Xây dựng và thẩm định quy trình định lượng coixol trong Cam thảo nam. Áp dụng quy trình đã xây dựng và thẩm định để định lượng coixol trong các mẫu thu hái ở các thời điểm và địa phương khác nhau.
Trang 1XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG COIXOL
TRONG CAM THẢO NAM (SCOPARIA DULCIS L., SCROPULARIACEAE)
BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÍ LỎNG HIỆU NĂNG CAO
Phạm Thị Thanh Hương * , Trần Thị Vân Anh *
TÓM TẮT
Mở đầu: Cam thảo nam (Scoparia dulcis L Scrophulariaceae) là dược liệu được sử dụng khá phổ biến
nhưng tiêu chuẩn kiểm soát chất lượng vẫn chưa được nâng cao Đề tài thực hiện nghiên cứu xây dựng quy trình định lượng coixol (một alcaloid chính trong Cam thảo nam) bằng phương pháp sắc kí lỏng hiệu năng cao nhằm nâng cao tiêu chuẩn kiểm nghiệm dược liệu
Mục tiêu: Xây dựng và thẩm định qui trình định lượng coixol trong Cam thảo nam Áp dụng qui
trình đã xây dựng và thẩm định để định lượng coixol trong các mẫu thu hái ở các thời điểm và địa phương khác nhau
Đối tượng – Phương pháp nghiên cứu: Đối tượng nghiên cứu là hàm lượng coixol có trong Cam thảo
nam Nghiên cứu các điều kiện của quy trình xử lý mẫu và điều kiện sắc kí để định lượng coixol trong S dulcis bằng phương pháp sắc kí lỏng hiệu năng cao
Kết quả: Xác định điều kiện phân tích sắc kí: Cột Cosmosil 2,5 Chlolester (75 x 2,0 mm; 2,5 µm);
nhiệt độ cột 35 o C; tốc độ dòng: 0,45 mL/phút; thể tích tiêm mẫu 1 µl; bước sóng phát hiện: 230 nm; chương trình rửa giải (A: nước, B: ACN) 0-3 phút: 5 % B, 3-14 phút: 5-15 % B, 14-15 phút; 15-90 % B, 15-24 phút; 90 % B Qui trình định lượng đều đạt các chỉ tiêu đánh giá về tính phù hợp của hệ thống, tính đặc hiệu, độ đúng, độ chính xác và tính tuyến tính Đã áp dụng quy trình đã xây dựng và thẩm định để khảo sát hàm lượng coixol trong các mẫu Cam thảo nam thu hái ở thời điểm và địa phương khác nhau Hàm lượng coixol trong các mẫu dao động trong khoảng 0,61 – 2,14 mg/g
Kết luận: Đề tài đã xây dựng qui trình định lượng coixol trong Cam thảo nam bằng phương pháp UPLC-PDA làm cơ sở cho việc nâng cao tiêu chuẩn kiểm nghiệm dược liệu
Từ khóa: Cam thảo nam, định lượng coixol, UPLC
ABSTRACT
QUANTIFICATION OF COIXOL IN SCOPARIA DULCIS
BY HIGH PERFORMANCE LIQUID CHROMATOGRAPHY
Pham Thi Thanh Huong, Tran Thi Van Anh
* Ho Chi Minh City Journal of Medicine * Supplement of Vol 23 - No 2- 2019: 101-107
Background : Sweet-broom (Scoparia dulcis L., Scrophulariaceae) is used widely as a medicinal herb; however, the quality control standards of S dulcis have not been improved Therefore, the aim of this study
is to develop a method for the quantification of coixol (a major alkaloid in S dulcis) by UPLC-PDA
Objective s: This research aims to develop and validate a method for the determination of coixol in
S dulcis and apply the method for quantifying of coixol in different materials.
Methods : The subject of this study was the content of coixol in S dulcis The method for preparation samples and the UPLC chromatographic conditions for determination of coixol in S dulcis were studied
* Khoa Dược, Đại học Y Dược Thành phố Hồ Chí Minh
Trang 2Results : A simple UPLC method was developed for quantitative determination of coixol in S dulcis following chromatographic conditions: Cosmosil 2,5 Cholester column (2,0 ID x 75 mm; 2,5 µm), mobile phase in gradient mode including mixture of water (A) and acetonitrile (B) with the program 0 - 3 min.: 5 % B, 3 - 14 min.: 5 – 15 % B, 14 - 15 min.: 15 – 90 % B, 24 min.: 90 % B, flow rate of 0.45 mL/min., detection wavelength of 230 nm This procedure meets all requirements of system suitability and quantitative method validation such as linearity, specificity, precision and accuracy This method was applied for analyzing different S dulcis samples The contents of coixol in
S dulcis were in range 0.61 –2.14 mg/g
Conclusion: The validated method for determination of coixol in S dulcis could be used in quality
control of herbal materials
Key words: Scoparia dulcis, quantification of coixol, UPLC
ĐẶT VẤN ĐỀ
Cam thảo nam (Scoparia dulcis L
Scrophulariaceae) là một dược liệu được sử
dụng lâu đời trong y học dân gian ở Việt Nam
và các nước trên thế giới như Ấn Độ, Brazil,
Colombia, Nhật Bản…với các công dụng như
trị tiểu đường, trị loét dạ dày, trị rắn cắn, giảm
đau, hạ sốt, làm mát cơ thể…(7) Cam thảo nam
được sử dụng khá phổ biến, tuy nhiên tiêu
chuẩn kiểm soát chất lượng S dulcis vẫn chưa
được nâng cao Trong Dược điển Việt Nam V
ban hành năm 2018, chuyên luận về Cam thảo
nam chỉ dừng ở chỉ tiêu định lượng chất chiết
được trong dược liệu(2)
Nhiều nghiên cứu cho thấy thành phần
hóa học của S dulcis khá đa dạng gồm nhiều
nhóm hợp chất khác nhau như terpenoid,
alcaloid, flavonoid và một số chất khác(6)
Trong đó, coixol là một alcaloid chính trong S
dulcis với nhiều tác dụng dược lý đã được
chứng minh như hạ đường huyết, kháng
khuẩn, kháng nấm, kháng virus HIV, điều hòa
bài tiết chất nhầy đường hô hấp, điều hòa thần
kinh(1,3,5,6,8) Coixol đáp ứng được tiêu chí của
một chất marker có thể sử dụng trong việc tiêu
chuẩn hóa dược liệu S dulcis
Để nâng cao tiêu chuẩn kiểm soát chất
lượng dược liệu, đề tài này được thực hiện
nhằm tạo cơ sở cho việc bổ sung chỉ tiêu định
lượng bằng phương pháp sắc kí lỏng hiệu
năng cao trong chuyên luận kiểm nghiệm
ĐỐI TƯỢNG - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Đối tượng nghiên cứu
Coixol trong các mẫu CTN (toàn cây) thu hái tại Tp Hồ Chí Minh trong 12 tháng (10/2017- 9/2018), và các mẫu thu hái ở 11 tỉnh vào tháng 3/2018 (HT: Hà Tĩnh, KH: Khánh Hòa, LĐ: Lâm Đồng, ĐL: Đắc Lắc; GL: Gia Lai; TN: Tây Ninh; BD: Bình Dương; ĐN-1: Biên Hòa-Đồng Nai, ĐN-2: Cẩm Mỹ-Đồng Nai; LA: Long An) Mẫu được xay nhỏ, rây qua rây 0,425 mm và xác định mất khối lượng do làm khô
Thiết bị phân tích
Hệ thống sắc kí lỏng hiệu năng cao Acquity UPLC (Waters), đầu dò PDA; cột Cosmosil 2,5 Cholester (75 x 2,0 mm; 2,5 µm); cân phân tích Sartorius BP-221S (0,01 mg)
Dung môi-hóa chất
Acetonitril, methanol đạt chuẩn HPLC (Merck); nước cất 2 lần dùng cho sắc kí lỏng;
Chất đối chiếu coixol phân lập từ S dulcis đạt
độ tinh khiết (98,1%)
Phương pháp nghiên cứu
Khảo sát qui trình chiết xuất coixol từ CTN: khảo sát các yếu tố bao gồm dung môi chiết, thời gian chiết, số lần chiết) Sử dụng mẫu CTN thu hái vào tháng 10/2018 tại TP Hồ Chí Minh để thực hiện khảo sát Dựa trên sắc ký đồ kiểm tra pic coixol với mẫu đối chiếu; so sánh diện tích pic coixol
Trang 3Xây dựng và thẩm định qui trình định
lượng coixol trong CTN: thăm dò điều kiện
sắc kí (pha động, kỹ thuật rửa giải) với mục
đích tách pic coixol hoàn toàn (Rs>1,5) với các
pic lân cận trong khi mẫu thử Qui trình được
thẩm định tính phù hợp hệ thống, tính đặc
hiệu, khoảng tuyến tính, độ chính xác và độ
đúng theo hướng dẫn của ICH(4)
Hàm lượng coixol trong S dulcis được tính
theo công thức:
Với : hàm lượng coixol có trong dược
liệu (mg/g), : Diện tích pic của mẫu thử (µV
x s), : Diện tích pic của mẫu chuẩn (µV x s),
Nồng độ của mẫu chuẩn (mg/ml), : Độ
pha loãng của mẫu đo, : Khối lượng dược
liệu (mg), : Độ ẩm dược liệu (%), : Hàm
lượng chất đối chiếu (%)
Áp dụng quy trình đã xây dựng và thẩm
định để khảo sát hàm lượng coixol trong các
mẫu Cam thảo nam thu hái tại Tp Hồ Chí
Minh trong 12 tháng (10/2017 – 9/2017) và mẫu
Cam thảo nam thu hái tạo 12 địa phương vào
tháng 3/2018
KẾT LUẬN
Kết quả khảo sát quy trình chiết xuất coixol
từ CTN
Thăm dò dung môi chiết
Cân chính xác 30 mg dược liệu Cam thảo
nam vào ống nghiệm có nắp vặn, thêm chính
xác 1,5 ml dung môi (acetonitril/MeOH 100%/
MeOH-H2O (9:1)/ MeOH-H2O (8:2) Siêu âm 30
phút, lọc dịch chiết qua màng lọc 0,22 µm,
dịch lọc được tiêm vào máy UPLC và phân
tích Kết quả chọn dung môi MeOH chiết được
coixol trong mẫu tốt nhất
Thăm dò thời gian chiết
Sử dụng MeOH 100% làm dung môi chiết,
thay đổi thời gian chiết lần lượt là (25 phút/45
phút/65 phút/85 phút) ở nhiệt độ 40 oC Kết quả chọn thời gian chiết 45 phút là tối ưu
Thăm dò nhiệt độ chiết
Sử dụng MeOH 100% làm dung môi chiết, chiết ở 45 phút với nhiệt độ thay đổi là (35 oC/40 oC/50 oC/60 oC) Kết quả khảo sát cho thấy chiết ở nhiệt độ 40 oC cho diện tích pic coixol lớn nhất
Thăm dò tỉ lệ dung môi; dược liệu, số lần chiết
Chiết mẫu dược liệu với tỉ lệ dược liệu: dung môi (30 mg: 1,5 ml) các lần chiết 1, 2, 3 đều có hiện diện của pic coixol Để thuận lợi cho việc xử
lý mẫu, tăng tỉ lệ dược liệu: dung môi (30 mg: 3 ml), sau khi chiết lần 1 với điều kiện đã chọn, mẫu được ly tâm, bã dược liệu được chiết lần 2
và lần 3 với 2 ml dung môi Kết quả cho thấy lần chiết thứ 2, pic coixol chỉ chiếm 1,84% Như vậy
có thể chiết kiệt coixol trong 1 lần chiết, thuận tiện cho việc xử lý mẫu
Kết quả khảo sát các điều kiện chiết coixol
từ dược liệu (quy trình xử lý mẫu) trình bày tóm tắt ở Bảng 1
Bảng 1: Kết quả khảo sát các điều kiện xử lý mẫu
100%
MeOH 100%
MeOH 90%
MeOH 80%
Diện tích pic coixol 176637 267393 2657908 259075
Diện tích pic coixol 277383 281318 244950 234015
(98,15%
1220 (1,84%)
Không phát hiện
Từ kết quả khảo sát, qui trình chiết coixol được xác định: Cân chính xác 30 mg bột dược liệu CTN cho vào ống nghiệm có nắp 5 ml, thêm chính xác 3 ml methanol 100%, siêu âm
45 phút ở 40 oC Lọc qua màng lọc milipore cellulose acetate 0,22 µm, dịch lọc tiêm vào hệ thống sắc kí, phân tích theo các điều kiện
đã chọn
Trang 4Khảo sát các điều kiện sắc kí tách pic coixol
tronng mẫu thử
Sau khi tiến hành thăm dò, điều kiện sắc
kí được lựa chọn như sau: cột Cosmosil 2,5
Cholester (75 x 2,0 mm; 2,5 µm), nhiệt độ cột
30 oC, tốc độ dòng: 0,45 ml/phút, thể tích
tiêm mẫu: 1µl, bước sóng phát hiện 230 nm,
pha động A (H2O), B (ACN), chương trình
rửa giải 0 – 3 phút: 5% B, 3 – 14 phút: 5 -15 %
B, 14 – 15 phút: 15-90 % B, 15 – 24 phút: 90%
B Cân bằng cột trong vòng 5 phút giữa 2 lần
chạy liên tiếp
Kết quả thẩm định qui trình
Tính phù hợp hệ thống
Tiến hành phân tích 6 lần mẫu CTN chiết theo qui trình trên để kiểm tra tính phù hợp
hệ thống Phép thử chỉ có giá trị khi pic coixol và các pic lân cận tách hoàn toàn (Rs>1,5)
Kết quả thực nghiệm cho thấy giá trị RSD
% của thời gian lưu và diện tích pic đều <2 %,
hệ số đối xứng 0,8≤As≤1,5, hệ số phân giải>1,5 (Bảng 2) Như vậy quy trình đạt tính phù hợp
hệ thống
Bảng 2: Kết quả thẩm định tính phù hợp hệ thống của quy trình
Độ đặc hiệu
Sắc kí đồ mẫu trắng Sắc kí đồ mẫu đối chiếu
Sắc kí đồ mẫu thử Sắc kí đồ mẫu thử thêm đối chiếu
Hình 1: Kết quả khảo sát tính đặc hiệu
Trang 5Triển khai sắc kí mẫu trắng, mẫu đối
chiếu, mẫu thử và mẫu thử thêm chất đối
chiếu Quan sát thời gian lưu và diện tích pic
của coixol trong các mẫu Sắc kí đồ mẫu trắng
không xuất hiện pic có thời gian lưu tương
ứng với thời gian lưu mẫu đối chiếu coixol,
mẫu thử và mẫu thêm chất đối chiếu có pic
với thời gian lưu tương ứng với pic coixol, khi
thêm chất đối chiếu vào mẫu thử, diện tích pic
coixol tăng lên (Hình 1)
Phổ UV-Vis của pic coixol trong mẫu thử
tương ứng với mẫu đối chiếu; các pic coixol
trong mẫu thử, mẫu đối chiếu, mẫu thử thêm
chất đối chiếu đều đạt độ tinh khiết khi kiểm
tra trên phần mềm Empower
Tính tuyến tính
Nồng độ khảo sát từ 1,0 đến 500 µg/mL
Kết quả khảo sát cho thấy phương trình hồi
qui y=10586x+5847,5 với hệ số tương quan là
R2 = 0,9998 (Hình 2) Theo trắc nghiệm t, hệ số a
có ý nghĩa, hệ số b không có ý nghĩa Theo trắc
nghiệm F phương trình tương thích với độ tin
cậy 95% Như vậy phương trình tuyến tính của
coixol là ӯ = 10586X
Hình 2: Tương quan giữa nồng độ và diện tíc pic coixol
Độ lặp lại
Tiến hành xử lý và sắc ký 6 mẫu thử khác nhau để thẩm định độ lặp lại Bảng 3 trình bày kết quả thực hiện khảo sát độ lặp lại, RSD của hàm lượng coixol trong 6 mẫu < 2% Kết quả cho thấy qui trình đạt độ lặp lại
Bảng 3: Kết quả thẩm định độ lặp lại
Mẫu Khối lượng mẫu (mg) Diện tích pic Hàm lượng
g/mg
Độ đúng
Sử dụng phương pháp thêm dung dịch chuẩn vào dung dịch thử ở 3 tỷ lệ nồng độ để thẩm định độ đúng Bảng 4 trình bày kết quả khảo sát độ đúng
Nhận xét: Tỷ lệ phục hồi nằm trong khoảng 99,0 % -106,0 % Như vậy qui trình có
độ đúng cao
Bảng 4: Kết quả khảo sát độ đúng
% chuẩn thêm vào
KL thêm vào (µg)
KL tìm thấy (µg)
Tỷ lệ phục hồi (%)
Trung bình %
80%
100,51
RSD = 2,33 %
100 %
105,46
RSD = 0,97 %
120 %
104,41
RSD = 1,27 %
Áp dụng qui trình định lượng các mẫu CTN
Áp dụng qui trình tiến hành định lượng các mẫu Cam thảo nam thu hái ở Tp HỒ CHÍ MINH trong 12 tháng (10/2017 -9/2018) và các mẫu Cam thảo nam thu hái ở các địa phương
Trang 6khác nhau vào tháng 3/2018 (kết quả trình bày ở Hình 3 và Hình 4)
Hình 3: Khảo sát hàm lượng coixol trong các mẫu Cam thảo nam thu hái trong 12 tháng tại TP Hồ Chí Minh
Hình 4: Hàm lượng coixol trong các mẫu CTN thu hái ở các địa phương khác nhau (3/2018)
BÀN LUẬN
Khảo sát hàm lượng coixol trong CTN theo
thời gian thu hái cho thấy có sự thay đổi, từ
tháng 12 - tháng 3, hàm lượng coixol dao động
trong khoảng 1,9 -2,4 mg/g, từ tháng 4 hàm
lượng coixol trong mẫu bắt đầu giảm, trong
khoảng tháng 5 - tháng 10 hàm lượng coixol
thấp < 1,0 mg/g Thời điểm thu hái thường
được hướng dẫn trong các tài liệu là: mùa
xuân đến mùa hạ(2), qua kết quả khảo sát cho
cao trong khoảng tháng 12-3, vì vậy có thể đề
xuất việc thu hái S dulcis nên tập trung vào
thời gian này Khảo sát hàm lượng coixol theo địa điểm thu hái tại 12 tỉnh cho thấy hàm lượng coixol
trong các mẫu S dulcis dao động trong khoảng
0,46 - 2,14 mg/g Hàm lượng coixol cao nhất với mẫu thu hái ở tỉnh Bình Dương (2,14 mg/g), thấp nhất ở tỉnh Gia Lai (0,46 mg/g)
Như vậy, hàm lượng coixol trong S dulcis thay
Trang 7ở các tỉnh phía Nam (Bình Dương, Đồng Nai,
Long An, Bà Rịa – Vũng Tàu, TP Hồ Chí
Minh) có hàm lượng cao hơn các tỉnh Tây
Nguyên (Đắc Lắc, Gia Lai)
KẾT LUẬN
Qui trình định lượng coixol trong CTN
được xây dựng và đã được thẩm định đạt các
yêu cầu tính phù hợp hệ thống, độ đặc hiệu,
tính tuyến tính, độ lặp lại, độ đúng Qui trình
cũng đã được áp dụng khảo sát hàm lượng
coixol trong các mẫu CTN thu hái ở TP Hồ
Chí Minh trong 12 tháng và mẫu thu hái ở các
tỉnh Kết quả cho thấy hàm lượng coixol trong
CTN cao nhất vào tháng 12-tháng 3, và trong
các mẫu khảo sát hàm lượng coixol thay đổi
trong khoảng 0,61 – 2,14 mg/g
Đề tài góp phần tạo cơ sở cho việc nâng
cao tiêu chuẩn kiểm nghiệm CTN
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1 Ali A, Haq FU, Arfeen Q, Sharma KR, Adhikari A,
Musharraf SG (2017), “Sensitive Quantification of Coixol, a
Potent Insulin Secretagogue, in Scoparia dulcis Extract using
High Performance Liquid Chromatography combined with
Tandem Mass Spectrometry and UV Detection”, Biomedical
chromatography, 31(10)
2 Bộ Y tế (2018), Dược Điển Việt Nam V, Nhà xuất bản Y học,
Hà Nội, tr 1096-1097
3 Hayashi T, Gotoh K, Ohnishi K, et al (1994),
“6-Methoxy-2-benzoxazolinone in Scoparia dulcis and its production by cultured tissues” Phytochemistry, 37(6), pp.1611-1614
4 International Conference on Harmonization (ICH), Q2B: Validation of Analytical Procedures: Methodology, May 1997
5 Jae H, Jiho L, Su R, Park H (2014), “Suppressive effects of coixol, glyceryl trilinoleate and natural products derived
from Coix lachryma-jobi var ma-yuen on gene expression,
production and secretion of airway MUC5AC mucin”,
Archives of Pharmacal Research, 38(5), pp.620-627
6 Mishra MR, Behera RK, Jha S, et al (2011), “A brief review
on phytoconstituents and ethnopharmacology of Scoparia
dulcis Linn (Scrophulariaceae)”, International Journal of Phytomedicine, 3(4), pp.422-438
7 Report TD (2002), “Technical Data Report for Vassourinha
(Scoparia dulcis)”, Austin, Texas: Sage Press
8 Sharma KR, Adhikari A, Hafizur RM, et al (2015), “Potent
insulin secretagogue from Scoparia dulcis L of nepalese origin”, Phytotherapy Research, 29(10), pp.1672-1675