Xác định hàm lượng tạp acid succinic khi định lượng artesunat nguyên liệu bằng phương pháp HPLC

BỘ YTÌ TRƯỜNG ĐẠI HỌC Dược HÂ NỘI ĐỖ ĐỈNH HẢI XẤC BỊNH HÀM LIIDNe TẠP ACID SUCCINIC KHI ĐỊNH Linme ARTESUNAT NBUYÊN LIỆU BẰNG PHưUNG PHẮP HPLC (KHỐA LUẬN TỐT NGHIỆP Dược sĩ KHOĂ 2001- 2006) Người hướng dẫn: PGS.TS. Trần Đức Hậu Th.s Trần Thị Lan Hương Nơi thực hiện: Bộ môn Hóa dược ■ ■ Trường Đại học Dược Hà Nội Thời gian thực hiện: Tháng 2 - 5/2006. /V HẰ NỘI - T5/2006 LỜI CẢM ƠN Trước hết, cho phép tôi được bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc và chân thành nhất tới những người thầy đã tận tình chỉ bảo, hướng dẫn, giúp đỡ tôi hoàn thành khoá luận này: PGS.TS.Trần Đức Hậu, Chủ nhiệm bộ môn Hoá dược. Th.S.Trần Thị Lan Hương, Giảng viên bộ môn Hoá dược. Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn chân thành tới các thầy cô, cán bộ của bộ môn Hoá dược đã giúp đỡ, động viên tôi hoàn thành khoá luận này. Xin được cảm ơn sự giúp đỡ của các thầy cô, các cán bộ bộ môn Hoá phân tích, Hoá vô cơ. Cuối cùng xin cảm otti gia đình, bạn bè đã luôn giúp đỡ, động viên, khích lệ tôi trong thời gian qua. Hà nội, tháng 5 năm 2006 Sinh viên : Đỗ Đình Hải MỤC LỤC Danh mục các chữ viết tắt ĐẶT VÂN ĐỂ 1 PHẦN 1: TỔNG QUAN 3 1.1. Tổng quan về artesunat 3 1.2. Tổng quan về tạp acid succinic trong artesunat nguyên liệu 5 1.3. Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) 8 PHẦN 2; THỰC NGHIỆM VÀ KÊT QUẢ 19 2.1. Đối tượng, thiết bị, hoá chất, nội dung và phương pháp nghiên cứu 19 2.2. Thực nghiệm và kết quả 21 2.2.1. Xác định hàm lượng acid succinic trong artesunat nguyên liệu 21 2.2.1.1. Phương pháp định lượng acid succinic khi định lượng artesunat bằng HPLC 21 2.2.1.2. Thử tính tích hợp của hệ thống 21 2.2.2. Đánh giá phương pháp định lượng 23 2.2.2.1. Đánh giá tính tuyến tính của phưcfng pháp 23 2.22.2. Đánh giá độ lặp lại của phương pháp 24 2.2.2.3. Đánh giá tính đúng của phương pháp 25 2.2.2.4. Tính đặc hiệu của phương pháp 28 21.25. Xác định giới hạn định lượng acid succinic theo phương pháp xây dựng 31 2.2.2.Ỏ. Xây dựng cách xác định acid succinic trong arthesunat khi không có acid succinic chuẩn 32 2.2.3. Kết quả 35 PHẦN 3: KẾT LUẬN VÀ ĐÊ XUẤT 38 3.1. Kết luận 38 3.2. Đề xuất 38 TÀI LIỆU THAM KHẢO CHỮ VIẾT TẮT DHA Dihydro artemisinin Ds Dược sỹ HPLC High performance liquid chromatography Sắc ký lỏng hiệu năng cao LOD Limit of detection : Giới hạn phát hiện LOQ Limit of quantification : Giới hạn định lượng NXB : Nhà xuất bản PA : Tinh khiết phân tích ĐẶT VẤN ĐỂ Sốt rét là một bệnh nguy hiểm mang tính xã hội. Điều đáng lo ngại là việc điều trị sốt rét ngày càng trở nên khó khăn do ký sinh trùng sốt rét đã và đang kháng với các loại thuốc điều trị sốt rét kinh điển như: Cloroquin, Mefloquin, Primaquin [13]. Vào năm 1972, các nhà khoa học Trung Quốc đã chiết xuất được artemisinin từ cây Thanh hao hoa vàng. Artemisinin có hiệu lực điều trị sốt rét nhanh, mạnh trên các bệnh nhân bị sốt rét do nhiễm chủng p. falciparum kháng thuốc và sốt rét thể não [7]. Tuy nhiên, artemisinin có hạn chế là: khả năng hoà tan kém, tỷ lệ tái phát sau khi dùng còn cao. Để khắc phục những hạn chế này người ta đã bán tổng hợp ra artesunat với ưu điểm có hoạt lực điều trị mạnh hơn, lại dễ tan hơn artemisinin. Hiện nay aitesunat được sử dụng rộng rãi và là một trong những niềm hy vọng lớn của con người trong cuộc chiến chống lại sốt rét. Cùng với sự gia tăng nhu cầu sử dụng artesunat, việc kiểm tra chất lượng aitesunat trong nguyên liệu và thành phẩm là rất cần thiết. DHA và acid succinic là 2 tạp thường gặp nhất trong artesunat do quá trình sản xuất và bảo quản. Các tạp chất này làm giảm chất lượng thuốc, giảm hiệu lực điều trị và ảnh hưởng tới kết quả định lượng artesunat. Theo các phưoỉng pháp định lượng artesunat đang áp dụng ở Việt Nam, khi trong chế phẩm cần định lượng có lẫn 1% acid succinic thì kết quả định lượng theo phương pháp ghi trong tiêu chuẩn cơ sở tăng khoảng 6,5%. Khi trong chế phẩm cần định lượng có lẫn 1% DHA thì kết quả định lượng theo phương pháp ghi trong tiêu chuẩn Dược điển Việt Nam III tăng khoảng 1,4% [4]. Vì vậy việc xác định hàm lượng các tạp chất này là rất quan trọng. Trong đề tài này, chúng tôi đã tiến hành nghiên cứu “ Xác định hàm lượng tạp acid succinic khi định lượng artesunat nguyên liệu bằng phương pháp HPLC” nhằm đạt hai mục tiêu chính: 1. Dựa trên phương pháp định lượng artesunat bằng phương pháp HPLC, xác định hàm lượng acỉd succỉnỉc trong nguyên liệu artesunat khi có hoặc không có acỉd succỉnỉc chuẩn. 2. Đánh giá phương pháp định lượng acid succinic bằng HPLC dưới dạng tạp chất theo các chỉ tiêu của một phương pháp định lượng. PHẦN 1: TỔNG QUAN 1.1. TỔNG QUAN VỂ ARTESUNAT 1.1.1. Một số tính chất của artesunat - Công thức hoá học [2]: - Công thức phân tử: ^19^2808' - Khối lượng phân tử: 384,43. -Tên khoa học: (3R,5aS,6R,8aS,9R,10S,12R,12aR)-decahydro-3,6,9-trimethyl-3,12- epoxy-pyrano[4,3-j]l»2-benzodioxepin-10-ol, hydrogen succinat. -Tên khác: acid artesunic, Dihydro artemisinin -lOa - hemisuccinat. - Tính chất: Tinh thể không màu hay bột kết tinh trắng, không mùi, rất khó tan trong nước, rất dễ tan trong dicloromethan, dễ tan trong ethanol, methanol và aceton [2]. Điểm chảy: 142®c đến 145°c. Góc quay cực riêng: = +2,5° đến +3,5° (dung dịch artesunat trong dicloromethan). Hỗn dịch 1% trong nước có pH từ 3,5 đến 4,5 [21]. 1.1.2. Nguồn gốc, cách điều chế + Nguồn gốci Artemisinin phân lập từ cây Thanh hao hoa vàng có tác dụng tốt trong điều trị sốt rét kể cả chủng đã kháng Cloroquin. Tuy vậy, artemisinin khó tan và điều trị bằng artemisinin tái phát sớm mặc dù bệnh nhân sạch ký sinh trùng trong máu. Để khắc phục nhược điểm này người ta đã bán tổng hợp ra các dẫn chất của artemisinin, trong đó đáng chú ý là artesunat có tác dụng tốt, tan trong dung dịch kiềm dùng để pha thuốc tiêm, điều trị bằng artesunat ít bị tái phát và vì vậy được dùng phổ biến hơn cả. + Điều chế: Trên cơ sở phương pháp của các nhà khoa học Trung Quốc, D. L. Klayman, p. Brossi và cộng sự, Đỗ Hữu Nghị và cộng sự tại trường Đại học Dược Hà Nội đã nghiên cứu và đưa ra phương pháp tổng hợp artesunat qua hai giai đoạn với hiệu suất cao [12]: Giai đoạn 1: - Bán tổng hợp dihydroartemisinin (DHA): Khử hoá artemisinin thành DHA bằng các chất khử khác nhau, thường dùng là natri borohydrid (NaBH4) trong môi trường methanol, ở nhiệt độ thấp (0°c - 5°C). NaBH. MeOH 0-5®C Artemisinin Giai đoạn 2: - Ester hoá DHA bằng acid succinic hoặc anhydrid succinic hoặc succinyl clorid với sự có mặt của chất xúc tác (dimethylamino pyridin - DMAP, hay hỗn hợp DMAP và dicyclohecxyl carbodiimid - DCC) được aitesunat. COOH L ch , r i H2 OOH DMAP DCC o - c — CHo—CHo-COOH I DHA Artesunat Từ công thức cấu tạo và phưoỉng pháp điều chế trên có thể thấy tạp chất chính có trong artesunat nguyên liệu là: DHA và acid succinic. 1.1.3. Tác dụng, chỉ định -Tác dụng: Artesunat có tác dụng diệt thể phân liệt trong máu của mọi chủng ký sinh trùng sốt rét, đặc biệt tốt với sốt rét thể não do p. falciparum, không diệt thể giao bào và không tác dụng trên giai đoạn ngoại hồng cầu, cắt cơn sốt nhanh. Thuốc có tác dụng mạnh trên cả ký sinh trùng đã kháng Cloroquin, Mefloquin, Fansidar [7]. - Chỉ định: Phòng và điều trị sốt rét do p. falciparum, p. vivax, p. malariae kể cả sốt rét do p. falciparum đã kháng thuốc khác [7], [9]. 1.2. TỔNG QUAN VỂ TẠP ACID SUCCINIC TRONG ARTESUNAT NGUYÊN LIỆU 1.2.1. Một số tính chất hoá lý của acid succinic - Công thức: [...]... ký ca hn hp acid succinic, DHA v artesunat 30 phõn gii gia cỏc pic acid succinic, DHA v artesunat c ghi trong bng 2.5 Bng 2.5: phõn gii gia cỏc pic acid succinic, artesunat v DHA Cht Thi gian lu phõn gii Rs Acid succinic 2,710 2,33 Artesunat 4,350 2,44 DHA 12,550 6,04 Kt qu kho sỏt cho thy phng phỏp nh lng acid succinic trong artesunat nguyờn liu do chỳng tụi xõy dng cú tớnh c hiu cao Artesunat v... succinic 0,1 M C pH = 2,7 [18] ể 1.2.2 Nguyờn nhõn gõy ra tp acid succinic trong artesunat Acid succinic l mt trong hai thnh phn dựng tng hp nờn artesunat, mt khỏc artesunat l ester ca acid succinic v DHA nờn nguyờn nhõn chớnh gõy ra tp acid succinic trong artesunat nguyờn liu l: - Tinh ch cha tt trong quỏ trỡnh sn xut - Do s phõn hu ca artesunat trong quỏ trỡnh bo qun 1.2.3 Mt sụ phng phỏp xỏc nh... aitesunat 2 mg/ml) cú s ph thuc tuyn tớnh gia nng dung dch v din tớch pic ca acid succinic 2.22.2 nh giỏ lp li ca phng phỏp Xỏc nh nng lm vic ca acid succinic l 0,012 mg/ml (0,6% so vi artesunat nguyờn liu) Tin hnh: Pha 6 mu th acid succinic nng 0,6% so vi nguyờn liu, ng thi lm mu chun acid succinic tng ng Cỏch pha: Cõn lng acid succinic chớnh xỏc khong 10,0 mg ri pha trong bỡnh nh mc 25 ml, ly chớnh... phỏp nh lng acid succinic trong artesunat nguyờn liu m s cú mt ca artesunat cng nh cỏc tp cht (cú th cú) khụng nh hng ti kt qu nh lng kho sỏt tớnh c hiu ca phng phỏp chỳng tụi tin hnh nh sau: Pha dung dch acid succinic 5%: Cõn chớnh xỏc khong 10,0 mg acid succinic, cho vo bỡnh nh mc 20 ml Thờm hn hp dung mụi Me0 H/H20 vo ho tan hon ton acid succinic, thờm dung mụi cho th tớch Pha dung dch artesunat. .. c artesunat, acid succinic, DHA trong ú pic acid succinic cõn xng, gn, tỏch hon ton ra khi cỏc pic khỏc Do vy chỳng tụi ó chn chng trỡnh sc ký ny xỏc nh hm lng acid succinic trong artesunat nguyờn liu 2.2.1.2 Th tớnh thớch hp ca h thng Tớnh thớch hp ca h thng HPLC c biu th qua h s bt i xng v lch chun tng i (RSD%) cỏ 6 phộp th song song i vi thi gian lu v din tớch pic Cõn chớnh xỏc khong 15,0 mg acid. .. ti kt qu nh lng 2.2.2.S Xỏc nh giúi hn nh lng acid succinic theo phng phỏp xõy dng Gii hn nh lng ca acid succinic l nng thp nht ca acid succinic m ta cú th nh lng m bo tớnh ỳng v tớnh chớnh xỏc theo phcmg phỏp xõy dng Theo c tớnh gii hn nh lng acid succinic khong 0,025% so vi artesunat nguyờn liu nng 2 mg/ml Vỡ vy chỳng tụi tin hnh xỏc nh ỏp ng ca acid succinic 5 nng lin k ú l: 0,025% (0,0005 mg/ml);... 0.00001 '< 0 X i R ^=1 Lng acid succinic thờm (mg) Hỡnh 2.2: th ỏnh giỏ s tng quan gia lng acid succinic thờm vo v lng thu hi 2.2.2.4 Tớnh c hiu ca phng phỏp nh lng mt cht thỡ chỳng ta phi xỏc nh c cht ú trong s cú mt ca cỏc cht khỏc Nh trong trng hp nh lng acid succinic trong artesunat nguyờn liu, bn thõn artesunat cng nh cỏc tp cht khỏc cú th l tỏc nhõn nh hng ti kt qu nh lng acid succinic Do vy trong... lng artesunat bng HPLC, xỏc nh hm lng tp tp acid succinc trong artesunat nguyờn liu b ỏnh giỏ phng phỏp nh lng acid succinic di dng tp cht theo cỏc ch tiờu ca phng phỏp nh lng ỏnh giỏ tớnh thớch hp ca h thng ỏnh giỏ tớnh tuyn tớnh ỏnh giỏ tớnh ỳng ỏnh giỏ lp li, ỏnh giỏ tớnh c hiu Xỏc nh gii hn nh lng c Xỏc nh h sụ' bin i tớnh hm lng acid succinic trong artesunat nguyờn liu kh khụng cú acid. .. ta c dung dch artesunat 2 mg/ml cú 0,6% acid succinic Lc qua mng lc 0,45 y-m, dựng dch lc tiờm sc ký Tiờm 6 ln mu artesunat cú thờm acid succinic ó pha trờn vo h thng sc ký ó chy n nh vi pha ng 30 phỳt Tin hnh sc ký theo quy trỡnh ó chn Thi gian lu, din tớch pic v h s bt i ca pic acid succinic thu c trờn sc c ghi bng 2 1 Bng 2.1: Kt qu kho sỏt tớnh thớch hp ca h thng STT Pic acid succinic Thi gian... - X 100 X - Sai s chun: -sjn - Sai s tng i: ta(n-X) X 20 S100 - Khong tin cy: x X S- 2.2 THC NGHIM V KT QU 2.2.1 Xỏc nh hm ing acid succinic trong artesunat nguyờn liu 2.2.1.1 Phng phỏp nh lng acid succinic khi nh lng artesunat bngHPLC p dng phcng phỏp nh lng artesunat bng HPLC c xõy dng trong Lun vn Thc s Dc hc (2005) ca Trn Th Lan Hng [8 ]: iu kin sc ký: - Ct Nucleosil C18 (250 x4,6 mm), c ht 5 |am . “ Xác định hàm lượng tạp acid succinic khi định lượng artesunat nguyên liệu bằng phương pháp HPLC nhằm đạt hai mục tiêu chính: 1. Dựa trên phương pháp định lượng artesunat bằng phương pháp HPLC, . và phương pháp nghiên cứu 19 2.2. Thực nghiệm và kết quả 21 2.2.1. Xác định hàm lượng acid succinic trong artesunat nguyên liệu 21 2.2.1.1. Phương pháp định lượng acid succinic khi định lượng artesunat. pháp HPLC, xác định hàm lượng acỉd succỉnỉc trong nguyên liệu artesunat khi có hoặc không có acỉd succỉnỉc chuẩn. 2. Đánh giá phương pháp định lượng acid succinic bằng HPLC dưới dạng tạp chất