Dựa theo các tài liệu tham khảo [10], [16], [17] chúng tôi khảo sát điều kiện chạy HPTLC như sau:
Pha tĩnh: HPTLC Silica gel 60 F254 (10mm × 20mm) Pha động: chúng tôi khảo sát với các pha động sau đây:
Bảng 2.3: Danh mục các pha động HPTLC khảo sát
Thành phần và tỷ lệ pha động
Pha động 1 n–butanol: acid acetic: nước (4:1:5; v/v/v)
Pha động 2 Chloroform: methanol: nước (25:10:1,1; v/v/v)
Pha động 3 Ethyacetate: 2–butanol: aicd formic: nước
(7:3:0,8:1,2; v/v/v/v)
Pha động 4 Ethyacetate: aicd formic: nước (10:2:3; v/v/v)
- Tiến hành quét phổ ở bước sóng 490-550. - Bước sóng phát hiện là 520µm.
- Thể tích tiêm mẫu: 5µL
- Thể tích dung môi bão hòa: 25ml; dung môi khai triển: 10ml. - Thời gian bão hòa dung môi: 20 phút.
- Thời gian bão hòa bản mỏng: 5 phút. - Thời gian sấy khô bản mỏng: 5 phút.
- Khoảng cách dịch chuyển của pha động: 80 mm
- Dung dịch chuẩn gốc Cyanidin chlorid 100 µg/mL: Bảo quản trong tủ lạnh.
26
- Dung dịch chuẩn làm việc: hút chính xác 1mL dung dịch chuẩn gốc vào bình đinh mức 10mL, thêm methanol vừa đủ (dung dịch chuẩn làm việc có nồng độ Cyanindin 10 µg/mL).
- Các dung dịch chuẩn Cyanidin có nồng độ nhỏ hơn được pha từ dung dịch chuẩn gốc.
- Dung dịch Bilberry: bảo quản ở nhiệt độ lạnh.
- Pha pha động: sử dụng các dụng cụ hóa chất dùng cho HPLC để pha pha động có thành phần và tỷ lệ như bảng 2.3 trên.
2.4.3. Khảo sát điều kiện xử lý mẫu
Dựa khả năng hòa tan của Anthocyanin và tham khảo nhiều bài báo [22], [25], [28], nghiên cứu, chúng tôi khảo sát khả năng chiết Anthocyanin từ nền mẫu bằng cách thủy phân mẫu ở nhiệt độ 800C với thời gian 30 phút, 60 phút, 90 phút, 120 phút, 150 phút, 180 phút bằng hỗn hợp dung môi sau đây: methanol acid hóa bằng HCl 2N với các tỷ lệ như sau [16], [18]:
Methanol: HCl 2N: 90:10; 80:20; 70:30; 60:40.
Quy trình chiết Anthocyanin cho đối tượng phân tích là thực phẩm chức năng dạng nang cứng và nang mềm dự kiến gồm các bước sau:
- Xác định khối lượng trung bình thuốc trong nang, đồng nhất mẫu.
- Cân chính xác một lượng mẫu sau khi đồng nhất (cân 1 lượng tương đương với khối lượng 2 viên) vào ống ly tâm 50 mL.
- Thêm khoảng 10 mL dung môi chiết vào ống ly tâm.
- Lắc xoáy ống ly tâm 5 - 10 phút, sau đó lắc siêu âm 15 - 30 phút ở nhiệt độ phòng.
- Thủy phân ở nhiệt độ 800C với hỗn hợp dung môi methanol: HCl 2N (80:20) - Ly tâm 5 phút, tốc độ 6000 vòng/phút
- Gạn lấy phần dịch, định mức 10 mL bằng cùng dung môi và lọc qua màng lọc 0,45 µm.
27
Quy trình chiết Anthocyanin cho đối tượng phân tích là thực phẩm chức năng dạng dung dịch dự kiến gồm các bước sau: tương tự các bước đối với thực phẩm chức năng dạng viên nén, nang mềm và nang cứng nhưng thêm bước cuối làm sạch và làm giầu mẫu bằng phương pháp chiết pha rắn (SPE C18) như sau:
- Hoạt hóa cột: Lần lượt bằng các dung môi 6mL methanol, 6mL nước cất - Nạp dịch lên cột: tốc độ không quá 2 ml/phút
- Rửa, loại tạp chất: 6mL nước cất
- Rửa lấy dịch: 2 mL methanol/lần × 2 lần.
- Chạy máy HPTLC, HPLC (pha loãng nếu cần).