sản phẩm:
Chúng tôi đã tiến hành nghiên cứu trên 11 thực phẩm chức năng được đánh giá sơ bộ chứa anthocyanin trên thị trường được bào chế dưới nhiều dạng như nang mềm, nang cứng, dạng dung dịch theo phương pháp HPLC theo quy trình đã xây dựng và thẩm định trên và thu được kết quả như ở bảng 3.14.
47
Bảng 3.14: Kết quả phân tích Anthocyanin trong thực phẩm chức năng
Trong đó dấu “-“: không phát hiện hoặc dưới ngưỡng phát hiện của phương pháp.
Bảng kết quả sau khi phân tích các mẫu thực phẩm chức năng ở bảng trên cho thấy rằng không phải tất cả các sản phẩm công bố là có chứa Anthocyanin đều đạt chất lượng. Chính vì vậy chúng ta cần có biện pháp kiểm soát chặt chẽ hơn đối với các sản phẩm này trên thị trường.
Stt Mã sản phẩm
Dạng bào chế
Nhà sản xuất, hàm lƣợng Anthocyanin trong 1 viên
Hàm lƣợng Anthocya
nin (mg/viên)
1 NM01 Nang mềm Factor group of Nutritional
Companies Inc (100mg) 39,67
2 NM02 Nang mềm Life Cycle Herbal Products Inc
(25mg) 19,59
3 NM03 Nang mềm Công ty St. Paul Brands – Mỹ
(100mg) 0,12
4 NM04 Nang cứng Yunan Baian Medicinal Science&
Technology co., LTD (100mg) 1,23
5 NM05 Nang cứng Laboratoriya Sovremennogo
Zdorovya – LBN (320mg) 99,28
6 DD01 Nước USA O&K trading -
7 NC01 Nang cứng Atrapharmaceuticals PVT-LTD
(450mg) 0,74
8 NC02 Nang cứng Parmachem Lobotorie (250mg) 8,73
9 NC03 Nang cứng AFC- HD AMS Life Science Co.
Ltd (120mg) 5,76
10 DD02 Nước Hankook Drink. Co. Ltd -
48
CHƢƠNG 4: BÀN LUẬN 4.1. Xây dựng quy trình kỹ thuật:
4.1.1. Lựa chọn phương pháp:
Anthocyanin có cấu trúc vòng chứa nhiều nối đôi, có khả năng hấp thụ UV mạnh, đây là cơ sở để chúng tôi thực hiện định lượng bằng phương pháp HPLC với Detector PDA. Ngoài ra trên cấu trúc của Anthocyanin còn có nhiều nhóm –OH tự do, phân cực mạnh và dễ đồng tan với dung môi phân cực khác như nước, methanol, ethanol,…thích hợp cho việc tiến hành sắc ký trên cột sắc ký pha đảo.
Mặt khác HPLC là phương pháp có nhiều ưu điểm: có độ đặc hiệu, độ nhạy cao, kết quả chính xác và HPTLC là phương pháp mới, tiến hành được trên một số lượng mẫu lớn, có ưu điểm là khá đơn giản, có độ nhạy cao, có tính kinh tế và tiết kiệm thời gian phân tích. Dựa vào các đặc điểm trên chúng tôi tiến hành xây dựng quy trình phân tích anthocyanin bằng cả hai phương pháp và lựa chọn phương pháp tối ưu góp phần vào việc tiêu chuẩn hóa chất lượng thực phẩm chức năng chứa anthocyanin thúc đẩy việc quản lý chất lượng sản phẩm.
4.1.2. Điều kiện xử lý mẫu:
Xử lý mẫu trong phân tích là bước vô cùng quan trọng, nó là một trong những yếu tố ảnh hưởng rất lớn đến hiệu xuất, đến độ chính xác của kết quả phân tích. Chính vì thế lấy mẫu như thế nào, lấy bao nhiêu mẫu tùy thuộc vào mục đích của nghiên cứu. Trong quy trình này của chúng tôi mục đích lấy mẫu để đánh giá tính khả thi của quy trình xem quy trình có phù hợp để đánh giá hàm lượng anthocyanin trong thực phẩm chức năng hay không. Vì vậy chúng tôi lấy ngẫu nhiên trên thị trường hà nội với số lượng mẫu không nhiều (11 mẫu) và được bào chế dưới nhiều dạng khác nhau. Một số nghiên cứu đã sử dụng hỗn hợp acid phosphoric/methanol, acid chlohydric/methanol, acid
49
formic/methanol…để chiết mẫu cho kết quả tốt [32], [33], [22]. Qua nghiên cứu và thử nghiệm chúng tôi thấy rằng chiết mẫu bằng cách thủy phân mẫu với dung môi HCl 2N/methanol (20:80) trong 150 phút ở nhiệt độ 800C cho hiệu quả tốt, đạt yêu cầu phân tích.
Sơ đồ xử lý mẫu
Nghiền nhỏ
Pha loãng nếu cần
Pha loãng nếu cần 10 ml dung môi
MeOH:HCl 2N(80:20) Rung siêu âm 10 – 15
phút
Thủy phân 800C trong
2,5h
Ly tâm 5 phút, 6000 vòng/phút
10 viên nang cứng 10 viên nang mềm
1-2 g mẫu 1-2 g mẫu
Gạn lấy dịch chiết Gạn lấy dịch chiết
40 ml dịch
Nghiền nhỏ
10 ml dung môi MeOH:HCl
2N(80:20) Rung siêu âm 10 –
15 phút Thủy phân 800C trong 2,5h 10 ml dung môi HCl 2N Lọc lấy dịch chiết
Rung siêu âm 10 – 15 phút Thủy phân 800C trong 2,5h Định mức 50 ml Định mức 10 ml Định mức 10 ml Dịch tiêm mẫu Dịch qua cột SPE C18 Hoạt hóa cột: bằng các dm 6mL methanol, 6mL nước cất Nạp dịch lên cột: tốc độ không quá 2 ml/phút) Rửa lấy dịch: 2 mL methanol/lần × 2 lần. Rửa, loại tạp chất: 6mL nước
cất
Ly tâm 5 phút, 6000 vòng/phút
50
4.1.3. Xây dựng phương pháp định lượng
Cùng với việc tham khảo tài liệu và thực nghiệm, chúng tôi đã lựa chọn được quy trình phân tích Anthocyanin trong các thực phẩm chức năng chứa anthocyanin, các thông số chạy máy quan trọng như sau:
HPTLC: thể tích tiêm mẫu là 5µL, bước sóng phát hiện và định lượng là 520nm,quét sắc đồ ở 520 nm, tốc độ 20 mm/giây, pha tĩnh là silica gel 60 F254, thành phần pha động là Ethyacetate: aicd formic: nước (10:2:3;v/v/v) HPLC: thể tích bơm mẫu là 50 µL; bước sóng phát hiện và định lượng đối với Anthocyanin là 520 nm; cột sắc ký C18 Symmetry Waters (250 mm x 4,6 mm; 5µm) với tiền cột cùng loại; tốc độ pha động là 1 mL/phút; nhiệt độ buồng cột là 400C; thành phần pha động gồm acetonitril và 2% TCA, 1% Amoniacetate, 2% THF ( pH 2,5) chạy theo chương trình gradient nồng độ. Các thông số phù hợp với điều kiện phòng thí nghiệm và với hệ thống HPLC của chúng tôi. Điểm khác trong đề tài của chúng tôi là đã lựa chọn được chương trình gradient giúp rửa giải được anthocyanin một cách hiệu quả trên mẫu và thời gian cho mỗi lần phân tích chỉ mất 26 phút trong khi các nghiên cứu trước đó [22], [16], [33], [24] thì thời gian phân tích khá dài (trên 40 phút).
Quy trình xử lý mẫu của chúng tôi lựa chọn đơn giản, có khả năng làm sạch được mẫu, giúp cho việc xác định và định lượng các chất trên sắc đồ dễ dàng, điều này được khẳng định thông qua kết quả khảo sát dung môi ở trên.
Phương pháp của chúng tôi được thẩm định phù hợp với các yêu cầu của AOAC. Khoảng tuyến tính của Anthocyanin rộng từ 0,5 – 100 ppm. So sánh kết quả với nghiên cứu của tác giả Dolores Muller và các cộng sự [12] có khoảng tuyến tính từ 15 - 159 ppm, của tác giả Brown et al (2005) có khoảng tuyến tính là 15 - 182 ppm, của tác giả Teow et al (2007) có khoảng tuyến tính là 24,6 – 258 ppm cho thấy nghiên cứu của chúng tôi có khoảng nồng độ
51
tuyến tính rộng hơn, Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng (LOD = 0,2 ppm, LOQ = 0,5 ppm) cũng bằng hoặc nhỏ hơn với các nghiên cứu sử dụng HPLC ở trên [32], [12]. Tác giả Teow et al (2007) cho kết quả giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng lần lượt là 24,6 – 43 ppm, tác giả Brown et al (2005) cho giới hạn phát triển và giới hạn định lượng là 15 ppm, 38 ppm. Để khẳng định lựa chọn phương pháp HPLC là phù hợp trong phân tích anthocyanin trong các mẫu thực phẩm chức năng chứa nó, chúng tôi tiến hành thử nghiệm phân tích hàm lượng anthocyanin trong mẫu bột đông khô bilberry chuẩn với phương pháp của AOAC. Mẫu sau khi trải qua quá trình xử lý thì được pha loãng 100 lần với 2 dung dịch là pH 1 và pH 4 (theo AOAC) và đem đi đo UV ở bước sóng 520 và 700 thì thu được kết quả như sau: STT Lƣợng cân mẫu pH 1 pH 4 Hàm lƣợng mg/g 520 700 520 700 1 0,0945 0,499 0,038 0,132 0,056 44,42 2 0,0945 0,501 0,032 0,138 0,053 44,30 3 0,0908 0,428 0,048 0,136 0,05 35,30 4 0,0908 0,429 0,049 0,138 0,05 35,06 5 0,0914 0,465 0,047 0,196 0,063 33,99 6 0,0914 0,047 0,048 0,187 0,06 35,19 7 0,0938 0,429 0,046 0,155 0,056 33,01 8 0,0938 0,43 0,046 0,154 0,054 33,01 9 0,0893 0,536 0,047 0,187 0,059 44,07 10 0,0893 0,537 0,046 0,186 0,055 43,95 Hàm lƣợng trung bình 38,23 RD 5,19 RSD(%) 13,57
Bảng kết quả 3.11 cho thấy mẫu bột đông khô bilberry chuẩn theo phương pháp HPLC cho thấy hàm lượng (mg/g) là 46,12% và độ lệch tương đối của phương pháp là 2,33, còn theo AOAC hàm lượng anthocyanin đạt được là 38,23% và độ lệch tương đối theo phương pháp này là 13,57. Nhìn kết quả trên chúng ta có thể thấy được khi định lượng anthocyanin bằng phương pháp HPLC có độ chính xác cao hơn, hiệu xuất tốt hơn, ít sai số hơn.
52
Điều này một lần nữa khẳng định rằng quy trình định lượng anthocyanin bằng phương pháp HPLC là phù hợp hơn cả.
4.1.4. Thẩm định phương pháp đã xây dựng
o Tính thích hợp của hệ thống
Kết quả thẩm định tính thích hợp của hệ thống cho thấy :
Với HPLC: RSD% của thời gian lưu là 0,085 và diện tích pic là 1,59 đều nằm trong giới hạn chấp nhận được. Điều này chứng tỏ hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao phù hợp cho việc định lượng anthocyanin trong thực phẩm chức năng.
Với HPTLC: RSD % của giá trị Rf là 1,59 và diện tích pic là 1,99, đều nhỏ hơn 2 nên nằm trong giới hạn chấp nhận được. Chính vì thế hệ thống HPTLC cũng phù hợp cho việc đinh lượng anthocyanin trong thực phẩm chức năng.
o Khoảng nồng độ tuyến tính, LOD, LOQ
Chúng tôi đã xây dựng khoảng tuyến tính đủ rộng để ứng dụng đánh giá nhiều chỉ tiêu về hàm lượng. Khoảng nồng độ tuyến tính của hệ thống HPLC là 0,5 – 100 ppm có biên độ dưới cao hơn so với một vài nghiên cứu trước.
Trong khoảng nồng độ tuyến tính (0,5 – 100 ppm) hệ số tương quan hồi quy của phương pháp HPLC có r2
= 0.9996. Phương pháp HPTLC trong khoảng nồng độ tuyến tính (10-50 ppm) có r2
= 0.9994. Điều này cho thấy có sự tương quan tuyến tính chặt chẽ giữa diện tích với nồng độ của chất phân tích ở cả hai phương pháp. Tuy nhiên kết quả LOD, LOQ ở 2 phương pháp trên cũng cho thấy phương pháp HPLC có độ nhạy cao hơn, khoảng nồng độ tuyến tính cao, khả năng phát hiện và định lượng anthocyanin ở khoảng nồng độ rộng hơn, giới hạn phát hiện dưới thấp hơn với nồng độ rất nhỏ (0,5ppm) còn phương pháp HPTLC thì có giới hạn phát hiện ở nồng độ cao hơn 20 lần
53
(10ppm). Đây cũng là bước đầu thể hiện hệ thống HPLC phù hợp hơn, tối ưu hơn HPTLC khi xác định hàm lượng anthocyanin trong thực phẩm chức năng.
o Độ lặp lại của phương pháp
Kết quả thẩm định độ lặp lại: với phương pháp HPLC trên mẫu chuẩn bilberry cho giá trị RSD % về hàm lượng là 2,33; trên mẫu NM01 thêm chuẩn bilberry là 3,98. Trong khi giá trị trên mẫu NM01 thêm chuẩn ở phương pháp HPTLC là 10,13. Điều đó cho thấy phương pháp HPLC có độ chính xác cao hơn rất nhiều so với phương pháp HPTLC. Từ nghiên cứu này có thể áp dụng phương pháp HPLC để định lượng anthocyanin trong thực phẩm chức năng còn áp dụng HPTLC để phát hiện nhanh khi tiến hành kiểm tra chất lượng chế phẩm (định tính).
o Độ thu hồi
Kết quả thẩm định độ thu hồi với phương pháp HPLC trên mẫu TPCN không có anthocyanin và được thêm chuẩn bilberry cho giá trị RSD % về hàm lượng là 4,70 và với phương pháp HPTLC là 13,01 . Điều đó cho thấy phương pháp HPLC có độ đúng, độ thu hồi cao hơn rất nhiều so với phương pháp HPTLC. Từ kết quả thực nghiệm trong suốt quá trình nghiên cứu trên 2 phương pháp này chúng tôi thấy HPLC là phương pháp được lựa chọn trong việc xác định hàm lượng anthocyanin trong thực phẩm chức năng nên có thể áp dụng phương pháp HPLC để định lượng anthocyanin trong thực phẩm chức năng còn áp dụng HPTLC để phát hiện nhanh khi tiến hành kiểm tra chất lượng chế phẩm (định tính).
54
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ KẾT LUẬN
Sau khi hoàn thành nghiên cứu này, trên cơ sở nghiên cứu các điều kiện thực nghiệm, với mục đích ứng dụng phương pháp HPLC, HPTLC để xác hàm lượng anthocyanin, chúng tôi thu được kết quả như sau:
Xây dựng được phương pháp định lượng anthocyanin trong các thực phẩm chức năng chứa anthocyanin trải qua 2 giai đoạn:
Giai đoạn xử lý mẫu: mẫu được chiết bằng methanol : HCl 2N (80:20), lắc xoáy, rung siêu âm, thủy phân 150 phút ở nhiệt độ 800, định mức, lọc rồi tiến hành chạy sắc ký đối với viên nang, chạy SPE lấy dịch chạy sắc ký đối với mẫu dạng dung dịch.
Giai đoạn phân tích bằng HPTLC:
o Pha tĩnh: bản mỏng silica gel 60 F254 (20×10)
o Pha động: Ethylacetate: acid formic: nước (10:2:3;v/v/v)
o Quét sắc đồ ở 520 nm, tốc độ 20 mm/giây
o Thể tích tiêm mẫu: 5 µL
Giai đoạn phân tích bằng HPLC với điều kiện:
o Pha tĩnh: Cột C18 Symmetry Waters (250 mm x 4,6 mm; 5 µm) và tiền cột cùng loại.
o Pha động: chạy theo chương trình gradient nồng độ
Kênh A:2% TCA, 1% Amoniacetate, 2%THF (pH 2,5), Kênh B: Acetonitril
Thời gian (phút) 0 2 22 23 26 Thành phần pha động (%) A 90 90 70 70 90 B 10 10 30 30 10 o Nhiệt độ cột: 400C o Tốc độ dòng: 1 mL/phút o Thể tích tiêm mẫu: 50 µL
55
Phương pháp đã xây dựng đã xác định được khoảng tuyến tính và xây dựng được đường chuẩn cho anthocyanin, xác định được LOD, LOQ của anthocyanin, có độ chọn lọc, độ lặp lại, độ thu hồi tốt. Độ lặp lại và độ thu hồi đáp ứng yêu cầu của AOAC.
Áp dụng quy trình phân tích ở trên để xác định hàm lượng anthocyanin trong 11 mẫu thực phẩm chức năng gồm cả viên nang cứng, nang mềm và dạng dung dịch. Kết quả cho thấy, có 1 số mẫu không phát hiện anthocyanin trong nghiên cứu. Đây là một kết quả đáng báo động về tình trạng lạm dụng anthocyanin trong các thực phẩm chức năng, đặt ra một yêu cầu cần phải kiểm soát chặt chẽ hơn các thực phẩm này.
Từ các kết quả thu được, nhận thấy phương pháp HPLC là tối ưu hóa trong việc xác định anthocyanin trong các thực phẩm chức năng và phương pháp HPTLC được lựa chọn để định tính, phát hiện nhanh anthocyanin trong các mẫu chế phẩm khi cần tiến hành kiểm tra .
KIẾN NGHỊ
- Hai phương pháp trên cho kết quả xác định anthocyanin có độ tin cậy cao. Cần tiếp tục mở rộng nghiên cứu trên các đối tượng khác ngoài viên nang và dạng dung dịch như: các loại trà thảo dược dạng lỏng, dạng túi, dạng bột, một số loại thuốc, trong máu, nước tiểu...
- Nghiên cứu này chỉ thực hiện trên một đối tượng mẫu là thực phẩm chức năng mà còn rất nhiều các đối tượng mẫu khác chứa anthocyanin mà nghiên cứu chưa đề cập tới. Vì vậy, cần tiếp tục nghiên cứu sâu hơn, tìm ra phương pháp xác định hàm lượng anthocyanin trên nhiều đối tượng mẫu khác.
- Phương pháp này tiến hành trên anthocyanin dạng aglycon. Ngoài ra, anthocyanin còn rất nhiều dưới dạng glycoside. Do đó, cần mở rộng ngiên cứu trên anthocyanin dạng glycoside trên nhiều đối tượng khác nhau.
TÀI LIỆU THAM KHẢO A. Tiếng Việt
1. Trần Tử An (2010), "Kiểm nghiệm dược phẩm", Nhà xuất bản Y học, Hà Nội. 2. Trần Tử An (2007), "Hóa phân tích- tập 2", Nhà xuất bản Y học, Hà Nội. 3. Võ Thị Bạch Huệ (2007), Hóa Phân Tích.
4. Huỳnh Thị Thanh Huyền (2011), "Anthocyanin và những nguyên liệu chứa Anthocyanin", luận văn thạc sỹ, Trường Đại học Kỹ thuật Công Nghệ tp HCM, 5. Phạm Luận (2010), "Cơ sở lý thuyết sắc ký lỏng hiệu năng cao", khoa Hóa học,
Trường ĐHKHTN Hà Nội.
6. Trần Cao Sơn (2010), "Thẩm định phương pháp trong phân tích hóa học & vi sinh vật", Nxb Khoa Học và Kỹ Thuật.
B. Tiếng Anh
7. Ajaz Ahmad, M Mujeeb, Bibhu Prasad Panda (2010), "An HPTLC Method for the Simultaneous Analysis of Compactin and Citrinin in Penicillium citrinum Fermentation Broth", Journal of Planar Chromatography-modern TLC, 23(4), pp. 282–285.
8. Fulcrand. 11. et al (1996), "Structure of new anthocyanin-derived wine pigments", J. Chem. Soc. Perkin Trans, pp. 735-739.
9. S. A. Borman (1982), "HPTLC: taking off", Anal. Chem, 54, pp. 790A-794A. 10.Tibo Cserhati (2007), "Liquid Chromatography of Natural Pigment and Synthetic Dyes", journal of chromatography library, 71, pp. 63 - 349.
11. Dolores Müller, Markus Schantz, and Elke Richling (2012), "High Performance Liquid Chromatography Analysis of Anthocyanins in Bilberries (Vaccinium