Xác định collagen trong một số chế phẩm thực phẩm chức năng bằng phương pháp HPLC

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI VŨ THỊ TRÀ XÁC ĐỊNH COLLAGEN TRONG MỘT SỐ CHẾ PHẨM THỰC PHẨM CHỨC NĂNG BẰNG PHƯƠNG PHÁP HPLC KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ Người hướng dẫn: 1.. Cho

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

VŨ THỊ TRÀ

XÁC ĐỊNH COLLAGEN TRONG MỘT SỐ CHẾ PHẨM THỰC PHẨM CHỨC NĂNG BẰNG PHƯƠNG PHÁP HPLC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

HÀ NỘI - 2015

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

VŨ THỊ TRÀ

XÁC ĐỊNH COLLAGEN TRONG MỘT SỐ CHẾ PHẨM THỰC PHẨM CHỨC NĂNG BẰNG PHƯƠNG PHÁP HPLC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

Người hướng dẫn:

1 TS Lê Đình Chi

2 TS Lê Thị Hồng Hảo

Nơi thực hiện:

1 Bộ môn hóa phân tích và độc chất

2 Viện Kiểm nghiệm an toàn vệ sinh thực phẩm quốc gia

HÀ NỘI - 2015

TS Lê Đình Chi, bộ môn Hóa phân tích và Độc chất, đại học Dược Hà Nội Thầy

đã dành nhiều thời gian và tâm huyết để hướng dẫn, chỉ bảo, truyền đạt kiến thức và kinh nghiệm cho tôi trong suốt quá trình thực hiện khóa luận

TS Lê Thị Hồng Hảo, viện Kiểm nghiệm an toàn vệ sinh thực phẩm quốc gia đã

giao và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi thực hiện đề tài này

ThS Vũ Thị Kim Oanh, ThS Vũ Thị Trang cùng toàn thể các anh chị trong labo

Hóa độc đã luôn luôn nhiệt tình hướng dẫn, chỉ bảo động viên tôi trong suốt quá trình thực hiện tại Viện

Các thầy cô trong trường, đặc biệt là các thầy cô bộ môn Hóa phân tích và Độc chất,

đã trang bị cho tôi những kiến thức quý giá và cần thiết để có thể tham gia nghiên cứu

Tôi cũng xin chân thành cảm ơn gia đình, bạn bè đã ở bên, quan tâm động viên tôi Mặc dù đã có cố gắng, nghiên cứu của tôi còn nhiều thiếu sót và hạn chế do kiến thức và kỹ năng còn chưa được đầy đủ Rất mong nhận được những nhận xét, góp ý

từ thầy cô, anh chị và các bạn để khóa luận này được hoàn thiện hơn Xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, tháng 5 năm 2015 Sinh viên

Vũ Thị Trà

MỤC LỤC

LỜI NÓI ĐẦU 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 2

1.1 Giới thiệu về thực phẩm chức năng 2

1.1.1 Khái niệm thực phẩm chức năng 2

1.1.2 Phân loại thực phẩm chức năng 2

1.1.3 Quản lý thực phẩm chức năng 3

1.2 Collagen 3

1.2.1 Định nghĩa 3

1.2.2 Thành phần collagen 4

1.2.3 Cấu trúc collagen 4

1.2.4 Ứng dụng của collagen 5

1.2.5 Các phương pháp xác định collagen 7

1.2.6 Nguyên tắc xác định collagen thông qua hydroxyprolin 9

1.3 Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) 11

1.3.1 Định nghĩa 11

1.3.2 Một số khái niệm cơ bản trong sắc ký 12

1.3.3 Pha tĩnh trong sắc ký lỏng 13

1.3.4 Pha động trong sắc ký lỏng 14

1.3.5 Detector trong sắc ký lỏng 14

1.4 Thẩm định phương pháp phân tích 15

1.4.1 Tính đặc hiệu, chọn lọc 15

1.4.2 Khoảng tuyến tính 16

1.4.3 Giới hạn phát hiện (LOD) 16

1.4.4 Giới hạn định lượng (LOQ) 17

1.4.5 Độ chính xác (độ đúng và độ chụm) 17

1.4.6 Độ thu hồi 18

1.4.7 Tính phù hợp của hệ thống 18

CHƯƠNG 2 NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19

2.1 Đối tượng, mục tiêu nghiên cứu 19

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 19

2.1.2 Mục tiêu nghiên cứu 19

2.2 Thiết bị, dụng cụ và hoá chất 19

2.2.2 Dụng cụ 19

2.2.3 Hóa chất 19

2.3 Phương pháp nghiên cứu 20

2.3.1 Lấy mẫu 20

2.3.2 Xử lý và tạo dẫn xuất mẫu 20

2.3.3 Xây dựng quy trình phân tích hydroxyprolin bằng phương pháp HPLC 22

2.3.4 Thẩm định quy trình HPLC 22

2.3.6 Đánh giá kết quả 22

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 23

3.1 Tối ưu các điều kiện xác định collagen bằng phương pháp HPLC 23

3.1.1 Khảo sát quá trình thủy phân mẫu 23

3.1.2 Khảo sát điều kiện dẫn xuất 26

3.1.3 Khảo sát điều kiện phân tích HPLC 29

3.2 Đánh giá phương pháp phân tích 34

3.2.1 Đánh giá độ đặc hiệu, chọn lọc 34

3.2.2 Xây dựng khoảng tuyến tính 36

3.2.3 Sự phù hợp hệ thống 37

3.2.4 Xác định giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng (LOD, LOQ) 37

3.2.5 Độ đúng 38

3.2.6 Độ lặp lại 40

3.3 Kết quả phân tích mẫu thực 41

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 435

DANH MỤC KÝ HIỆU VÀ TỪ VIẾT TẮT

6-aminoquinolyl-N-hydroxy succinimidyl

hydroxy succinimidyl

Sulfonyl Chloride

Dimethylaminoazobenzen Sulfonyl Chlorid

Methyloxycarbonyl Chloride

Chromatography

Sắc ký lỏng hiệu năng cao

Pure And Applied Chemistry

Liên minh Quốc tế về hóa học thuần túy và hóa học ứng dụng

tandem mass spectrometry

Sắc ký lỏng ghép khối phổ hai lần

RSD Relative standard devition Độ lệch chuẩn tương đối

UV-VIS Ultraviolet - Visible Tử ngoại- khả kiến

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1 1 Một số phương pháp xác định collagen 8

Bảng 3 1 Khảo sát nồng độ acid 23

Bảng 3 2 Khảo sát nhiệt độ thủy phân 24

Bảng 3 3 Khảo sát thời gian thủy phân 25

Bảng 3 4 Khảo sát nhiệt độ dẫn xuất 27

Bảng 3 5 Khảo sát thời gian dẫn xuất 28

Bảng 3 6 Các điều kiện tối ưu thủy phân và tạo dẫn xuất mẫu 29

Bảng 3 7 Các chế độ gradient 31

Bảng 3 8 Sự phụ thuộc của diện tích pic sắc ký vào nồng độ hydroxyprolin 36

Bảng 3 9 Kết quả đánh giá độ phù hợp hệ thống 37

Bảng 3 10 Xác định giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng 38

Bảng 3 11 Khảo sát độ thu hồi 39

Bảng 3 12 Khảo sát độ chụm 40

Bảng 3 13 Kết quả phân tích mẫu thực 41

DANH MỤC HÌNH

Hình 1 1 Collagen: protein dạng sợi 4

Hình 1 2 Cấu trúc xoắn ba của collagen 4

Hình 1 3 Hình ảnh ba bậc cấu trúc của collagen 5

Hình 1 4 Một số chế phẩm có chứa collagen 7

Hình 1 5 Cấu trúc phân tử hydroxyprolin 9

Hình 1 6 Sơ đồ máy HPLC 11

Hình 1 7 Quá trình sắc ký 12

Hình 2 1 Quy trình xử lý và tạo dẫn xuất mẫu 21

Hình 3 1 Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc hàm lượng collagen thu được vào nồng độ acid thủy phân 24

Hình 3 2 Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc của hàm lượng collagen thu được vào nhiệt độ thủy phân 25

Hình 3 3 Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc của nồng độ collagen thu được vào thời gian thủy phân 26

Hình 3 4 Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc của diện tích pic thu được vào nhiệt độ dẫn xuất 27

Hình 3 5 Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc của diện tích pic thu được vào thời gian dẫn xuất 28

Hình 3 6 Sắc ký đồ khảo sát lựa chọn detector với detector UV (A) và detector huỳnh quang (B) 30

Hình 3 7 Sắc ký đồ của dung dịch hydroxyprolin thu được với chương trình gradient 1(A), 2(B), 3(C) và 4(D) 33

Hình 3 8 Quy trình phân tích collagen trong chế phẩm thực phẩm chức năng bằng phương pháp HPLC 34

Hình 3 9 Sắc ký đồ đánh giá độ đặc hiệu, chọn lọc 35

Hình 3 10 Sự phụ thuộc của diện tích pic sắc ký vào nồng độ hydroxyprolin 36

LỜI NÓI ĐẦU

Ngày nay, khi mức sống của con người không ngừng được cải thiện, nhu cầu nâng cao chất lượng cuộc sống ngày càng được quan tâm Chăm sóc sức khỏe và làm đẹp là những nhu cầu như vậy, đặc biệt là đối với phụ nữ Người ta bắt đầu tìm đến những dịch vụ, sản phẩm giúp chăm sóc sức khỏe và làm đẹp nhanh hơn, tốt hơn, tiện dụng hơn Chính vì thế, thực phẩm chức năng (TPCN) là một trong những lựa chọn đầu tiên của nhiều người

Gần đây, một trong những thành phần hay được sử dụng trong nhiều nhóm sản phẩm khác nhau là collagen Trong đó, nhiều sản phẩm thực phẩm chức năng chứa collagen hiện đang lưu hành trên thị trường như Collagen Tây Thi, Nippi, My Vita Collagen,… Collagen là một loại protein chiếm 70% cấu trúc da, phân bố chủ yếu ở lớp hạ bì của da, có vai trò quan trọng với sức khỏe, đặc biệt là với làn da, mạch máu, xương khớp, mắt [11] … Chính vì tác dụng rất lớn của collagen mà nhiều nhà sản xuất đã lạm dụng nó trong các sản phẩm của mình hoặc làm giả, làm nhái các sản phẩm có chứa collagen Do vậy, cần phải có phương pháp phân tích phù hợp để xác định hàm lượng collagen trong các sản phẩm trên thị trường

Cho tới nay đã có khá nhiều phương pháp xác định collagen trong các đối tượng khác nhau như sắc ký lỏng hiệu năng cao các loại, tạo màu đo quang,…Tuy nhiên, mỗi phương pháp có những nhược điểm nhất định như quy trình xử lý phức tạp, dẫn xuất kéo dài, tốn kém, khó áp dụng vào điều kiện tại Việt Nam…Do đó chúng tôi thực hiện đề tài “Xác định collagen trong một số chế phẩm thực phẩm chức năng bằng phương pháp HPLC” nhằm đáp ứng được một phần những yêu cầu kiểm nghiệm

Mục tiêu của nghiên cứu:

+ Thiết lập quy trình định lượng hydroxyprolin thu được khi thủy phân collagen, qua đó xác định hàm lượng collagen trong TPCN

+ Ứng dụng phương pháp đã xây dựng để xác định hàm lượng collagen trong một

số mẫu TPCN

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 1.1 Giới thiệu về thực phẩm chức năng

1.1.1 Khái niệm thực phẩm chức năng

Hiện nay, vẫn chưa có một định nghĩa duy nhất nào của TPCN được công nhận trên toàn thế giới Theo Viện khoa học và đời sống quốc tế (International Life Science Institute - ILSI) thì "thực phẩm chức năng là thực phẩm có lợi cho một hay nhiều hoạt động của cơ thể như cải thiện tình trạng sức khoẻ và làm giảm nguy cơ mắc bệnh hơn là so với giá trị dinh dưỡng mà nó mang lại" Theo IFIC, thực phẩm chức năng là những thực phẩm hay thành phần của chế độ ăn có thể đem lại lợi ích cho sức khoẻ nhiều hơn giá trị dinh dưỡng cơ bản [18]

Theo định nghĩa của Hiệp hội thực phẩm chức năng Việt Nam thì: thực phẩm chức năng là thực phẩm (hay sản phẩm) có tác dụng hỗ trợ (phục hồi, duy trì hoặc tăng cường) chức năng của các bộ phận trong cơ thể, có hoặc không tác dụng dinh dưỡng, tạo cho cơ thể tình trạng thoải mái, tăng sức đề kháng và giảm bớt nguy cơ bệnh tật

Bộ Y tế Việt Nam trong thông tư “Hướng dẫn quản lý sản phẩm thực phẩm chức năng” dự thảo 15 ngày 19/11/2012 định nghĩa “Thực phẩm chức năng là thực phẩm dùng để hỗ trợ chức năng của cơ thể con người, tạo cho cơ thể tình trạng thoải mái, tăng sức đề kháng, giảm bớt nguy cơ mắc bệnh, bao gồm thực phẩm bổ sung, thực

phẩm bảo vệ sức khoẻ, thực phẩm dinh dưỡng y học”

Như vậy, có thể thấy có rất nhiều định nghĩa về thực phẩm chức năng nhưng nhìn chung đều có các đặc điểm chung: là thực phẩm hoặc sản phẩm dùng để hỗ trợ, phục hồi chức năng của các bộ phận trong cơ thể, giúp cơ thể tăng cường đề kháng, giảm bớt nguy cơ bệnh tật

1.1.2 Phân loại thực phẩm chức năng

Có nhiều cách để phân loại thực phẩm chức năng, cách phổ biến thường được sử dụng là phân loại theo tác dụng của chúng Theo cách phân loại này thì thực phẩm chức năng bao gồm các nhóm sau:

• Nhóm bổ sung vitamin và khoáng chất

• Nhóm thực phẩm chức năng “không béo”, “không đường”, “giảm năng lượng”

• Nhóm các loại nước giải khát, tăng lực

• Nhóm thực phẩm giàu chất xơ tiêu hóa

• Nhóm các chất tăng cường chức năng đường ruột

• Nhóm thực phẩm chức năng đặc biệt, bao gồm thức ăn cho phụ nữ có thai, người cao tuổi, vận động viên, phi hành gia, người đái đường, cao huyết áp,…

1.1.3 Quản lý thực phẩm chức năng

Theo Thông tư quy định về quản lý thực phẩm chức năng của Bộ Y tế ban hành ngày 24/11/2014 [1], TPCN cần đạt các yêu cầu sau:

+ Công bố hợp quy và phù hợp quy định an toàn thực phẩm

+ Yêu cầu về báo cáo thử nghiệm hiệu quả về công dụng

+ Yêu cầu kiểm nghiệm

+ Yêu cầu đối với ghi nhãn thực phẩm chức năng

+ Quảng cáo thực phẩm chức năng

TPCN cần đạt các yêu cầu về điều kiện sản xuất, kinh doanh và hướng dẫn sử dụng TPCN

1.2 Collagen

1.2.1 Định nghĩa

Collagen là một loại protein được tìm thấy ở động vật, đặc biệt là trong các mô thịt

và mô liên kết của động vật có vú Nó là thành phần chính của mô liên kết và là loại protein có nhiều nhất trong các loài động vật có vú, chiếm khoảng 25% đến 35% protein cơ thể Collagen chủ yếu được tìm thấy trong các mô xơ như dây chằng, gân và da, và cũng có nhiều trong giác mạc, sụn, xương, mạch máu, ruột, và đĩa đệm [17]

Hình 1 1 Collagen: protein dạng sợi [20]

300 nm, đường kính 1,5 nm Ba chuỗi này là 3 chuỗi α, mỗi chuỗi đều được sắp xếp theo một đường xoắn ốc phía tay trái [7], [10]

Hình 1 2 Cấu trúc xoắn ba của collagen

Hình 1 3 Hình ảnh ba bậc cấu trúc của collagen

Ba xoắn tay trái được xoắn lại với nhau thành một cuộn dây cuộn thuận tay

phải, ổn định bằng nhiều liên kết hydro Một đặc điểm đặc trưng của collagen là sự

sắp xếp đều đặn của các amino acid trong mỗi mắt xích của từng chuỗi xoắn ốc

collagen này Thông thường các chuỗi theo mẫu Gly-Pro-Y hoặc Gly-X-Hyp, ở đây

X và Y là các acid amin còn lại [10]

1.2.4 Ứng dụng của collagen

Collagen là một loại vật liệu đa năng, được sử dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực

1.2.4.1 Ứng dụng trong công nghiệp

Ngày nay, collagen được ứng dụng trong nhiều ngành công nghiệp khác nhau:

- Trong công nghiệp thực phẩm: collagen được sử dụng như chất đông, chất

gây lắng trong thực phẩm, dùng làm vỏ bao xúc xích, màng bọc kẹo,

nguyên liệu sản xuất một số thực phẩm dinh dưỡng,…Collagen hydrolysate

được sử dụng nhằm ngăn chặn sự mất nước trong các sản phẩm phomat, tạo

độ dẻo, dai, mềm trong kẹo dẻo; làm chất tạo gel, chất kết dính, tạo xốp

trong kẹo mứt,…

- Collagen được dùng thay thế cao su, keo dán, xi măng, là chất tạo kết dính

trong diêm quẹt Chúng được dùng trong bộ lọc sáng cho đèn thủy ngân

1.2.4.2 Ứng dụng trong y học và dược phẩm

Collagen có thể được lấy từ nhiều nguồn khác nhau như da trâu, bò, lợn, gân, ruột động vật nhưng vẫn được sử dụng rộng rãi như một loại nguyên liệu y khoa [13], [17]

- Màng collagen được sử dụng trong nha chu và các liệu pháp cấy ghép như những rào cản để ngăn chặn sự di chuyển của biểu mô tế bào

- Bác sỹ da liễu và phẫu thuật thẩm mỹ sử dụng collagen để tăng thêm mô mềm, sửa chữa vết sẹo, làm mịn da, giảm nếp nhăn

- Với bệnh nhân bỏng, phong, collagen được sử dụng để bảo vệ bề mặt da Collagen đang được dùng rộng rãi để thay thế da nhân tạo, được sử dụng trong việc chữa trị bỏng nặng Collagen có thể được sử dụng trực tiếp hoặc

sử dụng kết hợp với silicon, glycosaminoglycan, nguyên bào sợi, các yếu tố tăng trưởng và các chất khác

- Collagen có thể ứng dụng trong tái tạo mạch máu, tái sinh dây thần kinh ngoại biên

1.2.4.3 Ứng dụng collagen trong mỹ phẩm

Mỹ phẩm là một trong những ứng dụng quan trọng của collagen và do tính chất đặc biệt của lĩnh vực này, việc kiểm soát collagen trong các loại mỹ phẩm cần phải được thực hiện nghiêm ngặt

- Collagen là một chất giữ ẩm tự nhiên hiệu quả do tác dụng hydrat hóa mạnh

mẽ, sâu rộng bao quanh phân tử, liên kết chặt chẽ với bề mặt da Trong mô, phân tử collagen là liên kết ngang để tạo thành một mạng lưới mở rộng, làm tăng sức mạnh và độ bền cho mô

- Khi được sử dụng trong mỹ phẩm, có một số trường hợp collagen gây phản

ứng dị ứng kéo dài, tuy nhiên, điều này có thể giảm thiểu được bằng cách thử nghiệm ở một vùng da nhỏ trước khi sử dụng trên diện rộng Mặc dù khó hấp thụ qua da, collagen đang được sử dụng như một thành phần chính cho một

số mỹ phẩm dùng qua da

Hình 1 4 Một số chế phẩm có chứa collagen

1.2.5 Các phương pháp xác định collagen

Có nhiều phương pháp để xác định collagen

Hướng phổ biến nhất là xác định collagen thông qua hydroxyprolin (mục 1.2.6 – Nguyên tắc xác định collagen thông qua hydroxyprolin), do đó để xác định collagen cần xác định được lượng hydroxyprolin

Nguyên tắc chung là thủy phân collagen trong điều kiện thích hợp, sau đó định lượng hydroxyprolin giải phóng ra sau quá trình thủy phân Từ lượng hydroxyprolin cho phép suy ra lượng collagen có trong mẫu Quá trình định lượng hydroxyprolin có thể được thực hiện bằng phương pháp tạo màu đo quang [14], tạo dẫn xuất để phân tích bằng HPLC sử dụng detector UV hay huỳnh quang [12], [30] hoặc phân tích trực tiếp bằng LC-MS/MS [28]

Tuy nhiên, vì lượng collagen trong mẫu TPCN thường tương đối lớn, sử dụng MS/MS phải pha loãng nhiều dễ gây sai số, điều kiện trang thiết bị không sẵn có ở

LC-đa số phòng thí nghiệm, nên trong nghiên cứu này chúng tôi lựa chọn phương pháp tạo dẫn xuất để phân tích trên hệ thống HPLC thông dụng với detector UV-VIS hoặc huỳnh quang

Bảng 1 1 Một số phương pháp xác định collagen

STT Phương

pháp

Đối tượng phân tích Quy trình Điều kiện phân tích

Làm nhỏ, thủy phân mẫu, tạo dẫn xuất với thuốc thử Ehrlich, đo quang

+ Hóa chất: đệm (natri pyrophosphat, kali borat), alanin, chloramin T, natri thiosulfat, thuốc thử Ehrlich + pH tối ưu: 8,0-8,5

+ Dẫn xuất: FMOC, ADAM, OPA

+ Pha động: A: dung dịch đệm acid phosphoric 100mM, B:100% ACN

+ Tốc độ dòng pha động: 2ml/phút

+ Thể tích tiêm: 10 µl + Detector huỳnh quang, Ex:

260 nm, Em: 310nm + Cột C18 4,6×150 mm, 5 µm

+ Pha động: A (NaH2PO4 40mM

pH 7,8), B (ACN:MeOH:H2O 45:45:10 v/v/v)

+ Cột C18 250×4 mm, 5 µm Tốc độ dòng pha động: 2 mL/phút, nhiệt độ cột: 400 C + Detector UV, bước sóng phát hiện 338 nm

4

HPLC sử

dụng dẫn

xuất DABS-Cl

[29]

Thịt, cơ, gân

Làm nhỏ, thủy phân mẫu, tạo dẫn xuất với thuốc thử DABS-Cl, chạy sắc ký

+ Cột C8 125×4mm, hạt 5µm, tốc độ dòng pha động: 1ml/phút + Pha động: KH2PO4 0,01M: ACN 65:35

5

Xác định

collagen sử

dụng HPLC-MS/MS [38]

Collagen thương mại, da,

cơ chuột

Xử lý mẫu, tạo dẫn xuất, chạy HPLC-MS/MS

+ Tốc độ dòng pha động: 0,25 ml/phút, thể tích tiêm: 40µl + Nhiệt độ cột: 250C

+ Detector hấp thụ UV: 214 nm + Pha động: A (nước/acid formic 100:0,03 v/v), B (ACN/acid fomic 100:0,025 v/v) + Cột C12 250×2mm, 4µm + Chế độ ion hóa: API-ESI sử dụng N2, nhiệt độ khí: 3500C, 25 psi

Ngoài ra còn 1 số phương pháp hóa lý khác xác định riêng cho collagen:

- Phương pháp phổ hồng ngoại

- Phổ UV- VIS

- Kiểm tra nhiệt độ biến tính

1.2.6 Nguyên tắc xác định collagen thông qua hydroxyprolin

1.2.6.1 Đặc điểm của hydroxyprolin

Hình 1 5 Cấu trúc phân tử hydroxyprolin

Danh pháp IUPAC: (2S,4R)-4-hydroxypyrrolidine-2-carboxylic acid

Công thức phân tử: C5H9NO3

Hydroxyprolin được hình thành qua quá trình hydroxyl hóa prolin bởi các enzyme prolyl hydroxylase Hydroxyprolin khác với prolin ở nhóm -OH ở vị trí Cγ

1.2.6.2 Vai trò của hydroxyprolin trong collagen

Hydroxyprolin là một acid amin bậc 2, là thành phần cấu tạo của collagen

Mỗi phân tử collagen có cấu trúc không gian hợp thành từ ba peptid Ba phân tử peptid được sắp xếp thành một cấu trúc xoắn ốc, được ổn định chủ yếu bởi liên kết hydro giữa các phần khác nhau [29] Hydroxyprolin và prolin đóng vai trò quan trọng trong sự ổn định collagen

Năm 1975, Darwin và cộng sự đã phát hiện nhóm OH của hydroxyprolin có vai trò chủ yếu trong việc ổn định vòng xoắn ba của collagen Chuỗi polypeptid collagen nếu thiếu hydroxyprolin thì có thể vẫn tạo thành xoắn ba ở nhiệt độ thấp nhưng không vững bền ở thân nhiệt Nghiên cứu trên peptid tổng hợp người ta đã chứng minh được rằng nếu mạch alpha chỉ chứa prolin, hydroxyprolin và glycin thì sẽ tạo xoắn ba rất vững bền [7]

1.2.6.3 Tỷ lệ hydroxyprolin/collagen

Hydroxyprolin là acid amin đặc trưng của collagen Hydroxyprolin không có trong bất kỳ một loại protein nào khác, ngoại trừ một lượng nhỏ trong elastin Do đó, có thể định lượng collagen thông qua định lượng hydroxyprolin

Lượng hydroxyprolin có trong các chế phẩm collagen từ các nguồn động vật có vú

đã được tìm thấy vào khoảng 13,4 ± 0,24% Hydroxyprolin có thể chuyển đổi tương đương sang collagen thông qua hệ số 7,46 Phần trăm collagen của mẫu có thể được tính như sau [24], [23]:

% collagen =microgam hydroxyprolin trong 1 ml dịch thủy phân

microgam mô cơ trong 1 ml dịch thủy phân × 7,46 × 100

1.3 Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)

1.3.1 Định nghĩa

Sắc ký (chromatography) là quá trình tách trong đó hỗn hợp mẫu được phân bố giữa hai pha, một pha đứng yên (pha tĩnh) trong khi pha còn lại (pha động) chuyển động qua pha tĩnh

Sắc ký lỏng hiệu năng cao (High Performance Liquid Chromatography – HPLC) là

kỹ thuật tách sắc ký trong đó các chất phân tích hòa tan trong pha động là chất lỏng

và di chuyển qua cột chứa các hạt pha tĩnh

Hình 1 6 Sơ đồ máy HPLC

Hình 1 7 Quá trình sắc ký [32]

Quá trình tách trong kỹ thuật HPLC là tổ hợp của nhiều quá trình vừa có tính chất hóa học vừa có tính chất lý học Nó là sự vận chuyển và phân bố lặp đi lặp lại nhiều lần liên tục của các chất tan Xi (hỗn hợp mẫu phân tích) theo từng lớp qua chất nhồi cột (pha tĩnh) từ đầu cột tách đến cuối cột tách Trong quá trình đó, chất tan Xi luôn được phân bố qua lại giữa hai pha, trong khi pha động luôn luôn chảy qua cột tách với một tốc độ nhất định hay gradient [3]

1.3.2 Một số khái niệm cơ bản trong sắc ký

Khi sử dụng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao cần chú ý những khái niệm sau

[6]:

Thời gian lưu:

Khoảng thời gian từ lúc bơm mẫu vào cột đến khi pic đến detector là thời gian lưu

tR Thời gian chết: thời gian tM của chất không lưu giữ (tốc độ di chuyển của nó bằng tốc độ di chuyển trung bình của các phần tử pha động)

Thời gian lưu hiệu chỉnh: tR’ = tR - tM

Hệ số phân bố K:

𝐾 = 𝐶𝑆

𝐶𝑀

⁄ Trong đó, CS, CM là nồng độ mol của chất tan trong pha tĩnh, pha động

K càng lớn, sự di chuyển của chất tan qua pha tĩnh càng chậm Các chất trong hỗn hợp có hệ số K khác nhau càng nhiều, khả năng tách diễn ra càng dễ dàng hơn

𝑡𝑅𝐵− 𝑡𝑀

𝑡𝑅𝐴− 𝑡𝑀

KB, KA lần lượt là hệ số phân bố của chất B, A (A là chất ra trước)

k’A,k’B tương ứng là hệ số dung lượng của chất A, B

tRA, tRB tương ứng là thời gian lưu của chất A, B

Hai chất A và B chỉ có thể tách được khỏi nhau nếu  > 1

Thường chọn α = 1,05 - 2 Nếu α quá lớn, thời gian phân tích kéo dài

1.3.3 Pha tĩnh trong sắc ký lỏng

Trong sắc ký lỏng, pha tĩnh (stationary phase) là chất nhồi cột làm nhiệm vụ tách hỗn hợp chất phân tích Đó là những chất rắn, xốp và kích thước hạt rất nhỏ Tùy theo bản chất của pha tĩnh, trong phương pháp sắc ký lỏng liên kết thường chia làm

2 loại: sắc ký lỏng pha thường (NP HPLC) và sắc ký lỏng pha đảo (RP HPLC)

Sắc ký lỏng pha thường: pha tĩnh có bề mặt là các chất phân cực (silica trần, silica được gắn các nhóm chức phân cực: NH2, CN,…) Sắc ký lỏng pha đảo: pha tĩnh trong sắc ký pha đảo sử dụng organochlorosilane với các nhóm R là gốc alkyl có mạch carbon dài, phổ biến nhất là n-octadecyl (C18) [2]

1.3.4 Pha động trong sắc ký lỏng

Pha động trong sắc ký lỏng là thành phần được cho qua cột liên tục để phân tách các hợp chất trong mẫu Có thể chia pha động làm 2 loại: pha động có độ phân cực cao và pha động có độ phân cực thấp

Pha động có độ phân cực cao: thường được dùng trong sắc ký pha đảo, thành phần chủ yếu là nước, nhiều trường hợp phải thêm dung môi để giảm độ phân cực Pha động có độ phân cực thấp: cyclopentan, n-pentan, n-heptan, n-hexan, toluen,…

Đối với sắc ký pha đảo, pha động đầu tiên sẽ có thành phần tương đối phân cực, giảm dần theo thời gian trong suốt quá trình phân tách Kỹ thuật thay đổi thành phần pha động như vậy được gọi là gradient nồng độ

1.3.5 Detector trong sắc ký lỏng

Là bộ phận phát hiện các chất trong pha động khi nó ra khỏi cột sắc ký liên tục Detector là bộ phận quan trọng quyết định độ nhạy của phương pháp Hiện có nhiều loại detector, nhưng thường sử dụng 6 loại detector thuộc hai nhóm quang học và điện hóa: detector hấp thụ UV-VIS, detector huỳnh quang, detector chỉ số khúc xạ, detector tán xạ bay hơi, detector đo dòng, detector độ dẫn Tùy thuộc bản chất lí hóa của chất phân tích mà lựa chọn detector cho phù hợp

Detector UV-VIS (Ultraviolet/visible detector) được dùng phổ biến nhất trong sắc

ký lỏng dựa trên sự hấp thụ bức xạ UV-VIS (trong khoảng 190-800 nm), áp dụng cho các chất có khả năng hấp thụ ánh sáng trong vùng tử ngoại (UV) hoặc vùng khả kiến (VIS)

Detector huỳnh quang (Fluorescence detector FLD) sử dụng để phát hiện các chất

có khả năng phát huỳnh quang Đối với những chất không có khả năng phát huỳnh quang, cần dẫn xuất chất phân tích, gắn nó với chất có khả năng phát huỳnh quang

hoặc chất phân tích phản ứng với thuốc thử tạo thành sản phẩm có khả năng phát huỳnh quang

Đối với detector hấp thu UV/VIS, sắc ký đồ được vẽ dựa trên sự thay đổi độ hấp thu theo thời gian Các loại detector hấp thu có giới hạn phát hiện từ 0,1 đến 1 ng chất phân tích Detector huỳnh quang chỉ chọn lọc đối với một số chất phân tích có khả năng phát huỳnh quang Sắc ký đồ được vẽ dựa trên sự thay đồi của cường độ huỳnh quang theo thời gian, giới hạn phát hiện của detector huỳnh quang từ 1 đến

* Cách xác định

So sánh đáp ứng tín hiệu với detector của chất phân tích trên 3 mẫu: mẫu trắng, mẫu chuẩn và mẫu thêm chuẩn Mẫu trắng không được cho tín hiệu của chất phân tích, mẫu thêm chuẩn phải cho tín hiệu chất phân tích tại thời gian lưu tương ứng thời gian lưu trên mẫu chuẩn

đó quan trọng nhất là bản chất của chất phân tích và kỹ thuật sử dụng

1.4.3 Giới hạn phát hiện (LOD)

Tính LOD: Tính giá trị trung bình xtb và độ lệch chuẩn SD

LOD = 3×SD

𝑆𝐷 = √∑(𝑥𝑖 − 𝑥𝑡𝑏)2

𝑛 − 1

⁄

Đánh giá LOD đã tính được: tính R= xtb/LOD

Nếu 4 < R < 10 thì nồng độ dung dịch thử là phù hợp và LOD tính được là đáng tin cậy

Nếu R < 4 thì phải dùng dung dịch thử đậm đặc hơn, hoặc thêm một ít chất chuẩn vào dung dịch thử đã dùng và làm lại thí nghiệm và tính lại R

Nếu R > 10 thì phải dùng dung dịch thử loãng hơn, hoặc pha loãng dung dịch thử đã dùng và làm lại thí nghiệm và tính lại R

1.4.4 Giới hạn định lượng (LOQ)

LOQ là nồng độ tối thiểu của một chất có trong mẫu thử mà ta có thể định lượng bằng phương pháp khảo sát và cho kết quả có độ chụm mong muốn

* Cách tính: Dựa trên đường chuẩn

Cách tính tương tự như trong phần LOD nhưng theo công thức: LOQ= 10×SD

1.4.5 Độ chính xác (độ đúng và độ chụm)

1.4.5.1 Độ chụm

Độ chụm dùng để chỉ mức độ gần nhau của các giá trị riêng lẻ xi của các phép đo lặp lại Nói cách khác, độ chụm được dùng để chỉ sự sai khác giữa các giá trị xi so với giá trị trung bình [4]

* Cách xác định

Tiến hành làm thí nghiệm lặp lại 10 lần (ít nhất 6 lần) trên cùng 1 mẫu, ở các nồng

độ khác nhau (trung bình, thấp, cao) trong khoảng làm việc Tính độ lệch chuẩn SD

và độ lệch chuẩn tương đối RSD hay hệ số biến thiên CV theo các công thức:

𝑆𝐷 = √∑(𝑥𝑖− 𝑥𝑡𝑏)2

𝑛 − 1

⁄𝑅𝑆𝐷% = 𝐶𝑉% = 𝑆𝐷 𝑥⁄ 𝑡𝑏× 100

1.4.6 Độ thu hồi

Thêm một lượng chất chuẩn xác định vào mẫu thử hoặc mẫu trắng, phân tích các

mẫu thêm chuẩn đó, làm lặp lại tối thiểu bốn lần bằng phương pháp khảo sát, tính

độ thu hồi theo công thức sau đây với mẫu thử:

𝑅% =(𝐶𝑚+𝑐− 𝐶𝑚)

𝐶𝑐

⁄ × 100 Trong đó: R%: Độ thu hồi

Cm+c, Cm: Nồng độ chất phân tích trong mẫu thêm chuẩn và trong mẫu thử

Cc: Nồng độ chuẩn thêm (lý thuyết)

Sau đó tính độ thu hồi chung là trung bình của độ thu hồi các lần làm lặp lại

1.4.7 Tính phù hợp của hệ thống

Là các phép thử để chứng minh rằng hệ thống hoạt động đúng theo mục đích sử

dụng Phép thử đánh giá sự phù hợp của hệ thống của các phương pháp sắc ký

được quy định theo nhiều tổ chức (USP, USFDA) như sau: Độ chụm của thời gian

lưu, diện tích pic sắc ký: Tiêm trực tiếp dung dịch chuẩn nhiều lần lặp lại vào hệ

thống sắc ký và xác định độ lệch chuẩn tương đối (RSD) Số lần bơm tối thiểu 5

lần phải cho RSD nhỏ hơn 2% Nếu RSD lớn hơn 2% cần sử dụng 6 điểm

CHƯƠNG 2 NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng, mục tiêu nghiên cứu

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu

Trong đề tài này, chúng tôi tiến hành nghiên cứu xác định collagen trong một số mẫu thực phẩm chức năng Mẫu dùng trong nghiên cứu được lấy tại Viện Kiểm nghiệm an toàn vệ sinh thực phẩm quốc gia, là các thực phẩm chức năng dưới các dạng bột, viên nang cứng và dạng lỏng

2.1.2 Mục tiêu nghiên cứu

- Tối ưu hóa các điều kiện xử lý mẫu

- Tối ưu hóa các điều kiện chạy máy HPLC để xác định collagen trong một số mẫu thực phẩm chức năng

- Đánh giá (thẩm định) phương pháp phân tích

- Ứng dụng phương pháp để xác định collagen trên một số mẫu thực tế

2.2 Thiết bị, dụng cụ và hoá chất

2.2.1 Thiết bị

- Hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC trang bị detector huỳnh quang

- Cột sắc ký C18 Supelco (150 mm × 4,6 mm, 5µm) và tiền cột tương ứng

2.2.2 Dụng cụ

- Cân kỹ thuật

- Cân phân tích Mettler Toledo có độ chính xác 0,0001 g và 0,00001 g

- Máy đo pH: pH Meter 744

- Ống đong, phễu, giấy lọc, màng lọc, ống ly tâm 15 ml, cốc có mỏ

- Autopipet loại 100 µl, 200 µl, 1000 µl, 5000 µl và các đầu côn tương ứng

- Vial loại 1,8 ml

- Bình định mức 50ml

2.2.3 Hóa chất

Sử dụng các hóa chất tinh khiết chuẩn dùng để phân tích

- Chuẩn gốc hydroxyprolin 1000ppm/H2O (Clintest solutions)

- Các thuốc thử dẫn xuất: OPA, FMOC, ACQ

- Acetonitril (ACN) loại tinh khiết dùng cho sắc ký (Merck, Đức)

- Acid hydrocloric đặc, triethylamin tinh khiết phân tích (Merck, Đức)

- Mẫu: thực phẩm chức năng có thành phần collagen

- Phương pháp lấy mẫu: ngẫu nhiên

- Bảo quản và lưu trữ mẫu: điều kiện thường

2.3.2 Xử lý và tạo dẫn xuất mẫu

Dựa vào tính chất của collagen (tác dụng với nước, kiềm, acid, các điều kiện pH)

và tham khảo các bài báo [15], [16], [33], chúng tôi lựa chọn phương pháp khảo sát xử lý và tạo dẫn xuất mẫu như sau:

Hình 2 1 Quy trình xử lý và tạo dẫn xuất mẫu

Đồng nhất mẫu

Cân 0,05-0,1 g mẫu

Thủy phân bằng acid HCl:

Khảo sát nồng độ acid dùng để thủy phân mẫu

Sục khí nitơ tạo môi trường khí trơ

- Khảo sát nhiệt độ thủy phân

- Khảo sát thời gian thủy phân

Để nguội, trung hòa bằng NaOH 4N

Lọc vào ống nghiệm

Tạo dẫn xuất

- Khảo sát thuốc thử dẫn xuất

- Lắc đều trong khoảng 10s

- Khảo sát nhiệt độ tạo dẫn xuất

- Khảo sát thời gian dẫn xuất

2.3.3 Xây dựng quy trình phân tích hydroxyprolin bằng phương pháp HPLC

Cột sử dụng: cột Supelco C18 (150 mm × 4,6 mm, 5µm) và tiền cột tương ứng

- Khảo sát lựa chọn detector: detector hấp thụ UV-VIS, detector huỳnh quang

- Khảo sát pha động về tỷ lệ thành phần trietylamin trong dung dịch đệm và gradient pha động

Trong đó: C’, C: nồng độ mẫu, chuẩn bơm vào máy (ppm)

A’, A: diện tích pic mẫu, chuẩn tương ứng

Hàm lượng hydroxyprolin trong mẫu:

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Tối ưu hóa các điều kiện xác định collagen bằng phương pháp HPLC

3.1.1 Khảo sát quá trình thủy phân mẫu

Để tiến hành khảo sát quá trình thủy phân mẫu, chúng tôi cố định các điều kiện tạo dẫn xuất và điều kiện chạy máy HPLC tối ưu, cụ thể như sau:

- Tạo dẫn xuất: dẫn xuất với ACQ, nhiệt độ dẫn xuất 550C, thời gian 10 phút

- Điều kiện chạy máy: chế độ gradient, tốc độ dòng pha động 1ml/phút, nhiệt độ cột

370C, sử dụng detector huỳnh quang, bước sóng kích thích 250 nm, bước sóng phát

xạ 395 nm

3.1.1.1 Khảo sát nồng độ acid

Khảo sát nồng độ acid bằng cách dùng acid HCl ở các nồng độ 3 M, 4 M, 5 M, 6

M, 7 M, 8 M để thủy phân mẫu, với thể tích định mức 50ml, hệ số pha loãng K=1, thu được kết quả như sau:

Diện tích pic (mV.s)

C' (ppm)

Hàm lượng hydroxyprolin (mg/g)

Hàm lượng collagen (mg/g)

Hình 3 1 Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc hàm lượng collagen thu được

vào nồng độ acid thủy phân

Từ kết quả thu được ta có nhận xét rằng, nếu thủy phân mẫu bằng acid có nồng độ thấp (3 M, 4 M, 5 M), mẫu chưa được thủy phân hết, hàm lượng collagen thu được thấp Nếu thủy phân mẫu bằng acid có nồng độ cao (7 M, 8 M), mẫu bị phân hủy cũng cho hàm lượng collagen thu được thấp Khi thủy phân bằng HCl 6 M, hàm lượng collagen thu được là cao nhất Như vậy ta thấy nồng độ acid tối ưu dùng để thủy phân mẫu là 6 M và áp dụng nồng độ này cho những khảo sát tiếp theo

3.1.1.2 Khảo sát nhiệt độ thủy phân

Khảo sát nhiệt độ thủy phân mẫu, tiến hành thủy phân mẫu ở các nhiệt độ từ 110 đến 1300 C, thu được kết quả như bảng sau:

Bảng 3 2 Khảo sát nhiệt độ thủy phân

Hệ số pha loãng

Diện tích pic (mV.s)

C' (ppm)

Hàm lượng hydroxyprolin (mg/g)

Hàm lượng collagen (mg/g)

3 4 5 6 7 8

Hàm lượng

collagen (mg/g)

Nồng độ acid HCl (M)

Hình 3 2 Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc của hàm lượng collagen thu được

vào nhiệt độ thủy phân

Từ kết quả hàm lượng collagen thu được khi thủy phân ở các nhiệt độ khác nhau cho thấy khi thủy phân mẫu ở nhiệt độ 1250C, hàm lượng collagen thu được là cao nhất Khi thủy phân ở 110, 115, 1200C, hàm lượng collagen thu được tăng dần và cao nhất ở 1250C, sau đó giảm xuống ở 1300C Như vậy ta thấy nhiệt độ thủy phân tối ưu là 1250C

3.1.4.3 Khảo sát thời gian thủy phân

Khảo sát thời gian thủy phân mẫu từ 16 đến 30 h, thu được kết quả như sau:

Bảng 3 3 Khảo sát thời gian thủy phân

Thể tích định mức (ml)

Diện tích pic (mV.s)

C' (ppm)

Hàm lượng hydroxyprolin (mg/g)

Hàm lượng collagen (mg/g)

Hình 3 3 Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc của nồng độ collagen thu được

vào thời gian thủy phân

Ta thấy khi thủy phân mẫu trong thời gian 24 h, hàm lượng collagen thu được cao nhất Như vậy ta chọn thời gian thủy phân tối ưu là 24 h

Kết luận: sau khi khảo sát, điều kiện thủy phân tối ưu được lựa chọn là:

- Thủy phân bằng acid HCl 6 M

- Thời gian thủy phân: 24 h

- Nhiệt độ thủy phân: 1250C

Những điều kiện này được cố định và áp dụng cho những khảo sát tiếp theo

3.1.2 Khảo sát điều kiện dẫn xuất

Cố định các điều kiện thủy phân mẫu và điều kiện chạy máy HPLC như sau:

- Thủy phân mẫu bằng acid HCl 6 M trong 24 h ở nhiệt độ 1250C

- Chạy sắc ký pha đảo chế độ gradient, tốc độ dòng pha động 1ml/phút, sử dụng detector huỳnh quang, bước sóng kích thích 250 nm, bước sóng phát xạ 395 nm

3.1.2.1 Khảo sát thuốc thử dẫn xuất

Để phân tích các acid amin, có thể dùng các loại dẫn xuất là: OPA (o-phtalaldehyd), FMOC (fluorenyl methyloxycarbonyl chloride), ninhydrin, ACQ (ACQ: 6-aminoquinolyl-N-hydroxysuccinimidyl carbamat),… trong đó OPA chỉ tạo dẫn xuất với các acid amin bậc một [8], FMOC và ACQ có thể tạo dẫn xuất với cả acid amin bậc một và bậc hai [22], [27] Chúng tôi thực hiện tạo dẫn xuất và chạy sắc ký với 2 loại dẫn xuất FMOC và ACQ và quan sát sắc ký đồ thu được

- Dẫn xuất FMOC: có pic của hydroxyprolin, nhưng hydroxyprolin tách kém với các acid amin khác, ra sớm, lẫn tạp

0 50 100 150 200 250 300 350

- Dẫn xuất ACQ: pic hydroxyprolin tách rõ ràng với những pic khác, ổn định, phân tích tốt

Sắc ký đồ khảo sát thuốc thử dẫn xuất: phụ lục

Như vậy sau khi khảo sát, thuốc thử tạo dẫn xuất được chọn là ACQ do các pic thu được đạt yêu cầu phân tích Trong 2 thuốc thử tạo dẫn xuất thì ACQ tạo dẫn xuất tốt hơn do đó trong nghiên cứu này chúng tôi lựa chọn ACQ để dẫn xuất mẫu cho quá trình sắc ký

3.1.2.2 Khảo sát nhiệt độ dẫn xuất

Khảo sát nhiệt độ dẫn xuất trong khoảng 30 đến 650C thu được kết quả như sau:

Bảng 3 4 Khảo sát nhiệt độ dẫn xuất

Hình 3 4 Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc của diện tích pic thu được

vào nhiệt độ dẫn xuất

0 1000000 2000000 3000000 4000000 5000000 6000000 7000000

Từ kết quả thu được ta thấy ở nhiệt độ dưới 550C hoặc cao hơn 550C, hiệu suất tạo dẫn xuất chưa cao Nhiệt độ quá thấp khiến quá trình tạo dẫn xuất diễn ra chưa hoàn toàn, nhiệt độ quá cao cũng khiến hiệu suất dẫn xuất giảm có thể do đã gây phân hủy thuốc thử tạo dẫn xuất hoặc sản phẩm dẫn xuất do đó hiệu suất thu hồi thấp Như vậy ta thấy nhiệt độ dẫn xuất tối ưu là 550C

3.1.2.3 Khảo sát thời gian dẫn xuất

Khảo sát các thời gian dẫn xuất: 5,8,10,12,15, 20 phút, kết quả thu được như bảng sau:

Bảng 3 5 Khảo sát thời gian dẫn xuất

Hình 3 5 Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc của diện tích pic thu được

vào thời gian dẫn xuất

0 1000000 2000000 3000000 4000000 5000000 6000000 7000000

Sau khi khảo sát, ta thấy thời gian dẫn xuất tối ưu là 10 phút Khi tạo dẫn xuất chưa

đủ thời gian, hiệu suất tạo dẫn xuất chưa đạt 100%, còn nếu dẫn xuất trong hơn 10 phút cũng làm giảm hiệu suất tạo dẫn xuất và tốn thời gian phân tích

Như vậy, các điều kiện tối ưu cho quá trình thủy phân và tạo dẫn xuất là:

Bảng 3 6 Các điều kiện tối ưu thủy phân và tạo dẫn xuất mẫu

Thuốc thử dẫn xuất ACQ

(6-aminoquinolyl-N-hydroxysuccinimidyl carbamat)

3.1.3 Khảo sát điều kiện phân tích HPLC

Để khảo sát các điều kiện phân tích HPLC, cố định các điều kiện thủy phân và điều kiện tạo dẫn xuất như bảng 3.6

3.1.3.1 Lựa chọn detector

- Detector UV: dùng thuốc thử ACQ tạo dẫn xuất với chuẩn hydroxyprolin, tốc độ dòng pha động 1mL/phút, sử dụng detector UV với bước sóng hấp thụ 254 nm Quá trình sắc ký thu được sắc ký đồ có độ nhạy kém, đường nền (độ nhiễu, độ trôi) cao

- Detector huỳnh quang: điều kiện sắc ký tương tự như trên, sử dụng detector huỳnh quang với bước sóng kích thích 250 nm và bước sóng phát xạ 395 nm Kết quả thu được cho thấy detector huỳnh quang cho độ nhạy tốt, pic cân xứng, đẹp, không bị ảnh hưởng bởi pic dẫn xuất dư

Sắc ký đồ khảo sát lựa chọn detector: