM (L.) GAERTN) BẰNG PHƯƠNG PHÁP HPLC

Ngô Thị Thanh Diệp * , La Hoàng Anh * , Hà Quốc Huấn * , Tạ Công Minh Huy *

TÓM TẮT

Mở đầu: Cây Cúc gai, tên khoa học Silybum marianum (L.) Gaertn., trong thành phần hóa học chứa

các flavonolignan với hoạt chất chính là silybin đã được chứng minh có tác dụng tốt trong điều trị bệnh gan

in vitro và in vivo Các loại thuốc và thực phẩm chức năng từ Cúc gai đã xuất hiện khá nhiều trên thị trường trong nước và thế giới Việc tiêu chuẩn hóa dược liệu Cúc gai tạo nguồn nguyên liệu cho sản xuất các chế phẩm thuốc điều trị bệnh gan thận, đồng thời kiểm tra chất lượng các chế phẩm có nguồn gốc từ Cúc gai đang lưu hành trên thị trường là một vấn đề đang được quan tâm hiện nay

Mục tiêu: Xây dựng quy trình định lượng silybin trong dược liệu hạt Cúc gai Silybum marianum (L.)

Gaertn và chế phẩm từ hạt cúc gai bằng phương pháp HPLC

Đối tượng - Phương pháp nghiên cứu: Đối tượng nghiên cứu là silybin có trong dược liệu và chế

phẩm từ Cúc gai Tiến hành khảo sát các thông số cho quy trình định lượng Từ đó, xây dựng và thẩm định quy trình định lượng Silybin trong hạt Cúc gai và các chế phẩm từ hạt Cúc gai trên thị trường được mã hóa FY, ZE bằng phương pháp HPLC và áp dụng quy trình này để xác định hàm lượng silybin trong hạt Cúc gai và các chế phẩm FY, ZE

Kết quả: Xây dựng và thẩm định quy trình định lượng Silybin trong hạt Cúc gai và một số chế phẩm

từ hạt Cúc gai bằng phương pháp HPLC với các thông số: Cột sắc ký Knauer C18 (5 µm, 250 mm × 4,6 mm), bước sóng phát hiện 288 nm, tốc độ dòng 1 ml/phút, nhiệt độ cột: 40 o C, thể tích tiêm mẫu: 10 µl, pha động: dung môi A: nước – methanol – acid phosphoric (80 : 20 : 0,5), dung môi B: nước – methanol – acid phosphoric (20 : 80 : 0,5) theo chương trình rửa giải gradient Kết quả thẩm định cho thấy quy trình có tính đặc hiệu, khoảng tuyến tính rộng, độ chính xác với RSD < 5%, tỷ lệ phục hồi của Silybin nằm trong khoảng 90-110% Áp dụng quy trình đã xây dựng để xác định hàm lượng Silybin trong hạt Cúc gai và một số chế phẩm từ hạt Cúc gai trên thị trường Kết quả cho thấy hàm lượng silybin trong hạt Cúc gai là khoảng 1,79

mg/g tính theo dược liệu khô kiệt; trong chế phẩm FY – 49,17 mg/viên; trong chế phẩm ZE – 40,82 mg/viên Kết luận: Đã xây dựng và thẩm định được quy trình định lượng Silybin trong dược liệu hạt Cúc gai

và chế phẩm từ hạt Cúc gai Quy trình có thể sử dụng để đánh giá chất lượng của dược liệu và chế phẩm từ

hạt Cúc gai trên thị trường hiện nay

Từ khóa: Cúc gai, milk thistle seed, silybin, HPLC

ABSTRACT

QUANTITATIVE DETERMINATION OF SILYBIN IN MILK THISTLE SEEDS (SILYBUM

MARIANUM (L.) GAERTN.) AND THEIR PRODUCTS BY HPLC METHOD

Ngo Thi Thanh Diep, La Hoang Anh, Ha Quoc Huan, Ta Cong Minh Huy

* Ho Chi Minh City Journal of Medicine * Supplement of Vol 23 - No 2- 2019: 512 – 518

* Khoa Dược, Đại học Y Dược Thành phố Hồ Chí Minh

Tác giả liên lạc: PGS.TS Ngô Thị Thanh Diệp ĐT: 0776671588 Email: thanhdiep73@yahoo.com

Introduction: Milk thistle, scientific name is Silybum marianum (L.) Gaertn, in chemical

compositions containing flavonolignans with major active ingredient silybin has been shown to be effective

in treating liver disease in vitro and in vivo Drugs and dietary supplements from milk thistle have appeared quite in the domestic market and in the world Therefore, the standardization of this medicinal herbs – seeds Milk thistle and controlling the quality of their products is necessary

Objectives: This study aims to quantitative determination of Silybin in seeds Silybum marianum (L.)

Gaertn and their products by HPLC method

Materials and methods: The study subject was Silybin in seeds Silybum marianum (L.) Gaertn and

corresponding products Parameters for the quantitative procedure were determined After that, the quantitative determination of Silybin in seeds Silybum marianum (L.) Gaertn and their products on the market by HPLC method was developed and validated The procedure was applied to determine Silybin in seeds Silybum marianum (L.) Gaertn and FY, ZE products

Results: The quantitative determination of Silybin in seeds Silybum marianum (L.) Gaertn and their

products by HPLC method was developed and validated with parameters: column Knauer C18 (5 µm, 250 mm × 4.6 mm); warelenght detection of 288 nm, column temperature of 40 o C, injection volume of 10 µL, water – methanol – acid phosphoric (80 : 20 : 0.5) was used as mobile phase A and water – methanol – acid phosphoric (20 : 80 : 0.5) was used as mobile phase B at a gradient, flow rate 1 mL/min The results illustrated that the procedure had selectivity, wide linearity, intra-day relative standard deviation was below 5%; accuracy with the recovery range was 90-110% for Silybin The validated method was applied to determine Silybin in Silybum marianum (L.) Gaertn seeds and their products on the market The results also showed that Silybin in Silybum marianum (L.) Gaertn seeds were about 1.79 mg/g of the dried material and in FY, ZE products were 49.17 mg and 40.82 mg /unit, respectively

Conclusion: The method for quantitative determination of Silybin in seeds Silybum marianum (L.)

Gaertn and their products was developed and evaluated effectively, was suitable for testing the quality of seeds Silybum marianum (L.) Gaertn and their products

Key words: Silybum marianum (L.) Gaertn, Milk Thistle seeds, Silybin, HPLC

ĐẶT VẤN ĐỀ:

Cây Cúc gai (còn gọi là kế sữa, kế thánh,

kế đức mẹ ), tên khoa học Silybum marianum

(L.) Gaertn là một loài thuộc họ Cúc

(Asteraceae) Cúc gai đã được sử dụng làm

thuốc bảo vệ gan mật từ lâu Nhiều loại thuốc

và thực phẩm chức năng từ Cúc gai được sử

dụng rộng rãi tại Hoa Kỳ và châu Âu cũng

như nhiều nơi trên thế giới để chữa cải thiện

chức năng của gan Hơn thế, nghiên cứu gần

đây trên thế giới đã cho thấy nhiều tác dụng

dược lý khác như kháng HIV, chống oxy hóa,

chống ung thư…

Thành phần hóa học của Cúc gai chứa flavonolignan đã được chứng minh có tác

dụng tốt trong điều trị bệnh gan trên in vitro

và in vivo Flavonolignan chính trong Cúc gai

là silymarin (1-4% thành phần quả khô) Silymarin là một hỗn hợp ít nhất 3 flavonolignan polyphenol gồm silybin, silydianin và silychristin, trong đó thành phần chính là silybin (khoảng 40%)(1)

Cúc gai và các chế phẩm từ Cúc gai hiện

đã được sử dụng rộng rãi như một phương thuốc dân gian điều trị các bệnh hiểm nghèo

về gan, thận hiện đang phổ biến ở nước ta(5)

Việc tiêu chuẩn hóa dược liệu Cúc gai tạo

nguồn nguyên liệu cho sản xuất các chế phẩm

thuốc điều trị bệnh gan thận, đồng thời kiểm

tra chất lượng các chế phẩm có nguồn gốc từ

Cúc gai đang lưu hành trên thị trường, góp

phần nâng cao sức khỏe người dân là một vấn

đề đang được quan tâm và rất cấp thiết hiện

nay Xuất phát từ tình hình này, đề tài được

thực hiện với các mục tiêu sau:

Xây dựng quy trình định lượng silybin

trong dược liệu hạt Cúc gai Silybum marianum

(L.) Gaertn và chế phẩm từ hạt Cúc gai bằng

phương pháp HPLC

Thẩm định quy trình đã xây dựng và áp

dụng để xác định hàm lượng silybin trong

dược liệu (hạt Cúc gai) và một số chế phẩm từ

hạt Cúc gai trên thị trường

ĐỐI TƯỢNG - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Đối tượng nghiên cứu

Silybin có trong dược liệu và chế phẩm từ

Cúc gai

Nguyên vật liệu, chất chuẩn, hóa chất, dung

môi, trang thiết bị

Nguyên liệu

Hạt của cây Cúc gai Silybum marianum (L.)

Gaertn được thu mua năm 2017 của hãng

Starwest Botanicals (nguồn gốc: Croatia) Hạt

được sấy khô, xay thành bột thô Mất khối

lượng do làm khô của mẫu dược liệu được xác

định là 6,87%

Các chế phẩm là thực phẩm chức năng

chứa silymarin có nguồn gốc từ Cúc gai được

thu mua trên thị trường:

Viên nén bao phim FY (số lô 011), mỗi viên

chứa: Silymarin 200 mg

Viên nang cứng ZE (số lô 030416), mỗi

viên chứa: Silymarin 70 mg

Chất đối chiếu:

Silybin do Viện Kiểm nghiệm Thuốc TP

Hồ Chí Minh cung cấp, số lô: QT198 060717, hàm lượng 90,2%

Hóa chất, dung môi

Petroleum ether, n-hexan, toluen, aceton,

ethyl acetat, cloroform, acid formic, methanol, dùng loại AR do Trung Quốc sản xuất, một số hóa chất và thuốc thử thông thường khác trong phòng thí nghiệm

Các dung môi (methanol, acetonitril, acid phosphoric) loại tinh khiết dùng cho HPLC (Merck), nước cất hai lần dùng trong quy trình định lượng

Trang thiết bị

Hệ thống HPLC Waters Alliance e2695, đầu dò PDA Waters 2998, cột sắc ký Knauer C18 (5 µm, 250 mm × 4,6 mm), bộ chiết Soxhlet,

bể siêu âm Elma, tủ sấy điện WM500CO, bếp cách thủy (Memmert), cân phân tích 5 số CP 225D (Sartorius) và dụng cụ thủy tinh thông thường khác trong phòng thí nghiệm

Phương pháp nghiên cứu

Dựa vào DĐVN V(2), USP 41(4), áp dụng

kỹ thuật sắc ký pha đảo với hệ dung môi phân cực Trong quá trình thực nghiệm, các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu quả tách của phương pháp được khảo sát bao gồm hệ pha động, cột sắc ký và số lần chiết Sau khi tìm được điều kiện sắc ký thích hợp sẽ tiến hành thẩm định quy trình phân tích theo ICH(3) và ứng dụng quy trình đã thẩm định vào việc định lượng silybin trong mẫu dược liệu hạt Cúc gai và chế phẩm

KẾT QUẢ

Dựa vào kết quả khảo sát các điều kiện thực nghiệm như số lần chiết, chương trình gradient, hệ pha động, cột sắc ký, chúng tôi đã lựa chọn điều kiện chuẩn bị mẫu và điều kiện sắc ký cho quy trình định lượng như sau:

Chuẩn bị mẫu

Mẫu thử (hạt Cúc gai)

Cân chính xác khoảng 5 g bột dược liệu

vào túi giấy lọc rồi đặt vào bình chiết Soxhlet

250 ml có chứa 160 ml n-hexan (TT) Đun hồi

lưu trên cách thủy trong 5 giờ, để nguội, loại bỏ

lớp n-hexan, để bay hơi hoàn toàn dung môi ra

khỏi dược liệu Chuyển dược liệu và túi giấy

lọc đựng dược liệu sang bình nón nút mài 100

ml, có chứa 70 ml ethyl acetat (EA) Đun hồi

lưu trên cách thủy 1 giờ, thu lấy dịch chiết (làm

3 lần) Gộp dịch chiết 3 lần cho vào cốc 250 ml

Cô cách thủy đến cạn Dùng methanol (TT) để

hòa tan và chuyển toàn bộ cắn vào bình định

mức 100 ml, thêm methanol (TT) đến vạch, lắc

đều, lọc qua màng lọc 0,45 µm

Mẫu thử (chế phẩm)

Bỏ lớp bao phim, cân và nghiền thành

bột 20 viên, tính khối lượng trung bình viên

Cân chính xác một lượng bột thuốc tương

ứng với 100 mg silymarin vào bình định

mức 100 ml, thêm 60 ml methanol, hòa tan

bằng cách siêu âm trong khoảng 20 phút, bổ

sung methanol (TT) đến vạch, lắc đều Hút

chính xác 10 ml cho vào bình định mức 25

ml, thêm methanol (TT) đến vạch, lắc đều,

lọc qua màng lọc 0,45 µm

Mẫu chuẩn

Cân chính xác khoảng 28 mg chất đối

chiếu silybin (hàm lượng 90,2%) vào bình định

mức 10 ml, thêm MeOH đến vạch để thu được

dung dịch chuẩn gốc có nồng độ silybin là

2500 µg/ml Từ dung dịch chuẩn gốc pha các

dung dịch chuẩn có nồng độ lần lượt khoảng

10 µg/ml; 50 µg/ml; 100 µg/ml; 250 µg/ml; 500

µg/ml, lọc qua màng lọc 0,45 µm, để khảo sát

khoảng tuyến tính khi thẩm định quy trình

định lượng

Công thức tính kết quả:

Hàm lượng Silybin có trong dược liệu được tính theo công thức sau:

t c c

X (mg/g) = x C x x

Trong đó:

X: hàm lượng silybin có trong dược liệu khô kiệt (mg/g)

S t : Tổng diện tích 2 pic silybin A và B của mẫu thử (µV.s)

S c : Tổng diện tích 2 pic silybin A và B của mẫu chuẩn (µV.s)

C c : nồng độ silybin của mẫu chuẩn (µg/ml) m: khối lượng bột dược liệu cân được (g) h: hàm ẩm dược liệu (%)

Hàm lượng Silybin có trong chế phẩm được tính theo công thức:

Trong đó:

X: hàm lượng silybin có trong 1 viên chế phẩm (mg/viên)

S t : Tổng diện tích 2 pic silybin A và B của mẫu thử (µV.s)

S c : Tổng diện tích 2 pic silybin A và B của mẫu chuẩn (µV.s)

C c : nồng độ silybin của mẫu chuẩn (µg/ml)

m tb : khối lượng bột thuốc trong một đơn vị chế phẩm (g) a: khối lượng bột thuốc cân được (g)

Khảo sát điều kiện sắc ký

Điều kiện sắc ký thích hợp được lựa chọn: Cột sắc ký Knauer C18 (5 µm, 250 mm

× 4,6 mm), thể tích tiêm mẫu: 10 µL, nhiệt

độ cột: 40 oC Hệ pha động: Dung môi A: nước – methanol – acid phosphoric (80 : 20 : 0,5); Dung môi B: nước – methanol – acid phosphoric (20 : 80 : 0,5)

Chương trình Gradient:

Thời gian (phút)

Tốc độ dòng (ml/phút)

Dung môi A (%)

Dung môi B (%)

Thẩm định quy trình định lượng

Khảo sát tính tương thích hệ thống

Bảng 1: Kết quả khảo sát tính tương thích hệ thống

Chuẩn

Hạt Cúc gai

Chế phẩm

Các thông số sắc ký của 6 lần tiêm mẫu

chuẩn, 6 lần tiêm mẫu thử hạt Cúc gai và 6 lần

tiêm mẫu thử chế phẩm có RSD% của thời

gian lưu (tR) < 1%, của diện tích pic (Spic) < 3%,

độ phân giải (Rs) > 1,5; hệ số kéo đuôi T nằm trong khoảng từ 0,8 đến 1,5; số đĩa lý thuyết (N) > 10000 Như vậy quy trình có tính tương thích hệ thống

Khảo sát tính đặc hiệu

Hình 1: Sắc ký đồ thẩm định tính đặc hiệu

Thời gian lưu của các pic silybin A và silybin

B trên sắc ký đồ của mẫu thử hạt Cúc gai và mẫu

thử chế phẩm tương đương với thời gian lưu của

các pic silybin A và silybin B trên sắc ký đồ của

mẫu chuẩn Trên sắc ký đồ mẫu trắng và mẫu

pha động không xuất hiện các pic có thời gian

lưu tương ứng với các pic chính trên sắc ký đồ

mẫu chuẩn Khi thêm một lượng chất chuẩn vào

mẫu thử, diện tích pic silybin A và silybin B đều

tăng thêm so với trước khi thêm chuẩn Như

vậy, quy trình có tính đặc hiệu (hình 1)

Khảo sát tính tuyến tính

Có sự phụ thuộc tuyến tính giữa nồng độ silybin và diện tích pic, trong khoảng nồng độ khảo sát từ 10 đến 500 µg/ml; phương trình hồi qui: ŷ = 31133x, R² = 0,9969

Khảo sát độ chính xác

Hàm lượng silybin trong 6 mẫu thử ngày thứ 2 có RSD% < 5% và hàm lượng silybin trong 12 mẫu thử ở cả 2 ngày của mẫu thử hạt Cúc gai và chế phẩm có RSD% < 5%

Bảng 2: Kết quả khảo sát độ chính xác

TB (n=6)

(n=12)

RSD (%) (n=12)

Khảo sát độ đúng

Từ kết quả trung bình khi đánh giá độ

chính xác, xác định hàm lượng silybin

trong mẫu thử dược liệu và chế phẩm Sau

đó tiến hành đánh giá độ đúng với lượng

silybin đối chiếu thêm vào lần lượt là 80%, 100% và 120% hàm lượng các chất có trong mẫu Tại mỗi mức chuẩn thêm vào thực hiện 3 mẫu độc lập phân tích theo quy trình đã xây dựng

Bảng 3: Kết quả khảo sát độ đúng

lượng

Lượng thêm vào (µg)

Lượng tìm thấy (µg)

Tỉ lệ phục hồi (%)

Lượng thêm vào (µg)

Lượng tìm thấy (µg)

Tỉ lệ phục hồi (%)

1

80%

1

100%

1

120%

Nhận xét: Tỷ lệ phục hồi của silybin trong

mỗi mẫu ở các mức nồng độ thẩm định từ 90%

đến 110% và RSD% < 5%

Ứng dụng quy trình định lượng silybin

Kết quả định lượng silybin trong mẫu hạt

Cúc gai, chế phẩm FY là viên nén bao phim,

chế phẩm ZE là viên nang cứng được trình bày trong bảng 5

Bảng 4: Kết quả định lượng silybin trong các mẫu thực nghiệm

Chế phẩm FY 49,17 (mg/viên) Chế phẩm ZE 40,82 (mg/viên)

BÀN LUẬN

Xử lý hạt Cúc gai trong quy trình chiết mẫu

thử khó khăn vì hạt Cúc gai có chứa lượng dầu

béo rất cao, khoảng 30% Do đó, trước khi chiết

flavonolignan phải tiến hành loại dầu béo nhiều

lần bằng n-hexan Sử dụng cột Knauer C18 (5

µm, 250 mm × 4,6 mm) để định lượng silymarin

trong hạt Cúc gai theo DĐVN V và USP 40 trên

máy HPLC Waters Alliance e2695, đầu dò PDA

Waters 2998 cho thấy pic của các flavonolignan

khác có trong cúc gai như silydianin (theo tỉ lệ

thời gian lưu khoảng 0,73 so với pic silybin A)

không đạt độ tinh khiết và độ phân giải (dính

liền với pic của một chất chưa rõ có hàm lượng

khá lớn), pic silychristin (tỉ lệ thời gian lưu

khoảng 0,68 so với pic silybin A) cũng không đạt

độ tinh khiết Điều kiện phân tích bằng HPLC

của DĐVN V đòi hỏi tổng thời gian phân tích lên

tới 80 phút, của USP 40 là 55 phút Do đó, quy

trình định lượng được đề ra với thời gian phân

tích ngắn hơn và cho độ phân giải, độ tinh khiết

của các pic tốt hơn; cùng với thay đổi cách tính

toán để đánh giá chất lượng dược liệu và chế

phẩm qua hàm lượng silybin (tổng hàm lượng

silybin A và silybin B)

KẾT LUẬN

Đã xây dựng được quy trình định lượng

silybin trong hạt Cúc gai và chế phẩm Kết quả

thẩm định quy trình đã xây dựng về tính đặc

hiệu, khoảng tuyến tính, độ lặp lại, độ đúng cho thấy các quy trình đều có độ đặc hiệu tốt, khoảng tuyến tính rộng, độ lặp lại tốt và độ đúng với độ phục hồi phù hợp Áp dụng các quy trình đã được thẩm định để xác định được hàm lượng silybin trong hạt Cúc gai là 1,79 mg/g (tính trên dược liệu khô kiệt); trong các chế phẩm FY, ZE lần lượt là 49,17 mg và 40,82 mg trong 1 viên chế phẩm Quy trình đã được xây dựng góp phần kiểm soát chất lượng của dược liệu hạt Cúc gai và các chế phẩm có nguồn gốc từ Cúc gai

TÀI LIỆU THAM KHẢO

Silybum marianum fruits at different maturity stages”, Journal

of Medicinal Plants Research, Vol 7 (23), pp 1665-1669

Y học, Hà Nội, tr 1129-1130

methodology, Q2 (R1), pp 1 - 13

Pharmacopeia National Formulary USP 41 NF 36, (2018), Dietary Supplements: Milk Thistle

bản y học, Hà Nội, tr 670-671

Ngày nhận bài báo: 18/10/2018 Ngày phản biện nhận xét bài báo: 01/11/2018 Ngày bài báo được đăng: 15/03/2019