Tiến hành chạy sắc ký mẫu trắng, chuẩn và mẫu thử trong cùng điều kiện sắc ký và so sánh sắc ký đồ thu được.
Chạy HPLC:
Dùng chế độ gradient 4, nồng độ TEA trong dung dịch đệm là 20 mM, tốc độ dòng pha động 1 ml/phút, detector huỳnh quang với Ex 250 nm,
Em 395 nm Tạo dẫn xuất:
10 µl dịch mẫu, 10 µl ACQ, 80 µl đệm ACQ. Lắc đều khoảng 10s, sau đó dẫn xuất ở nhiệt độ 550C trong bể rung siêu âm trong 10 phút.
Định mức 50 ml, lọc vào ống nghiệm Để nguội, trung hòa bằng NaOH 4 N
Dùng 2 ml dung dịch acid HCl 6 M nhỏ vào mẫu trong ống thủy phân, sục khí Nitơ tạo môi trường khí trơ, sau đó thủy phân mẫu ở nhiệt độ
1250C trong 24 h
Cân chính xác 0,05-0,1 g mẫu Đồng nhất mẫu
Sắc ký đồ mẫu trắng
Sắc ký đồ mẫu chuẩn
Sắc ký đồ mẫu thử
Sắc đồ so sánh
Hình 3. 9. Sắc ký đồ đánh giá độ đặc hiệu, chọn lọc
Như vậy ta thấy: mẫu trắng không cho tín hiệu của chất phân tích, mẫu thử cho tín hiệu của chất phân tích có thời gian lưu trùng với thời gian lưu của chuẩn. Phương pháp có độ đặc hiệu đạt yêu cầu.
0.0 5.0 10.0 15.0 20.0 25.0 min 0 25 50 75 100 125 150
175mVDetec tor A :Ex :250nm,Em:395nm
0.0 5.0 10.0 15.0 20.0 25.0 min 0 25 50 75 100 125 150 175 mV
Detec tor A :Ex :250nm,Em:395nm
/9.9 63/ 282 102 1 0.0 5.0 10.0 15.0 20.0 25.0 min 0 50 100 150 200 250 300 350 400 450 500 mV
Detec tor A :Ex :250nm,Em:395nm
/10. 107 /156 335 8 0.0 5.0 10.0 15.0 20.0 25.0 min - 100000 0 100000 200000 300000 400000 500000 600000 700000 800000 900000 1000000 1100000 1200000 1300000 uV Hydroxyprolin Hydroxyprolin