Định lượng artesunat khi có mặt dihydro artemisinin và (hoặc) acidsuccinic bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)

Để xây dựng một phương pháp định lượng artesunat có tính đặc hiệu cao đồng thời góp phần làm cơ sở xây dựng tiêu chuẩn Dược Điển Việt Nam, trong khoá luận này chúng tôi tiến hành đề tài

BỘ Y TÊ TRƯỜNG ĐẠI HỌC Dược HÀ NỘI

NGUYỄN THANH TÙNG

ĐỊNH LƯỢNG ARTESƯNAT KHI CÓ MẬT DIHYDRO ARTEMISININ VÀ

(HOẶC) ACIDSƯCCINIC BẰNG PHƯƠNG PHÁP

Nơi thực hiện: PHÒNG THÍ NGHIỆM BỘ MÔN

HOÁ DƯỢC - TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HANỘI

Thời gian thực hiện: 9/2003 - 5/2004

í 4

I ị

\

* 'ĩ' ì

í* n ì ị ~ V ị ị'

LỜI CẢM ƠN

Trước hết tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc nhất tới PGS - TS Trần

Đức Hậu, Th.s Vố Nhị Hà hai người thầy trực tiếp hướng dẫn, đã dành

nhiều công sức giúp đỡ và truyền đạt những kinh nghiệm quý báu trong suốt quá trình nghiên cứu và hoàn thành khoá luận tốt nghiệp

Tôi cũng xin cảm ơn các thầy cô giáo, cán bộ kỹ thuật viên của bộ môn Hoá Dược - Trường Đại Học Dược Hà Nội đã nhiệt tình giúp đỡ tạo mọi điều kiện để tôi hoàn thành khoá luận

Trong quá trình thực hiện khoá luận này tôi đã nhận được sự hướng dẫn, giúp đỡ tận tình của các thầy cô ở các bộ môn Bào Chế, Phân Tích, Phòng Thí Nghiệm Trung Tâm Tôi xin chân thành cảm ơn

Cuối cùng, tôi vô cùng cảm ơn gia đình, bạn bè và người thân đã động viên và hết lòng giúp đỡ để tôi hoàn thành khoá luận này

Hà Nội, tháng 5 năm 2004

Nguyễn Thanh Tùng

MỤC LỤC

ĐẶT VẤN Đ Ể 1

PHẦN I: TỔNG Q U A N 3

1.1 Tổng quan về cây thanh hao hoa vàng và các hoạt chất của nó 3

1.1.1 Cây thanh hao hoa vàng 3

1.1.2 Thành phần hóa học của cây Thanh hao hoa vàng 4

1.2 Đại cương về artesunat 6

1.2.1 Công thức 6

1.2.2 Phương pháp điều chế 6

1.2.3 Tính chất của artesunat 8

1.2.4 Cơ chế tác dụng 8

1.2.5 Dược đông học 9

1.2.6 Độc tính 9

1.2.7 Chế phẩm 10

1.2.8 Chỉ định 10

1.3 Các phương pháp định lượng artesunat nguyên liệu 11

1.3.1 Phương pháp đo quang phổ hấp thu vùng tử ngoại 11

1.3.2 Phương pháp HPLC với detector u v 11

1.3.3 Phương pháp HPLC với detector khúc xạ k ế 12

1.3.4 Phương pháp HPLC với detector điện h ó a 12

1.3.5 Phương pháp đo kiềm trong môi trường nước 13

1.3.6 Phương pháp đo kiềm trong môi trường khan 13

1.3.7 Phương pháp đo phổ hấp thụ vùng khả kiến dưới dạng muối hydroxamat sắ t 14

1.3.8 Các phương pháp định lượng khác 14

1.4 Các phương pháp định lượng artesunat trong viên nén đang áp dụng ở

nước t a 14

1.4.1 Phương pháp quang phổ 14

1.4.2 Phương pháp đo kiềm trong môi trường nước 15

1.5 Nhận xét và lựa chọn 15

1.6 Phương pháp HPLC 16

1.6.1 Nguyên tắc 16

1.6.2 Co sở lý thuyết 17

1.6.3 Nguyên tắc cấu tạo của hệ thống máy sắc ký HPLC 17

1.6.4 Các thông số đặc trưng của quá trình sắc ký 19

1.6.4 Pha tĩnh trong HPLC 21

1.6.5 Pha động trong HPLC : 23

1.6.6 Nguyên tắc lựa chọn pha tĩnh và pha động 24

1.6.7 Phương pháp định lượng, cách đánh giá pic và tính kết quả trong HPLC 25

PHẦN II ĐỐI TƯỢNG - HOÁ CHẤT, THIẾT BỊ - NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 27

2.1 Đối tượng nghiên cứu 27

2.2 Phương tiện, dụng cụ hoá chất 27

2.3 Nội dung và phương pháp nghiên cứu 28

2.3.1 Nghiên cứu, xây dựng quy trình kỹ thuật để định lượng artesunat bằng phương pháp HPLC 28

2.3.2 Đánh giá phương pháp vừa xây dựng về các mặt: tính chính xác, tính tuyến tính, tính đúng và đặc biệt trú trọng tới tính đặc hiệu của phương pháp 29

2.3.3 Một số công thức tính toán trong xử lý thống kê kết quả 29

PHẦN III THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ 30

3.1 Xây dựng qui trình kỹ thuật để định lượng artesunat bằng phương pháp HPLC 30

3.1.1 Nguyên tắc lựa chọn điều kiện sắc ký 30

3.1.2 Khảo sát để lựa chọn điều kiện sắc ký 30

3.1.3 Thử tính thích hợp của hệ thống 32

3.2 áp dụng phương pháp đã xây dựng để định lượng artesunat nguyên liệu 33

3.3 Đánh giá phương pháp 34

3.3.1 Đánh giá tính chính xác của phương pháp 35

3.3.2 Đánh giá tính tuyến tính của phương pháp 35

3.3.3 Đánh giá tính đúng của phương pháp 37

3.3.4 Đánh giá tính đặc hiệu của phương pháp 38

3.4 Bàn luận và kết quả 42

KẾT LUẬN VÀ ĐỂ XUẤT 44 TÀI LIỆU THAM KHẢO

BẢNG CHỮ YIẾT TẮT

ĐẶT VẤN ĐỂ

rét, ký sinh trùng này thuộc chi Plasmodium Những loài gây bệnh cho người chủ yếu gồm:

- Plasmodium íalciparum

- Plasmodium malariae

- Plasmodium vivaxTrong đó, tỷ lệ mắc bệnh do Plasmodium falciparum là 70%, do Plasmodium vivax là 20 - 30% còn Plasmodium malariae chiếm tỷ lệ rất nhỏ, chỉ khoảng 1 - 2%

Do đặc điểm tác nhân truyền bệnh là muỗi, bệnh có tính chất dịch tễ rất quan trọng là có thể lan tràn thành dịch nếu không phát hiện và ngăn chặn kịp thời

Bệnh phát triển ở nhiều nước trên thế giới, đặc biệt là những nước nhiệt

đới có khí hậu ẩm thấp (nóng, ẩm, mưa nhiều) Theo số liệu thống kê của Tổ Chức Y Tế thế giới (WHO) có khoảng 100 đến 200 triệu ca sốt rét với mức tử vong từ 1 tới 1,5 triệu ca mỗi năm [17], [24] Theo Bộ y tế ở nước ta hàng năm

có trên 1 triệu ca sốt rét, trong đó có trên 30 000 ca sốt rét ác tính [18]

Việc kiểm soát sốt rét rất khó khăn, có tới 1,7 tỷ người hiện đang sinh sống trong những vùng mà trước đây sốt rét đã bị đẩy lùi, nhưng giờ đây đang phát triển mạnh trở lại Hiện nay ký sinh trùng sốt rét đã kháng lại hầu hết các loại thuốc quen thuộc: Quinolin, Cloroquin, Quinacrin, Mefloquin, làm cho việc điều trị sốt rét ngày càng trở nên khó khăn hơn [24] Do vậy, ngày nay việc nghiên cứu tìm ra và sản xuất thuốc mới chữa sốt rét đã trở thành một yêu cầu cấp bách

Vào đầu thập niên 70, các nhà khoa học Trung Quốc đã chiết xuất được

Quinghaosu (QHS) hay là artemisinin ở Việt Nam, cây Thanh hao hoa vàng cũng đã được trồng và chiết xuất được artemisinin Chất này có vòng

Secquiterpen lacton và nhóm Peroxyl nội phân tử Chất này đã được chứng tỏ

có hiệu lực chống sốt rét tốt với những bệnh nhân mắc chủng kháng thuốc, hơn thế nữa artemisinin và các dẫn xuất của nó có khả năng vượt qua hàng rào máu não nên rất có hiệu lực trong điều trị sốt rét thể não [10] Tuy nhiên, do

độ tan của artemisinin trong nước kém và tỷ lệ tái phát sau khi dùng còn cao nên tác dụng điều trị của artemisinin phần nào còn bị hạn chế Để hoàn thiện khả năng điều trị của artemisinin Các nhà khoa học đã tiếp tục nghiên cứu và bán tổng hợp ra một số dẫn xuất mới như: artesunat, arterether và artermether

có tác dụng điều trị cao hơn artemisinin, đồng thời có thể sử dụng cả đường tiêm, trong số các chất đó thì artesunat được dùng phổ biến nhất hiện nay.Nước ta hiện nay cũng đã tổng hợp được artesunat và đang đưa vào sản xuất với quy mô lớn Việc kiểm tra chất lượng nguyên liệu và thành phẩm artesunat là rất quan trọng, tuy nhiên trong thực tế việc định lượng artesunat ở các cơ sở cho thấy còn nhiều điều bất cập, thường cho kết quả rất cao phụ thuộc người định lượng

Để xây dựng một phương pháp định lượng artesunat có tính đặc hiệu cao đồng thời góp phần làm cơ sở xây dựng tiêu chuẩn Dược Điển Việt Nam, trong khoá luận này chúng tôi tiến hành đề tài “Định lượng artesunat khi có mặt dihydroartemisinin và (hoặc) acid succinic bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)” với những mục tiêu sau:

• Xây dựng quy trình kỹ thuật để định lượng artesunat bằng phương pháp HPLC

• Đánh giá phương pháp đã xây dụng, đặc biệt chú ý tới tính đặc hiệu của phương pháp định lượng artesunat bằng HPLC

PHẦNI

TỔNG QUAN

1.1 Tổng quan vê cây thanh hao hoa vàng và các hoạt chất của nó

1.1.1 Cây thanh hao hoa vàng

Thanh hao hoa vàng là cây thuốc cổ truyền của Trung Quốc đã được sử dụng lâu đời, trong các tài liệu Y học cổ truyền của Trung Quốc có nói đến cây Quinghao là cây đã được ghi chép sớm nhất chữa được tới 52 loại bệnh, trong đó có bệnh sốt rét Từ đời Hán, những năm 168 trước Công Nguyên, người ta đã dùng cây Quinghao để chữa bệnh, người Trung Quốc đã đề xuất cách hạ sốt như sau: dùng một nắm lá Quinghao ngâm trong một lít nước, lọc lấy nước uống Sau đó, Lý Thời Trân đã viết trong: “Bản thảo cương mục” năm 1595 là dùng các chế phẩm của cây Quinghao để chữa các cơn lạnh và cơn sốt rét chính là cây Thanh hao hoa vàng và tên khoa học là: Artemisia annua L Asteraceae

Theo tổ chức Y tế thế giới (WHO) ở Trung Quốc và Mỹ có khoảng 40 loài thực vật thuộc chi artemisia nhưng chỉ có vài loài: artemisia annua L là

chứa hoạt chất có tác dụng chữa sốt rét ờ Việt Nam đã biết có 15 loài, trong

đó có 4 loài rất dễ nhầm lẫn với nhau là: Artemisia capillaris, Artemisia campestris, Artemisia apiaceae và Artemisia annua L; 3 loài Artemisia capillaris, Artemisia campestris, Artemisia apiaceae Hance không chứa artemisinin [11]

• Đặc điểm hình thái của cây Thanh hao hoa vàngThanh hao hoa vàng là loại cây thảo sống lâu năm, mọc hoang thành

từng đám ở vùng đồi núi ven suối, ven sông Cây cao từ 1,5 - 2m, lá xẻ lông

chim hai lần, thành phiếm hẹp, phủ lông mềm, có mùi thơm, cụm hoa hình cầu hợp thành một chùm kép, lá bắc tổng bao hình trứng hoặc hình bầu dục

Hoa màu vàng nhạt, mỗi hoa gồm sáu hoa: giữa là hoa lưỡng tính, xung quanh

là hoa cái, hoa chỉ có kích thước 0,5 - lmm Quả bế hình trứng, dài lmm, mặt

vỏ có tuyến chứa tinh dầu, trên thị trường tại Trung Quốc thường bị trộn một cây khác gọi là hoàng cao hay xú cao cũng họ Cúc nhưng lá quanh năm màu mới vàng, còn trước đó màu lục [13]

Thanh hao hoa vàng phân bố ở nhiều nơi trên thế giới như Trung Quốc, Nhật Bản, ấn Độ, Bắc Mỹ, Iran Mông cổ, Đông  u, [11], [13]

Tại Việt Nam, Thanh hao hoa vàng còn có một số tên gọi khác như: Thanh cao hoa vàng, ngải sĩ, ngải dại, ngải đắng, ngải hôi, ngải hoa vàng, cây

lá ngải, cây mọc hoang dại thành từng cụm dọc ven sông, suối, chân đồi nơi

ẩm thấp ánh sáng nhiều Cây mọc nhiều ở các tỉnh phía Bắc như: Lạng Sơn, Quảng Ninh, Cao Bằng, Bắc Kạn, Thái Nguyên, Hà Bắc, Vĩnh Phú, Tuyên Quang, Hòa Bình, và dọc các tỉnh miền trung: Thanh Hóa, Nghệ An, [10], [13]

1.1.2 Thành phần hóa học của cây Thanh hao hoa vàng

Tất cả các bộ phận trong cây Thanh hao hoa vàng đều có chứa tinh dầu

và hàm lượng tinh dầu trong Thanh hao là rất khác nhau, nó phụ thuộc vào giống và nơi trồng, dao động từ khoảng 0,5 - 0,6% Tinh dầu có màu vàng nhạt và có mùi long não với thành phần chủ yếu là: camphor, 1,8 - cineol, p íamesen, p caryophylen, p cubeben, Artemisia ceton, p mycren, [13]

Ngoài thành phần tinh dầu thì hoạt chất có tác dụng điều trị sốt rét là artemisinin mà các nhà khoa học Trung Quốc đã chiết tách và xác định cấu trúc từ năm 1972, đó là một secquiterpen lacton có cầu nối peroxyd nội phân

tử Ngoài artemisimin người ta còn xác định được một loạt hợp chất secquiterpen khác như sau [15]:

Q u i n g h a o Su ỉ (A ríeanuin A)

1.2 Đại cương về artesunat

Artesunat được bán tổng hợp từ nguyên liệu ban đầu là artemisinin qua giai đoạn trung gian là dihydro artemisinin (DHA), trên cơ sở phương pháp của các nhà khoa học Trung Quốc, D.L Klayman, P.Brosi và cộng sự, trường Đại Học Dược Hà Nội đã bán tổng hợp được artesunat qua hai giai đoạn với

*Giai đoạn 1:

Artemisinin được khử hóa nhóm lacton thành dihydro artemisinin bởi

natri borohydrid (NaBH4) trong môi trường methanol và ở nhiệt độ 0 - 5°c Sơ

đồ phản ứng như sau:

Kết quả thu được DHA ở hai dạng đồng phân là a và 13 , trên thực tế DHA cũng có tác dụng điều trị sốt rét mạnh hơn artemisinin hai lần nhưng việc sử dụng cũng có hạn chế do vậy người ta tiếp tục bán tổng hợp ra artesunat

*Gí'ai đoạn 2 :

DHA được este hóa thành artesunat khi tác dụng với anhydrit succinic hoặc acid succinic với xúc tác là dimethylamino pyridin (DMAP) hoặc hỗn hợp của DMAP và dicyclohexyl carbodiimid (DCC)

Sơ đổ phản ứng:

Ngày nay, từ DHA ngoài artesunat người ta còn có thể bán tổng hợp ra nhiều chất khác có hoạt lực tác dụng tương tự như artesunat như arteether (AE) và arteether (AM) bằng cách cho DHA tác dụng vơi ethanol hoặc methanol với xúc tác là acid Lewis, AE và AM lại tan tốt trong dầu và cũng có hoạt tính chống sốt rét ngang với artesunat [15]

artemether arteether

Ngoài tạo DHA, AE, AM, artesunat từ artemisinin ngày nay người ta còn tạo ra một dẫn chất mới có hoạt lực cao trên ký sinh trùng sốt rét đó là: acid artelinic Chất này vừa có hiệu lực cao hơn artemisinin lẫn AM hơn nữa muối Naphten của nó lại tan được trong nước nên có thể chế được cả thuốc tiêm lẫn thuốc viên [4]

1.2.3 Tính chất của artesunat [7], [35]

Tinh thể không màu hay bột kết tinh màu trắng, không mùi, không vị, dễ tan trong ethanol, aceton, cloroíom, benzen, khó tan trong nước, kém bền vững trong môi trường acid hay kiềm Dạng muối Na của nó dễ tan trong nước, do vậy có thể dùng để pha thuốc tiêm

Năng suất quay cực của artesunat: [a|)5= (+10°) đến (+14°)

1.2.4 Cơ chế tác dụng

Qua nghiên cứu lâm sàng người ta thấy rằng tác dụng điều trị sốt rét của artesunat mạnh gấp 5,2 lần artemisinin Thuốc có tác dụng mạnh trên cả ký sinh trùng đã kháng Cloroquin, Meíloquin, Fansidar [21] Thuốc có tác dụng tốt đối với sốt rét ác tính và thể não

Theo Gu và cộng sự, tác dụng diệt ký sinh trùng của artesunat là do cầu peroxyd nội phân tử đã tạo ra các gốc tự do của oxi, các gốc tự do này đã tấn công vào những thành phần cơ bản trong tế bào của ký sinh trùng và tiêu diệt

nó Chính vì vậy nên khi cầu nối peroxyd bị phá hủy thì thuốc không còn tác dụng, cơ chế này khác hẳn với các thuốc tổng hợp trước đây Bằng phương

pháp đánh dấu dùng Triti, các nhà khoa học nhận thấy rằng nồng độ thuốc ở hồng cầu nhiễm Plasmodium cao hơn hẳn so với hồng cầu bình thường, cơ chế

cụ thể là artesunat tấn công vào màng Plasmodium

Artesunat ức chế hoạt tính của cytorom oxydase và hệ vận chuyển — glutamin trong hồng cầu ở pH cao artesunat tạo ra tức thì các dạng oxi hoạt động

Các loại thuốc như miconazol có tác dụng làm tăng hiệu lực của artesunat còn các chất chống oxi hóa như acid ascorbic, glutathion, vitamin

E , lại làm giảm hoạt tính của artesunat [10]

1.2.5 Dược đông học

Artesunat dùng theo đường uống được hấp thu từ 24 - 64%, thời gian bán thải t1/2=41 phút Thuốc bị giảm hoạt tính do bị chuyển hóa tại gan, thuốc qua được hàng rào máu - thai nhi nên tránh dùng thuốc cho phụ nữ có thai Artesunat thải trừ qua đường nước tiểu, các chất được thải trừ bao gồm: deoxy artemisinin, dihydro deoxy artemisinin

1.2.6 Độc tính

Được thử tại bộ môn Dược lý Đại học Y Hà Nội [6]

Độc tính cấp: LD50 trên chuột nhắt = 1200 [1081-1331] mg/kg bằng đườnguống

Khi cho chuột nhắt trắng uống artesunat liều 4mg/g thể trọng trong 5 ngày liền không thấy hình ảnh tổn thương cấu trúc tế bào ở mô gan và thận, cấu trúc chung của gan và thận không thay đổi, có hiện tượng xung huyết các mạch trong thận

Độc tính bán cấp: cho thỏ uống qua xông vào dạ dày dung dịch natri artesunat 2ml/kg/24h với liều 20mg/kg/24h vào giờ nhất định trong ngày, cho uống liên tục trong 30 ngày chưa thấy có độc tính bán cấp

Về khả năng gây đột biến của artesunat được thử tại bộ môn Dược lý, trường Đại học Y Hà Nội cho thấy rằng: artesunat không làm tăng tần số rối

loạn nhiễm sắc thể ở tế bào tủy xương hoặc tế bào tinh hoàn, không làm xuất hiện các rối loạn nhiễm sắc thể, không gây nên các rối loạn về sinh sản Các chuột con được đẻ ra không có dị tật bẩm sinh: Quan sát được cả ở F1 và F2

số lượng cũng như trọng lượng của chuột con được đẻ ra bình thường, khi

chuột chửa uống artesunat không gây nên bất thường ở thế hệ con.

Năm 1994, Viện Y học lâm sàng các bệnh nhiệt đới đã tiến hành thí nghiệm artesunat trên người khỏe mạnh trên bệnh nhân nhiễm p.falciparum không biến chứng [6] Kết quả khi thử trên người khỏe mạnh không có sự thay đổi về huyết học, sinh hóa, điện tim trước và sau khi thử Tại chỗ tiêm không

có phản ứng, không đỏ, không mẫn ngứa Thuốc khuyếch tán nhanh, dấu hiệu chủ quan: người tình nguyện không thấy có cảm giác gì đặc biệt sau khi tiêm.Đối với bệnh nhân nhiễm p.íalciparum không biến chứng, thấy rằng thuốc có hiệu quả điều trị mọi đối tượng (cả người lớn và trẻ em) có tác dụng mạnh đối với ký sinh trùng sốt rét, làm giảm nhanh mật độ ký sinh trùng (đa

số trong vòng 24h đầu), cắt cơn sốt nhanh, ngăn chặn được sốt rét nặng Thuốc không ảnh hưởng tới chức năng gan, thận, huyết học, không ảnh hưởng

1.3 Các phương pháp định lượng artesunat nguyên liệu

1.3.1 Phương pháp đo quang phổ hấp thu vùng tử ngoại [1 ]

Bản thân artesunat chỉ hấp thụ ánh sáng ở vùng tử ngoại có bước sóng ngắn, sau khi đun nóng trong môi trường kiềm artesunat chuyển thành Q289

là sản phẩm có độ hấp thụ cực đại ở bước sóng 289nm do đó có thể định lượng artesunat trong chế phẩm và nguyên liệu bằng phương pháp đo độ hấp thụ của artesunat (sau khi đun nóng trong môi trường kiềm) trên máy đo quang phổ ở bước sóng 289nm Artesunat sau khi đun nóng trong môi trường kiềm tạo thành sản phẩm sau [31], [37]:

o c o c h 2c h 2c o o h

Nhận xét:

- Phương pháp có trong TCN và nhiều tiêu chuẩn cơ sở

- Phương pháp định lượng dễ thực hiện, trang thiết bị dễ định lượng các

cơ sở đều có thể có được

- Sản phẩm đo quang không phải trực tiếp là artesunat mà là sản phẩm của chuyển hóa của nó trong môi trường kiềm - Q289 Theo Nguyễn Mạnh Cường [5], điều kiện áp dụng là phải khống chế được lượng dihydro artemisinin trong chế phẩm, khi đó phép định lượng mới có kết quả đúng Tuy nhiên trong chế phẩm viên nén khó có thể khống chế được lượng dihydro artemisinin

1.3.2 Phương pháp HPLC với detector u v

Định lượng artesunat với pha động là acetonitril - đệm phophat pH=5,l (tỷ lệ 38:62) [23] hoặc với pha động acetonitril-đệm acetat pH=5,5 (tỷ lệ 1:1)

[22], bước sóng phát hiện là 235nm Hoặc để định lượng artesunat trong dược liệu, trong các dịch sinh vật người ta đã sử dụng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao với chương trình sắc ký cột Lichrosorb Rp 60 - 5àm, 125x4 mm, pha động: 48% CH3CN+31% dung dịch KH2P 0 4 0,05M trong nước + 20% nước, tốc độ dòng lml/phút, detector u v 210nm và thể tích tiêm 20//1, với chương trình chạy sắc ký trên, artesunat có tR=2,1 phút [30].

Nhận xét:

Artesunat chỉ hấp thụ ánh sáng tử ngoại ở vùng bước sóng ngắn, trong phương pháp định lượng này, bước sóng phát hiện là 235nm, sản phẩm định lượng có thể không phải là artesunat nên DHA (nếu có) có thể sẽ ảnh hưởng tới kết quả định lượng

1.3.3 Phương pháp HPLC với detector khúc xạ k ế [38]

Định lượng artesunat với pha tĩnh là cột RP18 (12,5x3,5 mm), cỡ hạt

5 ịi m, pha động là acetonitril - đệm pH=3 (dung dịch đệm pH3: l,36g KH2P 0 4

trong lOOOml HaO, điều chỉnh pH tới 3 bằng H3P 04) với tỷ lệ 1:1 Tốc độ

dòng 0,6ml/phút, nồng độ dung dịch mẫu 4mg/l ml, thể tích tiêm mẫu 20 ụ 1,

detector khúc xạ kế

1.3.4 Phương pháp HPLC với detector điện hóa [32], [33]

Dựa trên nguyên tắc: trong phân tử artemisinin và các dẫn xuất của nó chứa cầu nối peroxyd nội phân tử, cầu nối này quyết định tác dụng điều trị sốt rét của chúng đồng thời chính sự có mặt của cầu nối peroxyd mà người ta đã

sử dụng phương pháp HPLC với detector điện hóa để định lượng artesunat Quá trình xảy ra trên bề mặt điện cực được mô tả như sau:

Nhận xét:

Phương pháp này có độ nhạy, tính đặc hiệu cao nên thích hợp trong việc định lượng với hàm lượng nhỏ như trong dịch sinh vật, tuy nhiên phương pháp

HPLC với detector điện hóa không phải là cơ sở nào cũng có được.

1.3.5 Phương pháp đo kiềm trong môi trường nước

Vì artesunat là este của acid succinic và dihydro artemisinin nên trong phân tử còn một nhóm chức acid tự do, do đó người ta có thể định lượng trực tiếp nhóm chức này bằng NaOH 0,05% với chỉ thị phenolphtalein từ đó suy ra hàm lượng artesunat hoặc có thể định lượng artesunat bằng phương pháp chuẩn độ gián tiếp Cho artesunat tác dụng với một lượng dư KOH rồi chuẩn

độ KOH dư bằng dung dịch chuẩn acid [5]

Nhận xét: Theo Nguyễn Mạnh Cường [5]

- Phương pháp chuẩn độ trực tiếp chỉ áp dụng khi acid succinic tự do trong chế phẩm < 0,2%, do đó khó có thể áp dụng cho định lượng viên nén

- Phương pháp chuẩn độ gián tiếp là phương pháp chính xác, đúng, đặc hiệu, ít phụ thuộc vào sự có mặt của tạp chất, dễ thực hiện Tuy nhiên, phương pháp này mới chỉ được nghiên cứu áp dụng cho định lượng nguyên liệu artesunat, muốn áp dụng phương pháp này trong định lượng các dạng bào chế artesunat thì cần được nghiên cứu

1.3.6 Phương pháp đo kiềm trong môi trường khan [38]

tt

Cũng dựa vào nhóm chức acid tự do còn lại trong phân tử artesunat để tiến hành định lượng Chế phẩm (khoảng 0,20g) được hòa tan trong ethanol

tuyệt đối (50ml) Chuẩn độ bằng dung dịch tetrabutylammonium hydroxide trong 2-propanol (0,lmol/l) Điểm kết thúc của phép định lượng được xác định bằng chỉ thị tím tinh thể trong acid acetic khan hoặc bằng kỹ thuật chuẩn độ đến điểm dừng.

1.3.7 Phương pháp đo phổ hấp thụ vùng khả kiến dưới dạng muối hydrxamat sắt [9]

Cho artesunat tác dụng với dung dịch hydroxylamin hydroclorid trong môi trường kiềm Trung hòa rồi acid hóa dung dịch bằng acid hydrocloric và cho phản ứng với dung dịch sắt (III) clorid sản phẩm tạo thành có màu tím

đỏ Tiến hành đo mật độ quang của dung dịch này

1.3.8 Các phương pháp định lượng khác

Cầu nối peroxyd nội phân tử của artemisinin và artesunat còn thể hiện sự đáp ứng trên điện cực giọt thủy ngân nên người ta còn dùng phương pháp cực phổ để định lượng Ngoài ra, phương pháp cực phổ xung và phân tích phóng

xạ miễn dịch đã được áp dụng để định lượng artemisinin và các dẫn xuất của

nó Các nhà khoa học Trung Quốc còn miêu tả hai phương pháp khác để định lượng artemisinin và các dẫn xuất của nó trong mẫu thử sinh học [26]:

- Phương pháp đo độ phóng xạ: sau khi uống thuốc đã được đánh dấu bằng Tritium

- Phương pháp phân tích đo mật độ quang trên sắc ký lớp mỏng

1.4 Các phương pháp định lượng artesunat trong viên nén đang áp dụng ở nước ta [2], [3]

1.4.1 Phương pháp quang phổ

Cân chính xác một lượng bột viên tương ứng với khoảng 60mg artesunat cho vào bình định mức 50ml, thêm 40ml ethanol tuyệt đối và lắc kỹ cho tan hết hoạt chất, thêm ethanol tới vạch, lắc đều, lọc bỏ dung dịch đầu Hút chính

xác 5ml dung dịch lọc vào bình định mức 50ml, thêm dung dich natri

hydroxyl 0,1N đến vạch, lắc đều rồi để trong cách thủy nhiệt độ 50°c ± l°c

trong 1 giờ Làm nguội nhanh ở nhiệt độ phòng, đo độ hấp thụ của dung dịch này ở bước sóng 289 ± lnm trong vòng 20 phút kể từ lúc lấy ra khỏi nồi cách thủy, cốc đo dầy lcm, mẫu trắng là dung dịch natri hydroxyl 0,1N

Dung dịch chuẩn: Cân chính xác khoảng 60 mg chuẩn artesunat vào bình định mức 50ml, tiến hành mẫu thử

Hàm lượng % artesunat trong viên so với nhãn được tính bằng công thức sau:

x(% ) xl00

Dc M t. 0,1Trong đó:

Dt và Dc là độ hấp thụ của dung dịch thử và dung dịch chuẩn

Mc và Mt là lượng cân (mg) của artesunat chuẩn và lượng bột viên đem định lượng

mtb là khối lượng trung bình của viên

1.4.2 Phương pháp đo kiềm trong môi trường nước

Cân chính xác một lượng bột viên tương ứng với 0,150g artesunat vào bình nón lOOml, hòa tan ethanol tuyệt đối đã được trung tính với chỉ thị phenolphtalein và lắc kỹ Thêm hai giọt chỉ thị phenolphtalein và chuẩn độ bằng dung dịch natri hydroxyd 0,05N đến khi xuất hiện màu hồng nhạt

lml dung dịch natri hydroxyd 0,05N tương ứng với 19,22mg artesunat

1.5 Nhận xét và lựa chọn

tính đúng và tính đặc hiệu cao, song hiện nay ở Việt Nam vẫn con chưa áp

- Các phương pháp HPLC với detector 235nm đến 253nm có thể không phải trực tiếp định lượng artesunat nên sản phẩm phân hủy có thể ảnh hưởng tới kết quả.

- Phương pháp đo quang phổ tử ngoại ở 289nm thực tế cũng không thể đánh giá chính xác được khi artesunat đã bị phân huỷ hoặc khi lẫn các tạp chất khác, bởi sản phẩm phân hủy của chúng cũng hấp thụ vùng tử ngoại do đó dẫn đến sai số

- Phương pháp đo kiềm tại chỗ cho kết quả đúng khi artesunat chưa bị thủyphân

- Do artesunat chỉ hấp thụ ở bước sóng ngắn nên trong đề tài này chúng

tôi nghiên cứu, xây dựng quy trình kỹ thuật mới để định lượng nguyên liệu artesunat bằng phương pháp HPLC mà không bị ảnh hưởng bởi DHA và acid succinic nhằm tăng tính đặc hiệu của nó, từ đó có thể áp dụng trong việc định lượng artesunat trong các chế phẩm (do dưới dạng bào chế, artesunat thường

1.6 Phương pháp HPLC [8],[14],[25],[29],[34],[35]

1.6.1 Nguyên tắc

HPLC là phương pháp phân tích sử dụng kỹ thuật tách các chất trong hỗn hợp dựa vào ái lực giữa các chất với hai pha: pha tĩnh (cột hiệu năng cao) và pha động (dung môi rửa giải) Khi dung dịch của hỗn hợp các chất cần phân tích được đưa vào cột chúng sẽ được hấp phụ hoặc liên kết với pha tĩnh tuỳ thuộc vào bản chất của cột và của chất cần phân tích Khi ta bơm dung môi

pha, chúng sẽ di chuyển qua cột với vận tốc khác nhau dẫn đến sự phân tách

Các chất sau khi ra khỏi cột sẽ được phát hiện bởi dertector và được

thị trên màn hình

1.6.2 Co sở lý thuyết

Quá trình phân tách trong kỹ thuật HPLC là do quá trình vận chuyển và phân bố của các chất tan giữa hai pha khác nhau Khi pha động di chuyển với một tốc độ nhất định qua cột sắc ký sẽ đẩy các chất tan bị pha tĩnh lưu giữ ra khỏi cột Tuỳ theo bản chất của pha tĩnh, bản chất tan và dung môi mà quá trình rửa giải tách được các chất khi ra khỏi cột sắc ký Nếu ghi quá trình tách sắc ký của hỗn hợp nhiều thành phần, chung ta có một sắc ký đồ gồm nhiều pic Nếu quá trình tác sắc ký tốt, thì hỗn hợp mẫu có bao nhiêu chất sẽ có bấy nhiêu pic riêng biệt trên sắc ký đồ

Ngày nay phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao được ứng dụng ngày càng rộng rãi trong các ngành phân tích Trong kiểm nghiệm thuốc, HPLC là phương pháp đầu tay để phân tích các thuốc đa thành phần nhờ khả năng phân tách các chất với hiệu năng cao của cột và dung môi pha động, khả năng phát hiện các chất rất nhạy về định tính và định lượng của các loại Detector

1.6.3 Nguyên tắc cấu tạo của hệ thống máy sắc ký HPLC

Để thực hiện việc tách bằng kỹ thuật HPLC, chúng ta phải có các hệ thống trang bị về kỹ thuật này Hệ thống HPLC đơn giản và đủ để làm việc được theo kỹ thuật HPLC bao gồm 5 bộ phận chính sau đây:

1 Bơm cao áp để bơm pha động vào cột tách thực hiện quá trình sắc ký Bơm này phải điều chỉnh được áp suất (0 - 400 bar) để tạo ra được những tốc

độ dòng nhất định của pha động qua cột phù hợp với quá trình sắc ký

2 Van bơm mẫu để bơm mẫu phân tích vào cột tách theo những lượng mẫu nhất định không đổi trong một quá trình sắc ký Đó là các van 6 chiều có

chứa vòng mẫu thể tích 20, 50 hay 100 ụ\.

3 Cột tách: Là cột chứa pha tĩnh, là trái tim của quá trình sắc ký, nó là yếu tố quyết định dự tách một hỗn hợp mẫu Cột tách có nhiều cỡ khác nhau

tuỳ thuộc vào mức độ sắc ký Nói chung, các cột phân tích thường có chiều dài từ 10 - 25 cm; đường kính trong từ 2 - 5 mm

4 Trang bị phát hiện chất phân tích: Đây là các Detector dựa theo các tính chất của chất phân tích, ví dụ như :

+ Detector hấp thụ quang phân tử

+ Detector phổ nguyên tử

+ Detector huỳnh quang

+ Detector điện hoá (đo dòng, cực phổ, độ dẫn, điện lượng)

+ Detector chiết suất

+ Detector đo độ dẫn nhiệt

Tuỳ thuộc theo chất phân tích mà chọn loại Detector nào cho phù hợp để đạt được độ nhạy cao khi phát hiện các chất Trong các loại trên thì Detector hấp thụ quang phân tử hiện nay đang được dùng phổ biến nhất

5 Trang bị chỉ thị kết quả ở đây có nhiều loại, nhưng đơn giản và phổ biến nhất là máy tự ghi (recorder) để ghi tín hiệu đo dưới dạng pic

Đó là 5 bộ phận cần thiết tối thiểu phải có của một hệ thống HPLC

Hình 2 Sơ đồ khối hệ thống HPLC hoàn chỉnh

+ t0 (Thời gian chết): là thời gian cần thiết để pha động chảy qua

hệ thống sắc ký

+ tR’(Thời gian lưu thực) = tR - 10

+ Wb (Độ rộng ở đáy píc)Thời gian lưu là thông tin về mặt định tính của sắc đồ, nó là một hằng số đối với một chất nhất định khi tiến hành sắc ký trong điều kiện không đổi

a khác 1 càng nhiều thì thì khả năng tách càng rõ ràng, tối ưu từ 1,5 - 2

* Độ phân giải: Để đặc trưng cho mức độ tách của hai chất ra khỏi nhau trên một điều kiện sắc ký đã người ta thường sử dụng độ phân giải R giữa hai pic cạnh nhau Độ phân giải giữa hai pic (picl và pic2) được tính theo công thức sau:

~^Rl) _ — t j Ị t )

~ K l +^,2~K,5,+K,5.2

Trong thực tế: R= 0,75 hai pic không tách tốt còn xen phủ nhau nhiều

R= 1,0 hai pic tách khá tốt còn xen phủ nhau 4%.

R= 1,5 hai pic tách gần hoàn toàn, chỉ xen phủ nhau 0,3%

* Số đĩa lý thuyết: Để đặc trưng cho hiệu lực của cột người ta sử dụng

số đĩa lý thuyết (N) và chiều cao của đĩa (H):

WB wỵ2_

Trong đó:

+ WB là chiều rộng ở đáy pic

+ W1/2 là chiều rộng ở nửa chiều cao của pic

Nếu gọi L là chiều cao của cột sắc ký, thì chiều cao của đĩa lý thuyết

* Hệ số bất đối xứng F:

„ w

F = —

2 a

ở đây : w là độ rộng pic đo ở 1/20 chiều cao pic

a là khoảng cách từ đường vuông góc hạ từ đỉnh pic đến mép đường cong phía trước tại vị trí 1/20 chiều cao pic

Điều kiện đối với pha tinh :

+ Phải trơ và bền vững với các điều kiện của môi trường sắc ký.+ Có khả năng tách chọn lọc một hỗn hợp chất tan trong những điều kiện sắc ký nhất định

+ Tính chất bề mặt phải ổn định

+ Cân bằng động học của sự tách phải xảy ra nhanh và lặp lại tốt + Cỡ hạt phải tương đối đồng nhất

> Chế tạo pha tĩnh

Pha tinh thuờng đuợc chế tạo trên các nền sau :

• Pha tĩnh trên nền Silica (Si02)

• Pha tĩnh trên nền oxyt nhôm (A120 3)

• Pha tĩnh trên nền cao phân tử hữu cơ (cellulose)

• Pha tĩnh trên nền mạch carbon

Pha tinh trên nền silica có nhiều uu việt hon và đuợc sử dụng nhiều nhất

Đó là silica trung tính, silica đã alkyl hoá để tạo ra các chất nhồi cho sắc ký