Xây dựng quy trình định lượng silybin trong dược liệu hạt Cúc gai và chế phẩm từ Cúc gai (Silybum marianum (L.) Gaertn) bằng phương pháp HPLC

Xây dựng quy trình định lượng silybin trong dược liệu hạt Cúc gai Silybum marianum (L.) Gaertn. và chế phẩm từ hạt cúc gai bằng phương pháp HPLC.

Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số * 2019 XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG SILYBIN TRONG DƯỢC LIỆU HẠT CÚC GAI VÀ CHẾ PHẨM TỪ CÚC GAI (SILYBUM MARIANUM (L.) GAERTN) BẰNG PHƯƠNG PHÁP HPLC Ngô Thị Thanh Diệp*, La Hồng Anh*, Hà Quốc Huấn*, Tạ Cơng Minh Huy* TÓMTẮT Mở đầu: Cây Cúc gai, tên khoa học Silybum marianum (L.) Gaertn., thành phần hóa học chứa flavonolignan với hoạt chất silybin chứng minh có tác dụng tốt điều trị bệnh gan in vitro in vivo Các loại thuốc thực phẩm chức từ Cúc gai xuất nhiều thị trường nước giới Việc tiêu chuẩn hóa dược liệu Cúc gai tạo nguồn nguyên liệu cho sản xuất chế phẩm thuốc điều trị bệnh gan thận, đồng thời kiểm tra chất lượng chế phẩm có nguồn gốc từ Cúc gai lưu hành thị trường vấn đề quan tâm Mục tiêu: Xây dựng quy trình định lượng silybin dược liệu hạt Cúc gai Silybum marianum (L.) Gaertn chế phẩm từ hạt cúc gai phương pháp HPLC Đối tượng - Phương pháp nghiên cứu: Đối tượng nghiên cứu silybin có dược liệu chế phẩm từ Cúc gai Tiến hành khảo sát thơng số cho quy trình định lượng Từ đó, xây dựng thẩm định quy trình định lượng Silybin hạt Cúc gai chế phẩm từ hạt Cúc gai thị trường mã hóa FY, ZE phương pháp HPLC áp dụng quy trình để xác định hàm lượng silybin hạt Cúc gai chế phẩm FY, ZE Kết quả: Xây dựng thẩm định quy trình định lượng Silybin hạt Cúc gai số chế phẩm từ hạt Cúc gai phương pháp HPLC với thông số: Cột sắc ký Knauer C18 (5 µm, 250 mm × 4,6 mm), bước sóng phát 288 nm, tốc độ dòng ml/phút, nhiệt độ cột: 40 oC, thể tích tiêm mẫu: 10 µl, pha động: dung mơi A: nước – methanol – acid phosphoric (80 : 20 : 0,5), dung môi B: nước – methanol – acid phosphoric (20 : 80 : 0,5) theo chương trình rửa giải gradient Kết thẩm định cho thấy quy trình có tính đặc hiệu, khoảng tuyến tính rộng, độ xác với RSD < 5%, tỷ lệ phục hồi Silybin nằm khoảng 90-110% Áp dụng quy trình xây dựng để xác định hàm lượng Silybin hạt Cúc gai số chế phẩm từ hạt Cúc gai thị trường Kết cho thấy hàm lượng silybin hạt Cúc gai khoảng 1,79 mg/g tính theo dược liệu khô kiệt; chế phẩm FY – 49,17 mg/viên; chế phẩm ZE – 40,82 mg/viên Kết luận: Đã xây dựng thẩm định quy trình định lượng Silybin dược liệu hạt Cúc gai chế phẩm từ hạt Cúc gai Quy trình sử dụng để đánh giá chất lượng dược liệu chế phẩm từ hạt Cúc gai thị trường Từ khóa: Cúc gai, milk thistle seed, silybin, HPLC ABSTRACT QUANTITATIVE DETERMINATION OF SILYBIN IN MILK THISTLE SEEDS (SILYBUM MARIANUM (L.) GAERTN.) AND THEIR PRODUCTS BY HPLC METHOD Ngo Thi Thanh Diep, La Hoang Anh, Ha Quoc Huan, Ta Cong Minh Huy * Ho Chi Minh City Journal of Medicine * Supplement of Vol 23 - No 2- 2019: 512 – 518 * Khoa Dược, Đại học Y Dược Thành phố Hồ Chí Minh Tác giả liên lạc: PGS.TS Ngô Thị Thanh Diệp ĐT: 0776671588 512 Email: thanhdiep73@yahoo.com Chuyên Đề Dược Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số * 2019 Nghiên cứu Y học Introduction: Milk thistle, scientific name is Silybum marianum (L.) Gaertn, in chemical compositions containing flavonolignans with major active ingredient silybin has been shown to be effective in treating liver disease in vitro and in vivo Drugs and dietary supplements from milk thistle have appeared quite in the domestic market and in the world Therefore, the standardization of this medicinal herbs – seeds Milk thistle and controlling the quality of their products is necessary Objectives: This study aims to quantitative determination of Silybin in seeds Silybum marianum (L.) Gaertn and their products by HPLC method Materials and methods: The study subject was Silybin in seeds Silybum marianum (L.) Gaertn and corresponding products Parameters for the quantitative procedure were determined After that, the quantitative determination of Silybin in seeds Silybum marianum (L.) Gaertn and their products on the market by HPLC method was developed and validated The procedure was applied to determine Silybin in seeds Silybum marianum (L.) Gaertn and FY, ZE products Results: The quantitative determination of Silybin in seeds Silybum marianum (L.) Gaertn and their products by HPLC method was developed and validated with parameters: column Knauer C18 (5 àm, 250 mm ì 4.6 mm); warelenght detection of 288 nm, column temperature of 40 oC, injection volume of 10 µL, water – methanol – acid phosphoric (80 : 20 : 0.5) was used as mobile phase A and water – methanol – acid phosphoric (20 : 80 : 0.5) was used as mobile phase B at a gradient, flow rate mL/min The results illustrated that the procedure had selectivity, wide linearity, intra-day relative standard deviation was below 5%; accuracy with the recovery range was 90-110% for Silybin The validated method was applied to determine Silybin in Silybum marianum (L.) Gaertn seeds and their products on the market The results also showed that Silybin in Silybum marianum (L.) Gaertn seeds were about 1.79 mg/g of the dried material and in FY, ZE products were 49.17 mg and 40.82 mg /unit, respectively Conclusion: The method for quantitative determination of Silybin in seeds Silybum marianum (L.) Gaertn and their products was developed and evaluated effectively, was suitable for testing the quality of seeds Silybum marianum (L.) Gaertn and their products Key words: Silybum marianum (L.) Gaertn, Milk Thistle seeds, Silybin, HPLC ĐẶTVẤNĐỀ: Thành phần hóa học Cúc gai chứa Cây Cúc gai (còn gọi kế sữa, kế thánh, flavonolignan chứng minh có tác kế đức mẹ ), tên khoa học Silybum marianum dụng tốt điều trị bệnh gan in vitro (L.) Gaertn Cúc in vivo Flavonolignan Cúc gai (Asteraceae) Cúc gai sử dụng làm silymarin (1-4% thành phần khô) thuốc bảo vệ gan mật từ lâu Nhiều loại thuốc Silymarin thực phẩm chức từ Cúc gai sử flavonolignan dụng rộng rãi Hoa Kỳ châu Âu silydianin silychristin, thành phần nhiều nơi giới để chữa cải thiện silybin (khoảng 40%)(1) lồi thuộc họ hỗn hợp polyphenol gồm silybin, chức gan Hơn thế, nghiên cứu gần Cúc gai chế phẩm từ Cúc gai giới cho thấy nhiều tác dụng sử dụng rộng rãi phương dược lý khác kháng HIV, chống oxy hóa, thuốc dân gian điều trị bệnh hiểm nghèo chống ung thư… gan, thận phổ biến nước ta(5) Chuyên Đề Dược 513 Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số * 2019 Việc tiêu chuẩn hóa dược liệu Cúc gai tạo nguồn nguyên liệu cho sản xuất chế phẩm thuốc điều trị bệnh gan thận, đồng thời kiểm tra chất lượng chế phẩm có nguồn gốc từ Cúc gai lưu hành thị trường, góp phần nâng cao sức khỏe người dân vấn đề quan tâm cấp thiết Xuất phát từ tình hình này, đề tài thực với mục tiêu sau: Xây dựng quy trình định lượng silybin dược liệu hạt Cúc gai Silybum marianum (L.) Gaertn chế phẩm từ hạt Cúc gai phương pháp HPLC Thẩm định quy trình xây dựng áp Chất đối chiếu: Silybin Viện Kiểm nghiệm Thuốc TP Hồ Chí Minh cung cấp, số lơ: QT198 060717, hàm lượng 90,2% Hóa chất, dung mơi Petroleum ether, n-hexan, toluen, aceton, ethyl acetat, cloroform, acid formic, methanol, dùng loại AR Trung Quốc sản xuất, số hóa chất thuốc thử thơng thường khác phòng thí nghiệm Các dung mơi (methanol, acetonitril, acid phosphoric) loại tinh khiết dùng cho HPLC (Merck), nước cất hai lần dùng quy trình định lượng Trang thiết bị dụng để xác định hàm lượng silybin Hệ thống HPLC Waters Alliance e2695, dược liệu (hạt Cúc gai) số chế phẩm từ đầu dò PDA Waters 2998, cột sắc ký Knauer hạt Cúc gai thị trường C18 (5 àm, 250 mm ì 4,6 mm), b chit Soxhlet, ĐỐITƯỢNG-PHƯƠNGPHÁPNGHIÊNCỨU bể siêu âm Elma, tủ sấy điện WM500CO, bếp Đối tượng nghiên cứu Silybin có dược liệu chế phẩm từ Cúc gai Nguyên vật liệu, chất chuẩn, hóa chất, dung mơi, trang thiết bị Ngun liệu Hạt Cúc gai Silybum marianum (L.) Gaertn thu mua năm 2017 hãng Starwest Botanicals (nguồn gốc: Croatia) Hạt sấy khô, xay thành bột thô Mất khối lượng làm khô mẫu dược liệu xác định 6,87% Các chế phẩm thực phẩm chức chứa silymarin có nguồn gốc từ Cúc gai thu mua thị trường: Viên nén bao phim FY (số lô 011), viên chứa: Silymarin 200 mg Viên nang cứng ZE (số lô 030416), viên chứa: Silymarin 70 mg 514 cách thủy (Memmert), cân phân tích số CP 225D (Sartorius) dụng cụ thủy tinh thơng thường khác phòng thí nghiệm Phương pháp nghiên cứu Dựa vào DĐVN V(2), USP 41(4), áp dụng kỹ thuật sắc ký pha đảo với hệ dung môi phân cực Trong trình thực nghiệm, yếu tố ảnh hưởng đến hiệu tách phương pháp khảo sát bao gồm hệ pha động, cột sắc ký số lần chiết Sau tìm điều kiện sắc ký thích hợp tiến hành thẩm định quy trình phân tích theo ICH(3) ứng dụng quy trình thẩm định vào việc định lượng silybin mẫu dược liệu hạt Cúc gai chế phẩm KẾTQUẢ Dựa vào kết khảo sát điều kiện thực nghiệm số lần chiết, chương trình gradient, hệ pha động, cột sắc ký, lựa chọn điều kiện chuẩn bị mẫu điều kiện sắc ký cho quy trình định lượng sau: Chuyên Đề Dược Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số * 2019 Chuẩn bị mẫu Mẫu thử (hạt Cúc gai) Cân xác khoảng g bột dược liệu vào túi giấy lọc đặt vào bình chiết Soxhlet 250 ml có chứa 160 ml n-hexan (TT) Đun hồi Nghiên cứu Y học Cơng thức tính kết quả: Hàm lượng Silybin có dược liệu tính theo cơng thức sau: S 100 x 100 X (mg/g) = t x C c x x Sc m 100 - h  1000 lưu cách thủy giờ, để nguội, loại bỏ Trong đó: lớp n-hexan, để bay hồn tồn dung mơi X: hàm lượng silybin có dược liệu khơ kiệt (mg/g) khỏi dược liệu Chuyển dược liệu túi giấy St: Tổng diện tích pic silybin A B mẫu thử (µV.s) lọc đựng dược liệu sang bình nón nút mài 100 ml, có chứa 70 ml ethyl acetat (EA) Đun hồi Sc: Tổng diện tích pic silybin A B mẫu chuẩn (µV.s) lưu cách thủy giờ, thu lấy dịch chiết (làm Cc: nồng độ silybin mẫu chuẩn (µg/ml) lần) Gộp dịch chiết lần cho vào cốc 250 ml m: khối lượng bột dược liệu cân (g) Cô cách thủy đến cạn Dùng methanol (TT) để h: hàm ẩm dược liệu (%) hòa tan chuyển tồn cắn vào bình định Hàm lượng Silybin có chế phẩm tính theo cơng thức: mức 100 ml, thêm methanol (TT) đến vạch, lắc đều, lọc qua màng lọc 0,45 µm Mẫu thử (chế phẩm) Bỏ lớp bao phim, cân nghiền thành bột 20 viên, tính khối lượng trung bình viên Cân xác lượng bột thuốc tương ứng với 100 mg silymarin vào bình định mức 100 ml, thêm 60 ml methanol, hòa tan Trong đó: X: hàm lượng silybin có viên chế phẩm (mg/viên) St: Tổng diện tích pic silybin A B mẫu thử (µV.s) cách siêu âm khoảng 20 phút, bổ Sc: Tổng diện tích pic silybin A B mẫu chuẩn (µV.s) sung methanol (TT) đến vạch, lắc Hút Cc: nồng độ silybin mẫu chuẩn (µg/ml) xác 10 ml cho vào bình định mức 25 mtb: khối lượng bột thuốc đơn vị chế phẩm (g) ml, thêm methanol (TT) đến vạch, lắc đều, a: khối lượng bột thuốc cân (g) lọc qua màng lọc 0,45 µm Khảo sát điều kiện sắc ký Mẫu chuẩn Điều kiện sắc ký thích hợp lựa chọn: Ct sc ký Knauer C18 (5 àm, 250 mm ì 4,6 mm), thể tích tiêm mẫu: 10 µL, nhiệt độ cột: 40 oC Hệ pha động: Dung môi A: nước – methanol – acid phosphoric (80 : 20 : 0,5); Dung môi B: nước – methanol – acid phosphoric (20 : 80 : 0,5) Cân xác khoảng 28 mg chất đối chiếu silybin (hàm lượng 90,2%) vào bình định mức 10 ml, thêm MeOH đến vạch để thu dung dịch chuẩn gốc có nồng độ silybin 2500 µg/ml Từ dung dịch chuẩn gốc pha dung dịch chuẩn có nồng độ khoảng 10 µg/ml; 50 µg/ml; 100 µg/ml; 250 µg/ml; 500 µg/ml, lọc qua màng lọc 0,45 µm, để khảo sát khoảng tuyến tính thẩm định quy trình định lượng Chuyên Đề Dược Chương trình Gradient: Thời gian (phút) 0-5 5-20 20-50 Tốc độ dòng (ml/phút) 1 Dung mơi A Dung mơi B (%) (%) 85 15 85 → 55 15 → 45 55 45 515 Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số * 2019 Nghiên cứu Y học Thẩm định quy trình định lượng Khảo sát tính tương thích hệ thống Bảng 1: Kết khảo sát tính tương thích hệ thống Silybin A Chuẩn Silybin B Silybin A Hạt Cúc gai Silybin B Silybin A Chế phẩm Silybin B TB RSD% TB RSD% TB RSD% TB RSD% TB RSD% TB RSD% tR (phút) 32,33 0,17 34,56 0,17 32,33 0,39 34,60 0,36 32,47 0,31 34,76 0,27 Các thông số sắc ký lần tiêm mẫu chuẩn, lần tiêm mẫu thử hạt Cúc gai lần tiêm mẫu thử chế phẩm có RSD% thời gian lưu (tR) < 1%, diện tích pic (Spic) < 3%, S (µV.s) 1598199 2,34 1663731 2,29 994016 1,62 1621800 1,75 1191277 1,75 20041066 2,00 Rs 3,42 2,18 13,75 2,96 3,24 2,12 3,32 2,43 k 11,21 0,21 12,07 0,18 11,22 0,56 1,42 0,57 11,28 0,34 12,14 0,30 T 1,08 0,75 1,12 0,67 1,13 0,56 1,42 0,57 1,08 0,51 1,40 1,46 N 42298 5,04 38009 4,34 40440 5,27 31595 4,48 42683 6,36 32703 5,35 độ phân giải (Rs) > 1,5; hệ số kéo đuôi T nằm khoảng từ 0,8 đến 1,5; số đĩa lý thuyết (N) > 10000 Như quy trình có tính tương thích hệ thống Khảo sát tính đặc hiệu Hình 1: Sắc ký đồ thẩm định tính đặc hiệu 516 Chuyên Đề Dược Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số * 2019 Thời gian lưu pic silybin A silybin Nghiên cứu Y học Khảo sát tính tuyến tính B sắc ký đồ mẫu thử hạt Cúc gai mẫu Có phụ thuộc tuyến tính nồng độ thử chế phẩm tương đương với thời gian lưu silybin diện tích pic, khoảng nồng độ pic silybin A silybin B sắc ký đồ khảo sát từ 10 đến 500 µg/ml; phương trình mẫu chuẩn Trên sắc ký đồ mẫu trắng mẫu hồi qui: ŷ = 31133x, R² = 0,9969 pha động không xuất pic có thời gian Khảo sát độ xác lưu tương ứng với pic sắc ký đồ Hàm lượng silybin mẫu thử ngày mẫu chuẩn Khi thêm lượng chất chuẩn vào thứ có RSD% < 5% hàm lượng silybin mẫu thử, diện tích pic silybin A silybin B 12 mẫu thử ngày mẫu thử hạt tăng thêm so với trước thêm chuẩn Như Cúc gai chế phẩm có RSD% < 5% vậy, quy trình có tính đặc hiệu (hình 1) Bảng 2: Kết khảo sát độ xác Hạt Cúc gai Chế phẩm TB (n=6) 1,84 58,57 Độ lặp lại RSD (%) (n=6) TB (n=6) 3,32 2,62 1,84 57,69 Khảo sát độ Từ kết trung bình đánh giá độ xác, xác định hàm lượng silybin mẫu thử dược liệu chế phẩm Sau tiến hành đánh giá độ với lượng Bảng 3: Kết khảo sát độ Mẫu 3 Độ xác trung gian RSD (%) (n=6) TB (n=12) 2,90 1,84 1,00 58,13 RSD (%) (n=12) 2,97 2,06 silybin đối chiếu thêm vào 80%, 100% 120% hàm lượng chất có mẫu Tại mức chuẩn thêm vào thực mẫu độc lập phân tích theo quy trình xây dựng Silybin hạt Cúc gai Silybin chế phẩm Lượng thêm Lượng tìm thấy Tỉ lệ phục hồi Lượng thêm Lượng tìm Tỉ lệ phục vào (µg) (µg) (%) vào (µg) thấy (µg) hồi (%) 680 686 101,0 2055 1973 96,0 80% 680 678 99,8 2055 1978 96,2 680 701 103,1 2055 1850 90,0 850 876 103,1 2580 2429 94,2 100% 850 857 100,8 2580 2405 93,2 850 838 98,5 2580 2388 92,6 1030 1009 98,0 3090 2801 90,6 120% 1030 978 94,9 3090 2816 91,1 1030 1050 102,0 3090 2804 90,7 Tỷ lệ phục hồi trung bình 100,1 92,7 RSD% 2,7 2,5 Mức hàm lượng Nhận xét: Tỷ lệ phục hồi silybin mẫu mức nồng độ thẩm định từ 90% đến 110% RSD% < 5% Ứng dụng quy trình định lượng silybin Kết định lượng silybin mẫu hạt Cúc gai, chế phẩm FY viên nén bao phim, Chuyên Đề Dược chế phẩm ZE viên nang cứng trình bày bảng Bảng 4: Kết định lượng silybin mẫu thực nghiệm Mẫu Hạt Cúc gai Chế phẩm FY Chế phẩm ZE Hàm lượng silybin 1, 79 (mg/g) 49,17 (mg/viên) 40,82 (mg/viên) 517 Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số * 2019 BÀNLUẬN Xử lý hạt Cúc gai quy trình chiết mẫu thử khó khăn hạt Cúc gai có chứa lượng dầu béo cao, khoảng 30% Do đó, trước chiết flavonolignan phải tiến hành loại dầu béo nhiều lần n-hexan Sử dụng cột Knauer C18 (5 µm, 250 mm × 4,6 mm) để định lượng silymarin hạt Cúc gai theo DĐVN V USP 40 máy HPLC Waters Alliance e2695, đầu dò PDA Waters 2998 cho thấy pic flavonolignan khác có cúc gai silydianin (theo tỉ lệ thời gian lưu khoảng 0,73 so với pic silybin A) không đạt độ tinh khiết độ phân giải (dính liền với pic chất chưa rõ có hàm lượng lớn), pic silychristin (tỉ lệ thời gian lưu khoảng 0,68 so với pic silybin A) không đạt độ tinh khiết Điều kiện phân tích HPLC DĐVN V đòi hỏi tổng thời gian phân tích lên tới 80 phút, USP 40 55 phút Do đó, quy trình định lượng đề với thời gian phân tích ngắn cho độ phân giải, độ tinh khiết pic tốt hơn; với thay đổi cách tính tốn để đánh giá chất lượng dược liệu chế phẩm qua hàm lượng silybin (tổng hàm lượng silybin A silybin B) KẾTLUẬN hiệu, khoảng tuyến tính, độ lặp lại, độ cho thấy quy trình có độ đặc hiệu tốt, khoảng tuyến tính rộng, độ lặp lại tốt độ với độ phục hồi phù hợp Áp dụng quy trình thẩm định để xác định hàm lượng silybin hạt Cúc gai 1,79 mg/g (tính dược liệu khơ kiệt); chế phẩm FY, ZE 49,17 mg 40,82 mg viên chế phẩm Quy trình xây dựng góp phần kiểm sốt chất lượng dược liệu hạt Cúc gai chế phẩm có nguồn gốc từ Cúc gai TÀILIỆUTHAMKHẢO Ahlam E, Ahlam E, Sameh A (2013), “Silymarin content in Silybum marianum fruits at different maturity stages”, Journal of Medicinal Plants Research, Vol (23), pp 1665-1669 Bộ Y tế (2017), Dược điển Việt Nam V, Tập 2, Nhà xuất Y học, Hà Nội, tr 1129-1130 ICH Harmonised Tripartite Guideline (2005), Validation of analytical procedures: text and methodology, Q2 (R1), pp - 13 United States Pharmcopeial Convention, U.S Pharmacopeia National Formulary USP 41 NF 36, (2018), Dietary Supplements: Milk Thistle Võ Văn Chi (2012), Từ điển thuốc Việt Nam, Nhà xuất y học, Hà Nội, tr 670-671 Ngày nhận báo: Ngày phản biện nhận xét báo: Ngày báo đăng: 18/10/2018 01/11/2018 15/03/2019 Đã xây dựng quy trình định lượng silybin hạt Cúc gai chế phẩm Kết thẩm định quy trình xây dựng tính đặc 518 Chuyên Đề Dược ... Xây dựng quy trình định lượng silybin dược liệu hạt Cúc gai Silybum marianum (L.) Gaertn chế phẩm từ hạt Cúc gai phương pháp HPLC Thẩm định quy trình xây dựng áp Chất đối chiếu: Silybin Viện... dụng quy trình thẩm định để xác định hàm lượng silybin hạt Cúc gai 1,79 mg/g (tính dược liệu khơ kiệt); chế phẩm FY, ZE 49,17 mg 40,82 mg viên chế phẩm Quy trình xây dựng góp phần kiểm sốt chất lượng. .. thích hợp tiến hành thẩm định quy trình phân tích theo ICH(3) ứng dụng quy trình thẩm định vào việc định lượng silybin mẫu dược liệu hạt Cúc gai chế phẩm KẾTQUẢ Dựa vào kết khảo sát điều kiện