Xây dựng quy trình định lượng anthocyanin trong thực phẩm chức năng bằng phương pháp HPLC và HPTLC

DANH MỤC CÁC BẢNG TRONG LUẬN VĂN Bảng 1.1 Các phương pháp phân tích Anthocyanin 8 Bảng 2.2 Danh mục các pha động HPLC khảo sát 24 Bảng 2.3 Gradient hệ pha động HPTLC khảo sát 25 Bảng 3.2

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

ĐINH THỊ THÚY HƯƠNG

XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG ANTHOCYANIN TRONG THỰC PHẨM CHỨC NĂNG BẰNG PHƯƠNG PHÁP HPLC

VÀ HPTLC

LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC

HÀ NỘI 2014

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

ĐINH THỊ THÚY HƯƠNG

XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG ANTHOCYANIN TRONG THỰC PHẨM CHỨC NĂNG BẰNG PHƯƠNG PHÁP HPLC

VÀ HPTLC

LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC

CHUYÊN NGÀNH KIỂM NGHIỆM THUỐC – ĐỘC CHẤT

MÃ SỐ: 6072 04 10

Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS Nguyễn Tường Vy

NCS Cao Công Khánh

HÀ NỘI 2014

LỜI CẢM ƠN

Lời đầu tiên tôi xin bày tỏ lòng kính trọng và lời cảm ơn sâu sắc tới cô giáo PGS.TS Nguyễn Tường Vy, NCS Cao Công Khánh là những người đã trực tiếp ở bên hướng dẫn, động viên và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện luận văn

Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn tới toàn thể các anh chị ở labo Hóa độc thực phẩm - Viện kiểm nghiệm an toàn vệ sinh thực phẩm quốc gia, những người đã dìu dắt, hướng dẫn và đóng góp rất nhiều ý kiến quý báu giúp đỡ tôi hoàn thành luận văn này

Tôi xin cảm ơn các anh chị của nhóm tải báo đã giúp tôi rất nhiều trong việc tìm tài liệu tham khảo cho luận văn

Tôi xin chân thành cảm ơn Ban giám hiệu, phòng đào tạo sau đại học, các thầy cô đã tạo mọi điều kiện trong suốt quá trình học tập tại trường và thực hiện luận văn này

Cuối cùng tôi xin dành lời cảm ơn tới gia đình, người thân và bạn bè đã luôn ủng hộ, khích lệ tôi trong thời gian học tập và nghiên cứu vừa qua

Hà Nội, ngày 23 tháng 8 năm 2014

Học viên

Đinh Thị Thúy Hương

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN

DANH MỤC, CHỮ VIẾT TẮT TRONG KHÓA LUẬN

DANH MỤC CÁC BẢNG TRONG KHÓA LUẬN

DANH MỤC HÌNH VẼ TRONG KHÓA LUẬN

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 3

1.1 Tổng quan về thực phẩm chức năng 3

1.2 Tổng quan về anthocyanin 3

1.2.1 Cấu trúc anthocyanin 3

1.2.2 Tác dung của anthocyanin 5

1.2.3 Tính chất của Anthocyanin 7

1.2.4 Một số phương pháp phân tích anthocyanin 8

1.3 Tổng quan về HPTLC 10

1.3.1 Sắc ký lớp mỏng 10

1.3.2 HPTLC 12

1.4 Tổng quan về HPLC 14

1.4.1.Khái niệm chung 14

1.4.2 Một số khái niệm cơ bản trong sắc ký 14

1.4.3 Thiết bị sắc ký lỏng 16

1.5 Tổng quan về chiết pha rắn SPE 20

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 21

2.1 Đối tượng nghiên cứu 21

2.2 Nguyên vật liệu – thiết bị 21

2.2.1.Nguyên vật liệu 21

2.2.2 Thiết bị 22

2.3 Nội dung nghiên cứu 23

2.4 Phương pháp nghiên cứu 23

2.4.1 Khảo sát các điều kiện phân tích anthocyanin bằng HPLC 23

2.4.2 Khảo sát các điều kiện phân tích anthocyanin bằng HPTLC 25

2.4.3.Khảo sát điều kiện xử lý mẫu 26

2.4.4 Thẩm định quy trình 27

2.5 Phương pháp xử lý số liệu 27

CHƯƠNG 3: THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ 28

3.1.Lựa chọn điều kiện sắc ký để phân tích anthocyanin bằng HPLC 28

3.2 Thiết lập điều kiện sắc ký để phân tích Anthocyanin bằng HPTLC 31 3.3 Xây dựng quy trình xử lý mẫu 32

3.4 Thẩm định phương pháp 34

3.4.1 Tính chọn lọc, tính đặc hiệu 34

3.4.2 Tính thích hợp hệ thống 36

3.4.3 Khoảng tuyến tính 38

3.4.4 Giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng 33

3.4.5 Độ thu hồi của phương pháp 42

3.4.6 Độ lặp lại của phương pháp 44

3.5 Kết quả áp dụng phương pháp xác định Anthocyanin trong một số sản phẩm 46

CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN 48

4.1 Xây dựng quy trình kỹ thuật 48

4.1.1 Lựa chọn phương pháp 48

4.1.2 Điều kiện xử lý mẫu 48

4.1.3 Xây dựng phương pháp định lượng 50

4.1.4 Thẩm định phương pháp đã xây dựng 52

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 54

KẾT LUẬN 54

KIẾN NGHỊ 55 TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT TRONG LUẬN VĂN

AOAC (Association of Official Analytical Chemists) Hiệp hội các nhà hóa

phân tích chính thức PDA (Photodiod array detector) Detector mảng diod HPLC (high – performance liquid chromatography) Sắc ký lỏng hiệu năng cao

HPTLC (high – performance thin layer chromatography) Sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao

LOD (Limit of Detection) Giới hạn phát hiện

LOQ (Limit of quantification) Giới hạn định lượng RSD (Relative standard deviation) Độ lệch chuẩn tương đối

DANH MỤC CÁC BẢNG TRONG LUẬN VĂN

Bảng 1.1 Các phương pháp phân tích Anthocyanin 8

Bảng 2.2 Danh mục các pha động HPLC khảo sát 24 Bảng 2.3 Gradient hệ pha động HPTLC khảo sát 25

Bảng 3.2 Chương trình gradient của hệ pha động, 3 và 4 30 Bảng 3.3 Kết quả định lượng Anthocyanin trong mẫu bột Bilberry theo dung môi dùng để chiết mẫu 33 Bảng 3.4 Kết quả đánh giá độ thích hợp hệ thống với dung dịch

Bảng 3.8 Kết quả đánh giá độ tuyến tính của chất chuẩn bilberry 40

Bảng 3.9 Độ thu hồi của phương pháp HPLC với mẫu thực

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ VÀ ĐỒ THỊ TRONG LUẬN VĂN

Hình 1.1 Cấu trúc cơ bản của aglucon của anthocyanin 4

Hình 1.2 Sơ đồ khối của một máy sắc ký lỏng hiệu năng cao 16 Hình 3.1 Sắc ký đồ của dung dịch chuẩn Bilberry với hệ pha động 1 29 Hình 3.2 Sắc ký đồ dung dịch chuẩn bilberry với hệ pha động

Hình 3.12 Sắc ký đồ của mẫu thực phẩm chức năng không

chứa anthocyanin được thêm chuẩn cyanidin 36 Hình 3.13

Sắc ký đồ của mẫu thực phẩm chức năng không chứa anthocyanin được thêm chuẩn cyanidin trên HPTLC

36

Hình 3.14 Đường chuẩn dung dịch gốc Cyanidin chloride 39 Hình 3.15 Đường chuẩn dung dịch bilberry trên HPTLC 40 Hình 3.16 Sắc ký đồ dung dịch chuẩn cyanidin 0,5 µg/mL 41 Hình 3.17 Sắc ký đồ dung dịch chuẩn cyanidin 0,2 µg/mL 42

ĐẶT VẤN ĐỀ

Ngày nay cuộc sống ngày càng phát triển hiện đại, các bệnh về tim mạch, ung thư hiện đang rất phổ biến và có chiều hướng gia tăng nhanh Đời sống ngày càng phát triển, người dân cũng quan tâm đến sức khỏe của bản thân nhiều hơn Ở nước ta trong năm năm trở lại đây thực phẩm chức năng được đưa vào và sử dụng rất rộng rãi, tràn lan vì chúng được biết đến là những chế phẩm có thể sử dụng thường xuyên, lâu dài để phòng ngừa nguy

cơ gây bệnh, bổ dưỡng mà rất an toàn, ít hoặc hầu như không có tác dụng phụ đối với hầu hết các lứa tuổi Chính vì thế việc mọi người lựa chọn thực phẩm chức năng để phòng chống và bồi bổ sức khỏe rất nhiều Tuy nhiên không phải ai cũng hiểu tường tận về thực phẩm chức năng Đa số các thực phẩm chức năng có giá thành khá cao, và ở Việt Nam việc kiểm soát chất lượng sản phẩm này chưa chặt chẽ nên xảy ra nhiều bất cập như không có hoặc có rất ít hoạt chất dẫn đến việc sử dụng chúng không mang lại hiểu quả

Theo các nghiên cứu thì các hợp chất Anthocyanin có các hoạt tính rất tốt như: Chống viêm, xơ vữa động mạch, ức chế đông tụ tiểu cầu, chống ung thư, thúc đẩy hình thành cytokine điều hòa phản ứng miễn dịch, có hoạt tính chống oxy hóa rất mạnh Chính vì thế mà các thực phẩm chức năng chứa Anthocyanin được sản xuất ngày càng nhiều và đối tượng sử dụng cũng rất phong phú [4], [5], [11]

Trên thế giới có một số nghiên cứu về phương pháp xác định hàm lượng các chất thuộc nhóm Anthocyanin trên các mẫu thực phẩm bằng cách

sử dụng các kĩ thuật chính như: UV-VIS, HPLC-PDA, MS, ESI [16], [22], [24] Mỗi phương pháp đều có các ưu nhược điểm riêng Tuy nhiên các phương pháp trên chủ yếu nghiên cứu trên đối tượng mẫu là thực phẩm, đồ uống, rất ít nghiên cứu về thực phẩm chức năng Tại Việt Nam hầu như chưa

có nghiên cứu nào về phương pháp xác định hàm lượng Anthocyanin trong thực phẩm chức năng Xuất phát từ thực tiễn trên chúng tôi đặt vấn đề nghiên cứu đề tài:

“Xây dựng quy trình định lượng Anthocyanin trong thực phẩm chức năng bằng phương pháp HPTLC và HPLC”

Với các mục tiêu sau đây:

1 Xây dựng và thẩm định phương pháp xác định hàm lượng anthocyanin trong thực phẩm chức năng bằng kỹ thuật HPLC và kỹ thuật HPTLC

2 Áp dụng quy trình kỹ thuật đã xây dựng phân tích một số mẫu thực phẩm chức năng trên thị trường

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Khái niệm về thực phẩm chức năng:

Thực phẩm chức năng (Functional foods) được người Nhật sử dụng đầu tiên trong những năm 1980 để chỉ những thực phẩm chế biến có chứa những thành phần tuy không có giá trị dinh dưỡng nhưng giúp nâng cao sức khoẻ cho người sử dụng Theo Viện Khoa học và Đời sống quốc tế (International

Life Science Institute - ILSI) thì "thực phẩm chức năng là thực phẩm có lợi

cho một hay nhiều hoạt động của cơ thể như cải thiện tình trạng sức khoẻ và làm giảm nguy cơ mắc bệnh hơn là so với giá trị dinh dưỡng mà nó mang lại" Theo IFIC, thực phẩm chức năng là những thực phẩm hay thành phần

của chế độ ăn có thể đem lại lợi ích cho sức khoẻ nhiều hơn giá trị dinh dưỡng

cơ bản Thực phẩm chức năng có thể là sản phẩm có nguồn gốc tự nhiên hoặc

là thực phẩm trong quá trình chế biến được bổ sung thêm các chất khác Cũng như thực phẩm thuốc, thực phẩm chức năng nằm ở nơi giao thoa giữa thực phẩm và thuốc và người ta cũng gọi thực phẩm chức năng là thực phẩm - thuốc

Bộ Y tế Việt Nam theo thông tư số 08/TT – BYT ngày 23/08/2004 về việc “ Hướng dẫn việc quản lý các sản phẩm thực phẩm chức năng” định

nghĩa thực phẩm chức năng: “là thực phẩm dùng để hỗ trợ chức năng của các

bộ phận trong cơ thể người, có tác dụng dinh dưỡng, tạo cho cơ thể tình trạng thoải mái, tăng sức đề kháng và giảm bớt nguy cơ gây bệnh” Tuỳ theo

công thức, hàm lượng vi chất và hướng dẫn sử dụng, thực phẩm chức năng còn có các tên gọi sau: thực phẩm bổ sung vi chất dinh dưỡng, thực phẩm bổ sung, thực phẩm bảo vệ sức khoẻ, sản phẩm dinh dưỡng y học

1.2 Tổng quan về Anthocyanin

1.2.1 Cấu trúc của Anthocyanin:

Anthocyanin thuộc nhóm các hợp chất flavonoid, là những glucozit do gốc đường glucose, glactose kết hợp với gốc aglucol có màu (anthocyanidin) Aglycon của chúng có cấu trúc cơ bản được mô tả trong hình

1 Các gốc đường có thể được gắn vào vị trí 3,5,7; thường được gắn vào vị trí

3 v à 5 còn vị trí 7 rất ít Phân tử anthocyanin gắn đường vào vị trí 3 gọi là monoglycozit, ở vị trí 3 và 5 gọi là diglycozit [4], [12]

Hình 1.1: Cấu trúc cơ bản của aglycon của anthocyanin

Các aglycon của anthocyanin khác nhau chính là do các nhóm gắn vào

vị trí R1 và R2, thường là H, OH hoặc OCH3 [8], [27]

Bảng 1 Cấu trúc cơ bản của Anthocyanin

Cấu trúc cơ bản Anthocyanidin R 3 ′ R 4 ′ R 5 ′ R 3 R 5 R 6 R 7

Malvidin −OCH 3 −OH −OCH 3 −OH −OH −H −OH

Cấu trúc của anthocyanin cho phép nó thay đổi màu sắc khác nhau tùy thuộc giá trị pH Việc bổ sung các OH trong cấu trúc phân tử sẽ loại bỏ các điện tích dương của cấu trúc và gây ra độ hấp thụ của các proton bước sóng lớn hơn do đó xuất hiện màu xanh lá cây [21], [22]

Anthocyanins do cách sắp xếp vòng thơm của chúng, chúng có thể hấp thụ bức xạ trong phạm vi năng lượng thấp của quang phổ nhìn thấy được Trong kết quả của Vitis vinifera L., sáu anthocyanidins chính (cyanidin, peonidin, delphinidin, petunidin, pelargonidin và malvidin) có mặt như 3-O-glucosides, cũng như acetyl, hình thức este p-coumaroyl và caffeoyl của chúng Một chú ý đặc biệt đã được trao cho tác dụng nội phân tử, chứng minh

sự tồn tại của một truyền điện tích trạng thái kích thích nội phân tử của coumaroyl và các hình thức este caffeoyl [8], [21]

p-1.2.2 Tác dụng của anthocyanin

Trong thực vật, anthocyanin có tính kháng khuẩn, kháng nấm, có vai trò tạo điều kiện cho sự thụ phấn, phát tán nhờ màu sắc sặc sỡ trên cành hoa

và quả Mặt khác,anthocyanin là chất có khả năng hấp thụ tia UV nhằm bảo

vệ bộ gen của thực vật trước các tia tử ngoại Sinh tổng hợp anthocyanin ở vỏ được tăng cường để đáp ứng phù hợp với môi trường: hạn hán, ánh sáng mạnh, UV, nhiệt độ cao, thiếu nitơ và phosphor, nhiễm nấm, vi khuẩn, tổn thương, côn trùng, ô nhiễm… [12], [31]

Đối với sức khỏe của con người, theo nghiên cứu của David Heber, Đại học Harvard (Mỹ), chất anthocyanin có thể cắt được cơn đau tim, giảm thiểu các tổn thương não liên quan đột quỵ và ngăn cản sự tạo thành các cục máu đông trong lòng mạch máu (nguyên nhân dẫn đến tắc mạch, gây tai biến mạch máu não và những cơn nhồi máu cơ tim đột ngột), hạn chế sự suy giảm sức đề kháng Các nhà khoa học cũng đã chứng minh được rằng anthocyanin có tác dụng tốt trong chống lão hóa, ngăn ngừa sự phát triển của các khối u, bướu,

hạn chế nguy cơ bị đột quỵ, giảm nguy cơ mắc ung thư… Khi tiêm một lượng nhỏ anthocyanin chiết xuất từ khoai lang vào các tế bào ung thư ruột già, chất này đã chứng tỏ khả năng ngăn chặn tế bào ung thư phát triển Các nhà nghiên cứu cũng phát hiện trong một số trường hợp, sự biến đổi về cấu trúc của các phân tử anthocyanin cũng làm tăng khả năng chống ung thư của chúng Các nghiên cứu còn cho thấy anthocyanin còn có tác dụng tốt trong việc điều hòa lượng đường huyết của những bệnh nhân đái tháo đường Khả năng chữa bệnh của anthocyanin vẫn đang được nghiên cứu để tìm hiểu cơ chế và ứng dụng trong y học Các ứng dụng trên đã mở ra một triển vọng về việc sản xuất thực phẩm, dược phẩm chức năng chữa bệnh có hiệu quả [21], [26]

Trong lĩnh vực thực phẩm, với khả năng chống oxy hóa cao, anthocyanin được sử dụng để bảo quản thực phẩm, kháng khuẩn, kháng nấm, chống oxy hóa cho thực phẩm Kết quả nghiên cứu cho thấy, với một lượng nhỏ nguyên liệu vỏ khoai lang (1% khối lượng), khả năng bảo quản của các sản phẩm thực phẩm có chứa mỡ được kéo dài khá lâu và có thể so sánh với chất chống oxy hóa tổng hợp BHA Ngoài các tác dụng chống oxy hóa, anthocyanin còn được

sử dụng như chất màu tự nhiên tạo ra nhiều màu sắc hấp dẫn cho thực phẩm

và khá an toàn Ví dụ: dịch chiết anthocyanin từ các loại rau củ có màu đỏ như vỏ quả nho, dâu tây, vỏ khoai lang… đã được dùng để làm chất màu thay thế màu tổng hợp trong sản xuất kẹo cứng [18]

Anthocyanin ngoài tác dụng là chất màu thiên nhiên được sử dụng khá an toàn trong thực phẩm, tạo ra nhiều màu sắc hấp dẫn cho mỗi sản phẩm, anthocyanin còn là hợp chất có nhiều hoạt tính sinh học quí như: khả năng chống oxy hóa cao nên được sử dụng để chống lão hóa, hoặc chống oxy hóa các sản phẩm thực phẩm, hạn chế sự suy giảm sức đề kháng, có tác dụng làm bền thành mạch, chống viêm, hạn chế sự phát triển của các tế bào ung thư, tác dụng chống các tia phóng xạ [8], [27]

1.2.3 Tính chất của anthocyanin:

- Anthocyanin tinh khiết ở dạng tinh thể hoặc vô định hình là hợp chất khá phân cực nên tan tốt trong dung môi phân cực

- Khi đun nóng lâu trong nước, anthocyanin bị phá hủy và mất màu

- Anthocyanin hòa tan tốt trong nước và trong dịch bão hòa, khi kết hợp với đường làm cho phân tử anthocyanin càng dễ hòa tan hơn

- Màu sắc của anthocyanin thay đổi phụ thuộc vào nhiệt độ, các sắc tố có mặt và nhiều yếu tố khác… Khi tăng số lượng nhóm –OH trong vòng benzen thì màu càng xanh đậm Khi tác dụng với Sn có màu lam, với Al có màu tím, với Fe, Cu thì bị biến màu [14]

- Mức độ methyl hóa các nhóm –OH trong vòng benzen càng cao thì màu càng đỏ Nếu nhóm –OH ở vị trí thứ 3 kết hợp với các gốc đường thì màu sắc cũng thay đổi theo số lượng các gốc đường được đính vào nhiều hay ít

- Màu sắc của anthocyanin phụ thuộc rất mạnh vào pH của môi trường, khi pH> 7 các anthocyanin cho màu xanh, pH< 7 các anthocyanin cho màu đỏ

Tóm lại, các thực phẩm có chứa nhiều anthocyanin là nguồn cung cấp chất có hoạt tính sinh học, góp phần giúp trẻ lâu và phòng tránh bệnh tật Bên cạnh đó, anthocyanin có các đặc tính quý báu của chất màu tự nhiên mà các chất màu khác hình thành trong quá trình gia công kỹ thuật không có được [27], [31]

Cấu trúc của anthocyanin là những gì cho phép nó thay đổi màu sắc khác nhau trong giá trị pH Việc bổ sung các nhóm -OH vào trong cấu trúc phân tử sẽ loại bỏ các điện tích dương của cấu trúc và gây ra độ hấp thụ của các proton bước sóng lớn hơn do đó do đó xuất hiện màu xanh lá cây xuất hiện màu xanh lá cây [21], [22]

1.2.4 Một số phương pháp phân tích Anthocyanin:

Điều kiện phân tích Điều kiện xử lý

mẫu

Tài liệu tham khảo

vang đỏ

-Ascentis C18, 25 cm × 4.6

mm I.D., 5 μm particles (581325-U)

-Pha động: (A) water:formic acid (9:1), (B)

acetonitrile:water:formic acid (5:4:1)

-Tốc độ dòng: 1 mL/phút -Nhiệt độ cột: 25 °C -Detector PDA: 520 nm -Thể tích tiêm mẫu: 10µL

Pha loãng với nước, ly tâm và

đi qua một màng lọc 0,45 µm trước khi tiêm sắc ký

[22]

Mẫu nước hoa quả

-Cột ACE Phenyl (250 × 4,6 mm, 5 µm) -detector PDA: 520µm -Pha động: acetonitril - 10%

(v/v) acetic acid and 1%

(v/v) phosphoric acid trong nước

-Tốc độ dòng: 1 mL/phút -Nhiệt độ cột: 25oC -Thể tích tiêm mẫu: 25µL

Lọc qua màng lọc trước khi tiêm sắc ký

[33]

Mẫu nước hoa quả

-Cột Synergi Hydro-RP 80

Å (150.0 × 2.0 mm, 4 µm) -Pha động: acetonitril–acetic acid:trifluoroacetic

acid:acetonitril:nước(10:0,2:

5:84,8) -Tốc độ dòng: 1 mL/phút -Nhiệt độ cột: 25oC -Detector MS: 520 nm -Thể tích tiêm mẫu: 20µL

Lọc qua màng lọc trước khi

4 UHPLC Bilberry

-Cột Acclaim RSLC 120 C18, (2.2 μm; 2.1 × 150 mm)

-Pha động: A: 10% Formic Acid

B: 10% Formic Acid, 22.5%

Methanol, 22.5%

Chiết bằng methanol- 10%acid phosphoric, pha loãng, lọc thô

Acetonitrile -Tốc độ dòng: 0.475 mL/phút

-Nhiệt độ cột: 35OC -Detector :Absorbance, vis,

520 nm -Thể tích tiêm mẫu: 2 µL

Powdere

d berry extract

-Thiết bị: TLC sampler4 (ATS4, camag, muttenz, switxerland)

-Bản mỏng: Silica gel 60 F254 (10mm × 20mm) -Pha động: Ethylacetate:2- butanone:nước:acid formic (7:3:0,8:1,2)

-Quét sắc đồ ở 520 nm, tốc

độ 20 mm/giây -Hiện vết: Phun thuốc thử Dragendoft

Chiết với methanol : 0,1%HCL, pha loãng bằng ethyl acetate

[16]

extract

-Cột:5 µm YMC-Pack Pro C18 RS, 250 X 4.6 mm / 2

µm YMC-UltraHT Pro C18

RS, 100 X 3.0 mm

-Pha động: A: water/formic acid (90/10)

B:ACN/methanol/water/for mic acid (22.5/22.5/40/10) -Tốc độ dòng: 1.0 ml/min -Nhiệt độ cột: 300C

- Detector : VIS at 535 nm -Thể tích tiêm mẫu: 10 µL

Mẫu được hòa trong

methanol:nước(

85:15), rung siêu âm, lọc trước khi chạy

-Cột: YMC-pack ODS-AM C18 (250×4,6 mm, 5 µm) -Pha động: ACN:nước:acid formic (87:3:10, v/v/v)- acetonitril:nước:acid formic (40:50:10, v/v/v) -Tốc độ dòng: 0,8mL/phút -Nhiệt độ cột: 400C

-Thể tích tiêm: 25 µL -Detector: Sử dụng kỹ thuật ESI để ion hóa chất phân tích và phân tích khối phổ 2 lần MS/MS

Mẫu được chiết bằng

methanol/formic acid(97:3)trước khi tiêm sắc ký

[24]

1.3 Tổng quan về HPTLC

1.3.1 Sắc ký lớp mỏng:

Sắc kí giấy và sắc kí lớp mỏng đã được xây dựng, phát triển và ứng dụng từ lâu Tuy nhiên hiện nay sắc kí giấy ít được sử dụng Phổ biến nhất hiện nay là sắc kí lớp mỏng Ở nước ta phương pháp sắc kí lớp mỏng đã được

sử dụng rộng rãi, đã có nhiều tài liệu, chuyên gia có kinh nghiệm về phương pháp này

Trong sắc kí mặt phẳng, quá trình sắc kí được tiến hành trên một tờ giấy hay một lớp bột rải đều và được giữ trên mặt một tấm kính, chất dẻo hay kim loại, ví dụ nhôm Bản thân lớp mỏng có thể là pha tĩnh hoặc chỉ là chất mang để giữ pha tĩnh trên đó Pha động là chất lỏng sẽ thấm và chạy trên lớp mỏng do tác dụng của lực mao dẫn và đôi khi cả trọng lực và điện thế [1], [13]

a Nguyên tắc của SKLM

Cũng như tất cả các phương pháp sắc ký khác, quá trình tách hỗn hợp các chất bằng SKLM xảy ra khi cho pha động chuyển động qua pha tĩnh Trong SKLM, pha tĩnh được rải thành một lớp mỏng trên một giá đỡ phẳng Dưới tác dụng của lực mao quản, pha động thấm theo lớp mỏng đi qua điểm xuất phát – nơi hỗn hợp chất cần phân tích đã được đưa lên bản mỏng Trong quá trình di chuyển của pha động qua lớp mỏng chất hấp thụ (pha tĩnh), nhờ các quá trình hấp thụ và giải hấp thụ được lặp đi lặp lại và do hệ số phân bố khác nhau mà những chất khác nhau di chuyển theo hướng chuyển động của pha động với các tốc độ khác nhau Kết quả là mỗi chất trong hỗn hợp phân tích có thể sẽ được tách riêng ra ở các vị trí khác nhau trên bản mỏng [29] Pha động bao gồm dung dịch cần phân tích được hòa tan trong một dung môi thích hợp và được hút lên bản sắc ký nhờ lực mao dẫn tách dung dịch thí nghiệm dựa trên độ phân cực của các thành phần trong dung dịch [13], [29]

Đại lượng đặc trưng cho mức độ di chuyển của các chất phân tích là hệ

số lưu giữ Rf Trị số của nó được tính bằng tỷ lệ giữa khoảng cách di chuyển của chất phân tích và khoảng cách dịch chuyển của pha động:

Rf

dR: Khoảng cách từ điểm xuất phát đến tâm vết phân tích

dM: Khoảng cách từ điểm xuất phát đến mức dung môi pha động( đo trên cùng đường đi của vết, tính bằng cm)

Rf: Có giá tr ị dao động từ 0-1 [1]

Pha tĩnh của TLC là các hạt có kích thước 10–30µm được rải đều và kết dính thành lớp mỏng đồng nhất dày khoảng 250 µm trên giá đỡ hình vuông Bản mỏng có sẵn trên thị trường có kích thước khác nhau thường 5÷20cm, nhiều khi có đưa thêm chất huỳnh quang không tan vào pha tĩnh để dễ phát hiện chất phân tích Chất hấp phụ thường dùng nhất là silicagel [7], [9]

Pha động dùng cho TLC rất thay đổi, tùy thuộc vào cơ chế sắc ký Để tăng cường rửa giải thường dùng 2 dung môi Nguyên lý chia tách dựa vào hệ

số phân bố giữa 2 pha Tuy nhiên, lựa chọn tối ưu hóa sắc ký chủ yếu dựa vào kinh nghiệm [1]

b Kỹ thuật TLC:

 Đưa chất phân tích lên bản mỏng:

Lượng hỗn hợp các chất được đưa lên bản mỏng có ý nghĩa rất quan trọng đối với hiệu quả tách sắc ký, ảnh hưởng đến giá trị Rf, lượng mẫu đưa lên bản mỏng khoảng 0,1 - 50µg được pha trong dung môi thích hợp Thể tích dung dịch chấm 1 – 5 µL đối với với sắc ký phân tích và 0,1 – 0,2µL đối với sắc

ký điều chế

Đường xuất phát cách mép bản mỏng khoảng 1,5 – 2,0 cm và cách bề mặt dao động 0,8 – 1,0 cm

 Khai triển sắc ký:

Sau khi chấm sắc ký, bản đã được sấy khô được cho bào bình sắc ký đã bào hòa pha động Mép dưới bản mỏng được nhúng vào pha động nhưng vết chấm còn cách bề mặt pha động khoảng 1cm

c, Ứng dụng của SKLM trong phân tích kiểm nghiệm:

 Phân tích định tính

 Thử tinh khiết

 Bán định lượng,

 Định lượng [2], [23]

1.3.2 Sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao:

Sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao (HPTLC) là một hình thức tân tiến nhất của công cụ TLC HPTLC với dụng cụ tinh vi được điều khiển bởi một phần mềm thích hợp đảm bảo tính ứng dụng, độ tin cậy, độ lặp lại cao nhất của các

số liệu đưa ra Trong phân tích HPTLC, các thông số của quá trình phân tích được ghi lại và kiểm soát chặt chẽ, do đó lặp lại được độ lặp lại cao Các bước của quá trình phân tích bao gồm phun mẫu, khai triển mẫu, nhận diện vết được tiến hành bán tự động, giảm thiếu tối đa các sai số có thể gặp phải Quá trình phun mẫu được tiến hành bán tự động, đảm bảo chính xác thể tích mẫu phun, tốc độ phun và không có nguy cơ hỏng cơ học bản mỏng Trong quá trình khai triển, điều kiện khai triển về nhiệt độ và độ ẩm được kiểm soát chặt

chẽ và ghi lại đầy đủ, đảm bảo độ lặp lại của kết quả khi tiến hành tại các phòng thí nghiệm khác nhau Hệ thống đèn UV tích hợp máy ảnh và hệ thống

phần mềm giúp phân tích số liệu ứng dụng trong định tính và định lượng

Hiện nay để tăng cường độ tin cậy của kết quả phân tích, người ta đưa vào thị trường bản mỏng hiệu năng cao (high – performance plates) Bản này được tráng lớp pha tĩnh mỏng hơn (dày khoảng 100 µm) với bột mịn có kích thước hạt 5 µm độ đồng đều cao hơn Khi dùng bản mỏng này, độ nhạy và độ phân tích được tăng lên bởi vì:

 Vết sắc ký nhỏ hơn

 Thời gian sắc ký ngắn hơn

 Lượng dung môi dùng ít hơn

Pha tĩnh dùng silica và pha liên kết siloxan cho sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao (HPTLC) có sẵn trên thị trường Tuy vậy trong kỹ thuật này kể cả HPTLC sai số của phương pháp dao động trong khoảng 5 – 10% [9], [13], [29]

Ưu điểm của HPTLC:

+ Phù hợp với cả phân tích định tính và phân tích định lượng

+ Trong một lần triển khai sắc ký có thể phân tích đồng thời rất nhiều mẫu một lúc, tiết kiệm thời gian và chi phí cho hóa chất, vật tư tiêu hao

+ Các mẫu phân tích và các dung dịch chuẩn được chấm trên cùng 1 bản mỏng sắc ký, khai triển cùng trong một điều kiện dung môi, nhiệt

độ, độ ẩm nên cho độ lặp lại cao, hạn chế sự tác động của môi trường giữa các lần phân tích [19]

Do bởi các ưu điểm trên nên chúng tôi lựa chọn kỹ thuật HPTLC để nghiên cứu xây dựng phương pháp xác định hàm lượng anthocyanin trong thực phẩm chức năng

1.4 Tổng quan về HPLC

1.4.1 Khái niệm chung

Sắc ký lỏng hiệu năng cao (High performance Liquid Chromatography – HPLC) là kỹ thuật tách sắc ký trong đó các chất phân tích hòa tan trong pha động là chất lỏng và di chuyển qua cột chứa các hạt pha tĩnh Tùy thuộc vào

ái lực của chất phân tích với pha động và pha tĩnh mà các chất di chuyển với tốc độ khác nhau, do đó thứ tự rửa giải khác nhau Thành phần pha động đưa chất phân tích ra khỏi cột được thay đổi để rửa giải các chất với thời gian hợp

lý [2], [5]

1.4.2 Một số khái niệm cơ bản trong sắc ký [2], [1], [5]

Thời gian lưu:

Khoảng thời gian từ lúc bơm mẫu vào cột đến khi pic đến detector là thời gian lưu tR

Thời gian chết: thời gian tM của chất không lưu giữ (tốc độ di chuyển của nó bằng tốc độ di chuyển trung bình của các phần tử pha động)

Thời gian lưu hiệu chỉnh: tR’ = tR - tM

Trong đó:

CS, CM: nồng độ mol của chất tan trong pha tĩnh, pha động

K càng lớn, sự di chuyển của chất tan qua pha tĩnh càng chậm Các chất trong hỗn hợp có hệ số K khác nhau càng nhiều, khả năng tách diễn ra càng dễ dàng hơn

Hệ số dung lƣợng k’:

k’ =

M S M

M

S S

V

V K V C

V C

.

.

=

M

M R

t

t t

Trong đó:

VS, VM tương ứng là thể tích của pha tĩnh, pha động

k’ phụ thuộc vào bản chất chất phân tích, bản chất 2 pha vào hệ số VS/VM

M B R A B A

B

t t

t t k

k K

K

' '

Trong đó:

KB, KA lần lượt là hệ số phân bố của chất B, A (A là chất ra trước)

k’A,k’B tương ứng là hệ số dung lượng của chất A, B

(tR)A, (tR)B tương ứng là thời gian lưu của chất A, B

Hai chất A và B chỉ có thể tách được khỏi nhau nếu > 1 Trong phân tích sắc

ký, thường lựa chọn điều kiện phân tích để có được α = 1,05 - 2 Nếu α quá lớn, thời gian phân tích kéo dài

Số đĩa lý thuyết:

Số đĩa lý thuyết là đại lượng đặc trưng cho hiệu lực cột sắc ký

2

2 / 1

2

55,516

W

t W

t H

L

Trong đó:

L: chiều dài của cột được chia thành N đĩa lý thuyết; H: chiều cao của đĩa lý thuyết; W: chiều rộng của pic sắc ký; W1/2: chiều rộng pic ứng với một nửa chiều cao của pic

Độ phân giải của cột:

Độ phân giải (RS) của cột đánh giá khả năng tách định lượng hai chất trong hỗn hợp trên cột sắc ký:

RS =

B A

A R B R

B A

A R B R

W W

t t

W W

t t

, 2 / 1 , 2 / 1

.18,1

.21

Trong đó:

WA, WB tương ứng là chiều rộng pic sắc ký của chất A, B

W1/2,A, W1/2,B tương ứng là chiều rộng pic sắc ký của chất A, B ứng với một nửa chiều cao

của pic

1.4.3 Thiết bị sắc ký lỏng [1], [2]

Hình 1.2 Sơ đồ khối của một máy sắc ký lỏng hiệu năng cao [1]

a Hệ thống cung cấp pha động:

- Nguốn cấp pha động: pha động trong sắc ký lỏng thường là 2 dung môi

hòa tan vào nhau để có khả năng tách với độ phân giải phù hợp, được chứa trong bình thủy tinh hoặc thép không rỉ

Hệ thống cấp

dung môi

Cột sắc ký Detector

- Bộ phận loại khí (degasser): trước khi sử dụng cần lọc (màng lọc 0,45 µm)

và đuổi khí hòa tan trong pha động để tránh việc khí hòa tan có thể làm biến dạng pic, giảm hiệu lực cột, làm nhiễu đường nền Có thể loại khí hòa tan bằng cách: chạy siêu âm, sục khí trơ…

- Bộ phận trộn pha động (mixer): trộn các dung môi ở áp suất thấp hoặc áp

suất cao

 Chương trình dung môi ở áp suất thấp: mỗi bình chứa dung môi có một van riêng lấy lượng dung môi xác định đưa vào bình hòa trộn, sau đó chỉ dùng một bơm đưa pha động vào van tiêm mẫu

 Chương trình dung môi ở áp suất cao: Mỗi dung môi có một bơm riêng, việc hòa trộn được thực hiện ở áp suất cao

- Bơm: về mặt kết cấu có 3 loại thường gặp: Bơm đẩy một pittong, bơm làm

đầy nhanh và bơm kép đẩy kéo

b Bộ phận tiêm mẫu:

- Mẫu lỏng hoặc dung dịch được tiêm thẳng vào pha động cao áp ngay ở đầu

cột mà không cần dừng dòng bằng một van tiêm có vòng chứa mẫu Vòng chứa mẫu có dung tích khác nhau: thường dùng loại 0,50÷20 µL Có vòng chứa mẫu lớn hơn

- Ngoài ra, đôi khi người ta tiêm mẫu bằng bơm tiêm qua tấm đệm ở đầu cột Khi tiêm phải dừng dòng và áp suất trong cột không cao Cách tiêm này có độ lặp lại thấp, sai số lớn hơn so với khi dùng van tiêm

- Hiện nay hay dùng van tiêm mẫu vì có ưu điểm là sẽ dễ dàng tự động hóa, cột không bị tắc hay bị làm bẩn bởi các mảnh của vách ngăn, thể tích đưa vào cột hằng định nên độ lặp lại cao

c Cột sắc ký

- Cột sắc ký lỏng hiệu năng cao thường được chế tạo bằng thép không gỉ, thủy tinh hoặc chất dẻo có chiều dài 10-30 cm, đường kính trong 4-10 mm

Cột nhồi thường có hạt cỡ 5-10 µm Ưu điểm của cột có cột nhồi có hạt cỡ nhỏ là chạy tốn ít dung môi và ít thời gian và số đĩa lý thuyết lớn

- Để bảo vệ cột sắc ký, người ta sử dụng cột bảo vệ được đặt trước cột sắc ký

để loại các chất có mặt trong pha động và trong mẫu phân tích làm giảm tuổi thọ cột Cột bảo vệ ngắn hơn cột sắc ký, được nhồi hạt cùng loại nhưng kích thước hạt lớn hơn

- Sắc ký lỏng phân bố là kỹ thuật sử dụng phổ biến nhất hiện nay Loại pha tĩnh phổ biến nhất được chế tạo từ silic dioxid (silica) Nhóm OH trên bề mặt silica phản ứng với dẫn chất clorosilan tạo ra dẫn chất siloxan

Dựa vào gốc R’ của dẫn chất siloxan, người ta chia ra 2 nhóm:

- Pha tĩnh không phân cực có R’ là:

- Sắc kí phân bố pha đảo: pha tĩnh không phân cực như hydrocacbon (C18 hoặc C8) còn pha động phân cực hơn pha tĩnh như nước, acetonitril

UV gần và Vis Dải bức xạ UV-Vis (thường các detector PDA có dải bước sóng trong khoảng 190 – 800 nm) sau khi đi qua tế bào đo được đưa đến một cách tử để phân thành các tia đơn sắc đi đến một mảng diod quang Mỗi diod quang đón nhận một phần dải bức xạ tương ứng với một khoảng bước sóng hẹp Như vậy, mỗi một diod có thể phát hiện một sự hấp thu ở một bước sóng nhất định Toàn bộ dãy diod được quét nhiều lần trong 1 giây bởi bộ phận vi

xử lý Kết quả phổ có thể hiện trên màn hình máy tính hoặc được lưu trữ để in

ra dưới dạng bản phổ bằng máy in

Ưu điểm của detector này là tạo được phổ UV của các chất phân tích trong khoảng bước sóng đã chọn, kiểm tra sự tinh khiết của sản phẩm và định danh được sản phẩm bằng cách so sánh phổ tương ứng của đỉnh sắc ký với phổ của một ngân hàng dữ liệu hoặc với phổ của chất chuẩn biết trước [2], [1], [5]

e Hệ thống thu nhận và xử lý dữ liệu

Bộ phận lưu trữ dữ liệu của các thiết bị HPLC hiện nay thường là các máy vi tính hiện đại có khả năng ghi nhận, lưu giữ, biên tập, xử lý các thông tin hết sức hiệu quả

1.5 Tổng quan về chiết pha rắn SPE

a Khái niệm:

Chiết pha rắn là một dạng sắc ký lỏng được cải tiến thành hấp thụ pha rắn

với các cơ chế khác nhau Mục đích của chiết pha rắn là lấy được các chất phân tích từ dung dịch, loại tạp chất và thu hồi toàn bộ nó Chất phân tích sau khi được làm sạch, chúng được rửa giải vào một thể tích nhỏ dung dịch và lấy một cách định lượng khỏi dung dịch nên có hệ số làm giàu cao

Chiết pha rắn có các ưu điểm so với chiết lỏng-lỏng:

Chuẩn bị mẫu tiện lợi và sạch tạp chất dễ dàng

Thu hồi chất phân tích với hiệu suất cao

Dễ tự động, phù hợp với sắc ký

Tiến hành đơn giản

Giảm lượng dung môi hữu cơ nên giá thành giảm

b Các bước chiết pha rắn:

Bước 1: Chuẩn bị chất hấp thu:

Cho dung môi đi qua chất hấp thu để làm ướt và solvat hóa các nhóm chức trong vật liệu, đồng thời loại bỏ khí trong cột và thay vào đó là dung môi Bước 2: Nạp mẫu lên cột:

Tùy theo kích thước và loại mẫu mà áp dụng phương pháp chảy bình thường hay sử dụng áp suất, và phảo đảm bảo giữ được toàn bộ chất phân tích

Bước 3: Rửa loại tạp chất:

Đây là giai đoạn rủa giải loại tạp chất Điều quan trọng là chọn dung môi để chất phân tích không được tan trong dung dịch rửa

Bước 4: Rửa giải chọn lọc chất phân tích:

Dùng một dung môi để rửa giả lấy ra chất phân tích

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Trong đề tài này, chúng tôi tiến hành nghiên cứu phương pháp xác định hàm lượng của Anthocyanin trong thực phẩm chức năng

Đối tượng mẫu phân tích là anthocyanin và đối tượng nghiên cứu là các thực phẩm chức năng dưới một số dạng bào chế: viên nang cứng, viên nang mềm và mẫu dạng dung dịch Các mẫu phân tích được lấy ngẫu nhiên trên thị trường Hà Nội có nguồn gốc từ các công ty sản xuất khác nhau và được mã hóa như bảng 2.1

Bảng 2.1 Danh mục các mẫu phân tích

dùng

2.2.1 Nguyên vật liệu

- Chất chuẩn Cyanidin hydroclorid (Sigma - Adrich) (hàm lượng: 98% (HPLC))

- Bột đông khô bilberry được mua từ Viện dược liệu trung ương

- Dung môi loại tinh khiết cho HPLC: methanol, acetonitril, tetrahydrofuran (Merck)

- Dung môi loại tinh khiết phân tích: ethanol, aceton (Merck)

- Hóa chất tinh khiết phân tích: amoniacetate (Merck), trichloroacetic acid (Merck)

- Nước cất 2 lần

Dung dịch chất chuẩn gốc Cyanidin chloride: 1mg chất chuẩn Cyanindin

chloride trên hòa tan với khoảng 5 ml methanol rồi chuyển toàn bộ vào bình định mức 10ml sau đó thêm methanol tới vạch ở nhiệt độ phòng, lắc kỹ và bảo quản ở điều kiện lạnh

Dung dịch chuẩn bilberry: 0,1g bột đông khô bilberry hòa tan trong 10 mL

dung dịch methanol: HCl 2N (80:20) ở nhiệt độ phòng, đem thủy phân ở 800C trong 2,5 giờ Định mức với dung môi trên tới chính xác thể tích 10mL trong bình định mức, lắc kỹ và bảo quản ở điều kiện lạnh

2.2.2 Thiết bị

- Hệ thống sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao HPTLC Camag: bộ phận chấm

mẫu bán tự động Linomat 5, bộ phận triển khai sắc kí ADC2 và Scanner4

- Hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC Shimadzu (LC 20AD) trang bị detector PDA

- Cột sắc ký C18 Symmetry Waters (250 mm x 4,6 mm; 5 µm)

- Tiền cột C18 Symmetry Waters (20 mm x 3,9 mm; 5 µm)

- Cân kỹ thuật XT1200c có độ chính xác 0,01g

- Cân phân tích Mettler Toledo có độ chính xác 0,0001 g và 0,00001 g

- Máy đo pH: pH Meter 744

- Máy lắc siêu âm Elma (Germany)

- Máy ly tâm Hermle Z383K

- Máy lắc Vortex IKA

- Dụng cụ thủy tinh các loại: Bình định mức 10mL, 20 mL, 50 mL, cốc có

mỏ, pipet các loại, autopipet 1000 μL, 200 μL, 5000 µL

- Ống ly tâm 50 mL, 25mL, lọ thủy tinh có nắp kín

- Phễu lọc, giấy lọc, màng lọc 0,45 µm, 0,2 µm

2.3 Nội dung nghiên cứu

- Khảo sát xây dựng điều kiện chạy máy HPLC, HPTLC để phân tích Anthocyanin

- Khảo sát xây dựng quy trình xử lý mẫu để tách chiết Anthocyanin trong thực phẩm chức năng

- Đánh giá (thẩm định) quy trình phân tích và xử lý mẫu

- Áp dụng quy trình phân tích và xử lý mẫu với một số sản phẩm trên thị trường

2.4 Phương pháp nghiên cứu

2.4.1 Khảo sát các điều kiện phân tích Anthocyanin bằng HPLC

Thành phần pha động ảnh hướng rất nhiều tới quá trình tách sắc ký Pha động khác nhau sẽ có độ phân cực khác nhau Dựa vào các bài báo tham khảo [15], [20], [30], chúng tôi chọn pha động chạy với chế độ gradient nồng

độ với pha động A và B như sau:

trình chạy

1 Methanol – Acid Formic

Methanol hoặc Acetonitril Gradient

2 Methanol – TFA

3 Methanol - TCA

Chúng tôi tiến hành khảo sát điều kiện chạy máy HPLC như sau:

- Pha tĩnh: dựa vào các tài liệu tham khảo chúng tôi chọn pha tĩnh là cột C18 Symmetry Waters (250mm x 4,6mm; 5µm.)

- Pha động: khảo sát chế độ gradient nồng độ với các pha động sau:

Bảng 2.2: Danh mục các pha động HPLC khảo sát

Pha động 2 0,1% acid Formic, 1% THF (pH 2,5) Acetonitril

Pha động 3 2%TCA, 1%Amoniacetate, 2%

- Detector: PDA quét dải phổ từ bước sóng 190 nm đến 800 nm

- Bước sóng phát hiện: 520 nm (do Anthocyanin có bước sóng hấp thụ cực đại là 520 nm) [15], [30], [32]

- Các dung dịch chuẩn Cyanidin có nồng độ nhỏ hơn được pha từ dung dịch chuẩn gốc

- Dung dịch pha động A (pH 2,5): cân chính xác 2,5 g muối amoniacetate, 5g trichloroacetic acid hòa tan vào khoảng 400 mL nước cất 2 lần, thêm nước vừa đủ 2,5L và điều chỉnh đến pH 2,5 bằng dung dịch acid trichloroacetic 4%, thêm 50mL tetrahydrofuran, lọc qua màng lọc 0,2 µm

2.4.2 Khảo sát các điều kiện phân tích Anthocyanin bằng HPTLC:

Dựa theo các tài liệu tham khảo [10], [16], [17] chúng tôi khảo sát điều kiện chạy HPTLC như sau:

Pha tĩnh: HPTLC Silica gel 60 F254 (10mm × 20mm)

Pha động: chúng tôi khảo sát với các pha động sau đây:

Bảng 2.3: Danh mục các pha động HPTLC khảo sát

Thành phần và tỷ lệ pha động

(7:3:0,8:1,2; v/v/v/v)

- Tiến hành quét phổ ở bước sóng 490-550

- Bước sóng phát hiện là 520µm

- Thể tích tiêm mẫu: 5µL

- Thể tích dung môi bão hòa: 25ml; dung môi khai triển: 10ml

- Thời gian bão hòa dung môi: 20 phút

- Thời gian bão hòa bản mỏng: 5 phút

- Thời gian sấy khô bản mỏng: 5 phút

- Khoảng cách dịch chuyển của pha động: 80 mm

- Dung dịch chuẩn gốc Cyanidin chlorid 100 µg/mL: Bảo quản trong tủ lạnh

- Dung dịch chuẩn làm việc: hút chính xác 1mL dung dịch chuẩn gốc vào bình đinh mức 10mL, thêm methanol vừa đủ (dung dịch chuẩn làm việc có nồng độ Cyanindin 10 µg/mL)

- Các dung dịch chuẩn Cyanidin có nồng độ nhỏ hơn được pha từ dung dịch chuẩn gốc

- Dung dịch Bilberry: bảo quản ở nhiệt độ lạnh

- Pha pha động: sử dụng các dụng cụ hóa chất dùng cho HPLC để pha pha động có thành phần và tỷ lệ như bảng 2.3 trên

2.4.3 Khảo sát điều kiện xử lý mẫu

Dựa khả năng hòa tan của Anthocyanin và tham khảo nhiều bài báo [22], [25], [28], nghiên cứu, chúng tôi khảo sát khả năng chiết Anthocyanin từ nền mẫu bằng cách thủy phân mẫu ở nhiệt độ 800C với thời gian 30 phút, 60 phút, 90 phút, 120 phút, 150 phút, 180 phút bằng hỗn hợp dung môi sau đây: methanol acid hóa bằng HCl 2N với các tỷ lệ như sau [16], [18]:

Methanol: HCl 2N: 90:10; 80:20; 70:30; 60:40

Quy trình chiết Anthocyanin cho đối tượng phân tích là thực phẩm chức năng dạng nang cứng và nang mềm dự kiến gồm các bước sau:

- Xác định khối lượng trung bình thuốc trong nang, đồng nhất mẫu

- Cân chính xác một lượng mẫu sau khi đồng nhất (cân 1 lượng tương đương với khối lượng 2 viên) vào ống ly tâm 50 mL

- Thêm khoảng 10 mL dung môi chiết vào ống ly tâm

- Lắc xoáy ống ly tâm 5 - 10 phút, sau đó lắc siêu âm 15 - 30 phút ở nhiệt độ phòng

- Thủy phân ở nhiệt độ 800C với hỗn hợp dung môi methanol: HCl 2N (80:20)

Quy trình chiết Anthocyanin cho đối tượng phân tích là thực phẩm chức năng dạng dung dịch dự kiến gồm các bước sau: tương tự các bước đối với thực phẩm chức năng dạng viên nén, nang mềm và nang cứng nhưng thêm bước cuối làm sạch và làm giầu mẫu bằng phương pháp chiết pha rắn (SPE C18) như sau:

- Hoạt hóa cột: Lần lượt bằng các dung môi 6mL methanol, 6mL nước cất

- Nạp dịch lên cột: tốc độ không quá 2 ml/phút

- Rửa, loại tạp chất: 6mL nước cất

- Rửa lấy dịch: 2 mL methanol/lần × 2 lần

- Chạy máy HPTLC, HPLC (pha loãng nếu cần)

CHƯƠNG 3 THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ 3.1 Lựa chọn điều kiện sắc ký để phân tích Anthocyanin bằng HPLC

Để xây dựng quy trình phân tích Anthocyanin bằng HPLC, chúng tôi sử dụng các điều kiện sắc ký thông dụng dưới đây cố định trong toàn bộ nghiên cứu:

- Cột C18 Symmetry Waters (250 mm x 4,6 mm; 5 µm) và tiền cột cùng loại

sơ bộ cho thấy phân tích ở chế độ đẳng dòng không cho phép tách được cyanidin chloride khỏi các thành phần khác Vì vậy, việc sử dụng chế độ gradient dung môi là bắt buộc để có được độ phân giải như mong muốn, đồng thời cho thời gian phân tích vừa phải (khoảng 25-30 phút) Có tất cả 4 hệ dung môi được khảo sát:

- Hệ pha động 1: Methanol acid hóa với 0,1% acid Formic (pH 3,0)–

methanol với chương trình gradient như ở bảng 3.1 Kết quả là không tách được các chất sau vài lần chạy(Hình 3.1)