Thành phần pha động ảnh hướng rất nhiều tới quá trình tách sắc ký. Pha động khác nhau sẽ có độ phân cực khác nhau. Dựa vào các bài báo tham khảo [15], [20], [30], chúng tôi chọn pha động chạy với chế độ gradient nồng độ với pha động A và B như sau:
STT Pha động (A) Pha động (B) Chƣơng
trình chạy
1 Methanol – Acid Formic
Methanol hoặc
Acetonitril Gradient 2 Methanol – TFA
3 Methanol - TCA
24
- Pha tĩnh: dựa vào các tài liệu tham khảo chúng tôi chọn pha tĩnh là cột C18 Symmetry Waters (250mm x 4,6mm; 5µm.)
- Pha động: khảo sát chế độ gradient nồng độ với các pha động sau:
Bảng 2.2: Danh mục các pha động HPLC khảo sát
Thành phần pha động (%) Chế độ chạy máy
A B
Pha động 1 0,1% acid Formic (pH 3,0) Methanol
Gradient
Pha động 2 0,1% acid Formic, 1% THF (pH 2,5) Acetonitril
Pha động 3 2%TCA, 1%Amoniacetate, 2%
THF (pH 2,5) Methanol
Pha động 4 2%TCA, 1%Amoniacetate, 2%
THF (pH 2,5) Acetonitril
- Tốc độ dòng: Dựa trên nhiều bài báo nghiên cứu [11], [15], [30], chúng tôi lựa chọn với tốc độ dòng 1 mL/phút.
- Thể tích tiêm mẫu: 50 µL.
- Detector: PDA quét dải phổ từ bước sóng 190 nm đến 800 nm.
- Bước sóng phát hiện: 520 nm (do Anthocyanin có bước sóng hấp thụ cực đại là 520 nm) [15], [30], [32].
- Nhiệt độ cột: 400C [28].
- Dung dịch chuẩn gốc Cyanidin chlorid 100 µg/mL: Bảo quản trong tủ lạnh.
- Dung dịch chuẩn làm việc: hút chính xác 1 ml dung dịch chuẩn gốc vào bình định mức 10ml, thêm methanol vừa đủ (dung dịch chuẩn làm việc có nồng độ Cyanidin 10 µg/mL
- Các dung dịch chuẩn Cyanidin có nồng độ nhỏ hơn được pha từ dung dịch chuẩn gốc.
25
- Dung dịch pha động A (pH 2,5): cân chính xác 2,5 g muối amoniacetate, 5g trichloroacetic acid hòa tan vào khoảng 400 mL nước cất 2 lần, thêm nước vừa đủ 2,5L và điều chỉnh đến pH 2,5 bằng dung dịch acid trichloroacetic 4%, thêm 50mL tetrahydrofuran, lọc qua màng lọc 0,2 µm.
