Khảo sát các điều kiện phân tích anthocyanin bằng HPLC

Một phần của tài liệu Xây dựng quy trình định lượng anthocyanin trong thực phẩm chức năng bằng phương pháp HPLC và HPTLC (Trang 31)

Thành phần pha động ảnh hướng rất nhiều tới quá trình tách sắc ký. Pha động khác nhau sẽ có độ phân cực khác nhau. Dựa vào các bài báo tham khảo [15], [20], [30], chúng tôi chọn pha động chạy với chế độ gradient nồng độ với pha động A và B như sau:

STT Pha động (A) Pha động (B) Chƣơng

trình chạy

1 Methanol – Acid Formic

Methanol hoặc

Acetonitril Gradient 2 Methanol – TFA

3 Methanol - TCA

24

- Pha tĩnh: dựa vào các tài liệu tham khảo chúng tôi chọn pha tĩnh là cột C18 Symmetry Waters (250mm x 4,6mm; 5µm.)

- Pha động: khảo sát chế độ gradient nồng độ với các pha động sau:

Bảng 2.2: Danh mục các pha động HPLC khảo sát

Thành phần pha động (%) Chế độ chạy máy

A B

Pha động 1 0,1% acid Formic (pH 3,0) Methanol

Gradient

Pha động 2 0,1% acid Formic, 1% THF (pH 2,5) Acetonitril

Pha động 3 2%TCA, 1%Amoniacetate, 2%

THF (pH 2,5) Methanol

Pha động 4 2%TCA, 1%Amoniacetate, 2%

THF (pH 2,5) Acetonitril

- Tốc độ dòng: Dựa trên nhiều bài báo nghiên cứu [11], [15], [30], chúng tôi lựa chọn với tốc độ dòng 1 mL/phút.

- Thể tích tiêm mẫu: 50 µL.

- Detector: PDA quét dải phổ từ bước sóng 190 nm đến 800 nm.

- Bước sóng phát hiện: 520 nm (do Anthocyanin có bước sóng hấp thụ cực đại là 520 nm) [15], [30], [32].

- Nhiệt độ cột: 400C [28].

- Dung dịch chuẩn gốc Cyanidin chlorid 100 µg/mL: Bảo quản trong tủ lạnh.

- Dung dịch chuẩn làm việc: hút chính xác 1 ml dung dịch chuẩn gốc vào bình định mức 10ml, thêm methanol vừa đủ (dung dịch chuẩn làm việc có nồng độ Cyanidin 10 µg/mL

- Các dung dịch chuẩn Cyanidin có nồng độ nhỏ hơn được pha từ dung dịch chuẩn gốc.

25

- Dung dịch pha động A (pH 2,5): cân chính xác 2,5 g muối amoniacetate, 5g trichloroacetic acid hòa tan vào khoảng 400 mL nước cất 2 lần, thêm nước vừa đủ 2,5L và điều chỉnh đến pH 2,5 bằng dung dịch acid trichloroacetic 4%, thêm 50mL tetrahydrofuran, lọc qua màng lọc 0,2 µm.

Một phần của tài liệu Xây dựng quy trình định lượng anthocyanin trong thực phẩm chức năng bằng phương pháp HPLC và HPTLC (Trang 31)

Tải bản đầy đủ (PDF)

(72 trang)