Nghiên cứu phát hiện sildenafil trong một số chế phẩm đông dược bằng sắc ký lớp mỏng

Nhằm mục đích góp phần trong công tác nghiên cứu phát hiện thuốc tân dược trộn trái phép trong các chế phẩm đông dược chúng tôi tiến hành đề tài: “Nghiên cứu phát hiện sildenafil trong m

- -

HOÀNG THỊ QUỲNH

NGHIÊN CỨU PHÁT HIỆN

SILDENAFIL TRONG MỘT SỐ CHẾ PHẨM ĐÔNG DƯỢC BẰNG SẮC KÝ

LỚP MỎNG

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

HÀ NỘI – 2013

- -

HOÀNG THỊ QUỲNH

NGHIÊN CỨU PHÁT HIỆN

SILDENAFIL TRONG MỘT SỐ CHẾ PHẨM ĐÔNG DƯỢC BẰNG SẮC KÝ

LỚP MỎNG KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

TS Phạm Thị Thanh Hà ThS Ngô Quang Trung

Là người thầy, người cô đã luôn tận tình hướng dẫn tôi, và giúp đỡ tôi

trong quá trình thực hiện khóa luận này

Tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến PGS.TS Nguyễn Thị Kiều Anh,

và các anh chị tại Phòng Phân tích, kiểm nghiệm và tương đương sinh học Viện công nghệ Dược phẩm Quốc Gia, đã tạo điều kiện giúp đỡ để tôi hoàn

-thành được khóa luận

Nhân dịp này, tôi xin gửi lời cảm ơn tới các thầy cô tại các bộ môn của Trường Đại Học Dược Hà Nội, đã truyền dạy kiến thức và niềm tự hào là

sinh viên trường Dược cho tôi trong suốt 5 năm học tập tại trường

Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn tới bố mẹ, bạn bè, những người đã luôn bên cạnh và ủng hộ tôi trong suốt quá trình học tập và thực hiện khóa

luận này

Xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, ngày 20 tháng 5 năm 2013

Sinh viên

Hoàng Thị Quỳnh

DANH MỤC CÁC BẢNG

DANH MỤC CÁC HÌNH

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 3

1.1 Tổng quan về sildenafil 3

1.1.1 Công thức 3

1.1.2 Tính chất 3

1.1.3 Tác dụng của Sildenafil 4

1.1.3.1 Cơ chế tác dụng của Sildenafil 4

1.1.3.2 Dược động học 4

1.1.3.3 Chỉ định 5

1.1.3.4 Liều dùng 5

1.1.3.5 Tác dụng không mong muốn của Sildenafil 5

1.1.3.6 Tương tác thuốc 6

1.1.4 Một số nghiên cứu phát hiện Sildenafil trong chế phẩm đông dược 7

1.2 Phương pháp sắc ký lớp mỏng 7

1.2.1 Nguyên tắc 7

1.2.2 Pha tĩnh 8

1.2.3 Pha động 9

1.2.4 Kỹ thuật 10

1.2.4.1 Đưa chất phân tích lên bản mỏng 10

1.2.4.2 Khai triển sắc ký 11

1.2.4.3 Phát hiện vết trên sắc ký đồ 12

1.2.5 Ứng dụng của SKLM 13

1.2.5.3 Định lượng 14

1.2.6 Ưu nhược điểm 14

1.2.6.1 Ưu điểm 14

1.2.6.2 Nhược điểm 15

1.3 Phương pháp xử lý mẫu 15

1.3.1 Chiết hệ dị thể rắn-lỏng 15

1.3.2 Chiết Soxhlet 16

1.3.3 Chiết pha rắn (SPE) 16

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 17

2.1 Phương tiện nghiên cứu 17

2.1.1 Máy móc, thiết bị 17

2.1.2 Hóa chất thuốc thử 17

2.2 Đối tượng, nội dung và phương pháp nghiên cứu 18

2.2.1 Đối tượng nghiên cứu 18

2.2.2 Nội dung nghiên cứu 19

2.2.3 Phương pháp nghiên cứu 19

CHƯƠNG 3 THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 20

3.1 Khảo sát và lựa chọn điều kiện phân tích 20

3.1.1 Khảo sát điều kiện sắc ký 20

3.1.2 Khảo sát điều kiện phát hiện 21

3.1.3 Khảo sát phương pháp xử lý mẫu 23

3.2.Đánh giá phương pháp 25

3.2.1 Độ chọn lọc 25

3.2.2 Độ lặp lại 26

3.3.1 Quy trình xử lý mẫu thử và điều kiện khai triển sắc ký 32

3.3.2 Xích Thố Vương 1 33

3.3.3 Xích Thố Vương 2 33

3.3.4 Xích Thố Vương 3 34

3.3.5 YANGCHUNSAMNOK 34

3.3.6 ELK Velvet Antler Bois d’ESLANS Velours 35

3.3.7 YANGCHUNSAMROK 35

3.4 Bàn luận 36

KẾT LUẬN 37

ĐỀ XUẤT 38 TLTK

MeOH Methanol

NO Nitơ (II) oxid

cGMP cyclic Guanosine Monophosphate

PAH Pulmonary Arterial Hypertension (tăng áp động mạch phổi) CYP Cytochrome P450

ED Erectile Dysfunction (rối loạn cương dương)

SKLM Sắc Ký Lớp Mỏng

IR Infrared (Hồng ngoại)

HPLC High-performance liquid chromatography (Sắc ký lỏng hiệu

năng cao) TLC Thin- Layer chromatography (Sắc ký lớp mỏng)

MS Mass spectra( khối phổ)

HPTLC High-performance Thin- Layer chromatography( Sắc ký lớp

mỏng hiệu năng cao) TLTK Tài liệu tham khảo

Bảng 1.1 Một số phương pháp phát hiện sildenafil 7

Bảng 1.2 Một số chất thường làm pha tĩnh cho sắc ký lớp mỏng 9

Bảng 1.3 Một số thuốc thử tạo màu trong sắc ký lớp mỏng 12

Bảng 2.1 Một số sản phẩm đông dược ứng dụng kiểm tra 18

Hình 3.1 Sắc ký đồ khảo sát hệ dung môi khai triển 20

ĐẶT VẤN ĐỀ

Hiện nay, khi kinh tế ngày càng phát triển, con người có điều kiện quan tâm đến sức khỏe nhiều hơn Cùng xu hướng ưa chuộng sử dụng các sản phẩm có nguồn gốc tự nhiên với niềm tin chúng an toàn, hiệu quả hơn Nắm bắt xu thế đó, các cơ sở sản xuất chế phẩm đông dược đã đưa ra thị trường rất nhiều mặt hàng nhằm đáp ứng nhu cầu của người tiêu dùng Tuy nhiên, nhà sản xuất vì nhiều mục đích như lợi nhuận, giảm nhanh các triệu chứng hay tạo cảm giác đánh lừa người tiêu dùng (tăng cân nhanh do tác dụng giữ nước) , mà đã cố tình trộn trái phép thuốc tân dược vào các chế phẩm đông dược Điều này không được thông báo khiến người tiêu dùng vì không biết đã sử dụng thuốc với một liều lớn trong thời gian kéo dài, đây có thể là nguyên nhân gây ra các tác dụng không mong muốn về sau cho người dùng thậm chí là nguy hiểm đến tính mạng Các nhóm thuốc thường được sử dụng là: glucocorticoid, nhóm giảm đau chống viêm không steroid, nhóm ức chế PDE-5…đây là những thuốc cho tác dụng nhanh và mạnh vì vậy mà chúng bị lạm dụng nhiều Chính vì vậy mà hiện nay nước ta đã có quy định

cụ thể nghiêm cấm trộn trái phép thuốc tân dược vào các chế phẩm đông dược, tuy nhiên việc kiểm soát còn gặp nhiều khó khăn

Sildenafil là một chất thuộc nhóm ức chế PDE-5 Năm 1998, sildenafil với tên biệt dược là Viagra đã được FDA công nhận làm thuốc và cũng là thuốc đầu tiên điều trị rối loạn cương dương trên thế giới Chính nhờ tác dụng của nó mà việc lạm dụng thuốc và tình hình trộn trái phép sildenafil vào các chế phẩm đông dược ngày càng gia tăng Trong báo cáo thường niên của hội đồng dược điển Mỹ (USP) năm 2007 đã nêu rõ rằng: “trộn sildenafil và dẫn chất” trở thành vấn đề mang tính toàn cầu [17]

Nhằm mục đích góp phần trong công tác nghiên cứu phát hiện thuốc tân dược trộn trái phép trong các chế phẩm đông dược chúng tôi tiến hành đề tài:

“Nghiên cứu phát hiện sildenafil trong một số chế phẩm đông dược

bằng sắc ký lớp mỏng”

Với các mục tiêu cụ thể sau:

1 Xây dựng quy trình phát hiện sildenafil có thể có trong các chế phẩm đông dược bằng sắc ký lớp mỏng

2 Áp dụng quy trình để kiểm tra một số chế phẩm đông dược thu thập được

CHƯƠNG I TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan về sildenafil

+ Độ tan: Sildenafil citrate ít tan trong methanol (3,5mg/ml), độ tan của

SC phụ thuộc vào pH và giảm dần theo sự tăng pH pH trong phạm vi 3,7-3,8, pKa 8,2-9,6

+ Tồn tại ở dạng muối liên kết với acid citric (C22H30N6O4S.C6H8O7)

Tên biệt dược:

Revatio 20mg

Viagra 25mg, 50mg, 100mg

1.1.3 Tác dụng của sildenafil

1.1.3.1 Cơ chế tác dụng của sildenafil [3], [10], [21]

- Điều trị rối loạn chức năng cương dương

Không có một nguyên nhân chính xác về cương dương vật nhưng được đáp ứng từ nhu cầu tình dục Cơ chế của cương dương vật liên quan đến giải phóng nitơ (II) oxid (NO) thể hang dương vật trong quá trình ham muốn tình dục NO sau đó sẽ kích hoạt enzyme guanylate cyclase và làm tăng nồng độ cyclic guanosine monophosphate (cGMP) và kết quả là làm giãn cơ trơn và tăng lượng máu đến thể hang dương vật Sildenafil làm tăng tác dụng của NO bởi ức chế enzyme phosphodiesterase-5 (PDE-5) một enzyme thoái hóa cGMP trong thể hang dương vật

- Điều trị tăng áp động mạch phổi (PAH): ức chế PDE-5 ở cơ trơn

động mạch phổi Kết quả của tăng nồng độ cGMP là gây giãn cơ trơn động mạch phổi

+ Thời gian bán thải: t1/2=4h

+ Thời gian đạt nồng độ tối đa: 30 phút đến 120 phút, chậm 60 phút khi

sử dụng thức ăn giàu chất béo

+ Chuyển hóa: qua gan, chủ yếu là qua hệ enzyme CYP3A4

+ Thải trừ: chủ yếu qua phân (80%), qua nước tiểu (13%)

1.1.3.3 Chỉ định [10], [21]

- Rối loạn cương dương (ED)

- Tăng áp động mạch phổi (PAH)

1.1.3.4 Liều dùng [10], [21]

- Người lớn:

Rối loạn chức năng cương dương: 50mg × 1 lần/1 ngày (đường uống),

uống trước 1 giờ (dao động từ 30 phút đến 4 giờ) khi có nhu cầu tình dục Liều dao động từ 25-100mg × 1 lần/1 ngày

Tăng áp động mạch phổi: 20mg ×3 lần/1 ngày

1.1.3.5 Tác dụng không mong muốn của sildenafil

Các tác dụng không mong muốn như đỏ mặt, rối loạn tiêu hóa, đau cơ, rối loạn về thị giác tăng lên khi dùng liều >100mg/24h

Ảnh hưởng lên hệ tim mạch [18]

Ảnh hưởng của nhóm ức chế enzyme PDE-5 (sildenafil, vardenafil, tadalafil) lên hệ tim mạch đã được ghi nhận Có những báo cáo không rõ ràng

về nguy cơ tiềm tàng khi điều trị bằng sildenafil Tác dụng giãn mạch như đau đầu, đỏ mặt xảy ra thường xuyên

Tháng 12/1998, có 130 bệnh nhân chết khi sử dụng sildenafil được báo cáo tại FDA, 7 trường hợp bị đột quỵ và 77 trường hợp bị mắc các bệnh có liên quan đến tim mạch Liên quan các trường hợp trên với sử dụng thuốc là chưa rõ ràng, song có một số bệnh nhân khi sử dụng thuốc kết hợp với nitrat gây “hạ huyết áp quá mức”

Tại Úc, Trung tâm theo dõi phản ứng có hại của thuốc vào tháng 6/2002 đã ghi nhận 773 trường hợp có liên quan sử dụng sildenafil Trong đó

có 20 trường hợp bị nhồi máu cơ tim bao gồm 4 trường hợp tử vong, 9 trong

20 trường hợp có tiền sử bệnh tim mạch hoặc đái tháo đường hoặc được xác

nhận có nguy cơ cao các bệnh tim mạch, 1 trường hợp sử dụng kết hợp với nitrat

Các trường hợp liên quan đến tim mạch gồm 26 trường hợp đau thắt ngực, 10 trường hợp tử vong (6 trường hợp không rõ nguyên nhân, 2 trường hợp bị đột quỵ và 2 trường hợp bị xuất huyết não)

Ảnh hưởng đến tai: [18]

Vào 10/2007 US FDA ghi nhận 29 trường hợp bị giảm thính giác khi sử dụng nhóm ức chế PDE-5 Các triệu chứng ghi nhận là ù tai, chóng mặt hoặc hoa mắt Trong các trường hợp ghi nhận, giảm khả năng thính giác bao gồm giảm chức năng một bên tai hoặc một phần hoặc hoàn toàn 1/3 trong các trường hợp là giảm chức năng tạm thời

Ảnh hưởng lên chức năng tâm thần [18]

Có vài báo cáo về chứng mất trí nhớ tạm thời khi sử dụng sildenafil hoặc taladafil Từ 1/1998 đến 12/2001, FDA đã ghi nhận có 35 trường hợp về chứng mất trí nhớ mà sildenafil được xem là nguyên nhân nghi ngờ hàng đầu

1.1.3.6 Tương tác thuốc [18]

Thuốc được chuyển hóa chủ yếu bởi hệ enzyme CYP3A4

Tránh sử dụng đồng thời sildenafil với các nhóm thuốc ức chế enzyme CYP3A4, các thuốc giãn mạch

Sildenafil làm tăng tác dụng của các thuốc: chẹn kênh alpha, nhóm ức chế HMG-CoA reductase, nhóm thuốc ức chế men chuyển phosphodiesterase-5, nhóm thuốc giãn mạch

Tác dụng của sildenafil tăng lên khi dùng cùng các thuốc: thuốc chống nấm, thuốc ức chế enzyme CYP3A4, kháng sinh marcolid, thuốc ức chế enzyme protease, saproterin

Tác dụng của sildenafil giảm đi khi dùng cùng các thuốc: Bosentan, thuốc cảm ứng enzyme CYP3A4, Etravirin

1.1.4 Một số nghiên cứu phát hiện Sildenafil trong chế phẩm đông dược

Qua một số tài liệu cho thấy đã có nhiều nghiên cứu để phát hiện Sildenafil trong chế phẩm đông dược và thực phẩm chức năng cả trên thế giới

và tại Việt Nam [6], [9], [12], [15], [19], [22], [23] Bảng 1.1 trình bày một số nghiên cứu đó:

Bảng 1.1: Một số nghiên cứu phát hiện sildenafil

MS Điều kiện khối phổ :

- MS : quét toàn thang (TIC,150- 170 amu)

- Khí sheath gas ( SG ) 20 đơn vị, Aux/ sweep gas ( AG) : 10 đơn vị

- Nhiệt độ mao quản chuyển ion : 350 0C

- MS2 : quét toàn thang ( TIC, 150-600 amu)

- Năng lượng va chạm ( CE) : 20%-50%

Quá trình tách bằng SKLM được thực hiện trên một lớp mỏng gồm các

hạt kích thước đồng nhất được kết dính trên một giá đỡ bằng thủy tinh, nhôm

hoặc chất dẻo Lớp mỏng kết dính là pha tĩnh Pha động là chất lỏng gồm một

hay hỗn hợp nhiều dung môi, pha động di chuyển qua pha tĩnh nhờ lực mao

dẫn

Các chất phân tích sẽ di chuyển với tốc độ khác nhau tùy thuộc vào

bản chất của chúng, và kết quả là chúng được tách riêng, đứng ở các vị trí

khác nhau trên bản mỏng Sự tách các chất khác nhau cũng phụ thuộc vào

tính phân cực của các thành phần trong pha động Cơ chế tách có thể là phân

bố, hấp phụ, trao đổi ion, sàng lọc phân tử hoặc phối hợp nhiều cơ chế

Đại lượng đặc trưng cho mức độ di chuyển của các chất phân tích là hệ

số lưu giữ Rf Trị số của nó được tính bằng tỷ lệ giữa khoảng cách di chuyển

của chất phân tích và khoảng cách dịch chuyển của pha động:

Rf = dR / dM Trong đó:

dR : khoảng cách từ điểm xuất phát đến tâm vết phân tích (cm)

dM : khoảng cách từ điểm xuất phát đến mức dung môi pha động (đo trên cùng đường đi của vết, tính bằng cm )

Rf có giá trị dao động giữa 0 và 1 Tốt nhất là khoảng 0,2 đến 0,8

1.2.2 Pha tĩnh [1]

Pha tĩnh của SKLM là các hạt có kích thước 10-30 µm được rải đều và

kết dính thành lớp mỏng đồng nhất dày khoảng 250 µm trên giá đỡ nhôm,

thủy tinh, nhựa Bản mỏng có sẵn trên thị trường với nhiều kích thước khác

nhau và nhiều khi người ta có đưa thêm các chất phát huỳnh quang không tan

vào pha tĩnh để dễ phát hiện chất phân tích

Một số chất thường được dùng làm pha tĩnh cho SKLM kèm theo cơ

chế sắc ký và ứng dụng được trình bày trong bảng sau:

Bảng 1.2 Một số chất thường làm pha tĩnh cho SKLM

phẩm, lipid

Cellulose trao đổi

Acid nucleic, nucleotid, ion kim loại,

halogenua

Trong những chất kể trên, được dùng phổ biến nhất là silica (SiO2) và alumina (Al2O3)

1.2.3 Pha động [1]

Pha động cho SKLM rất thay đổi tùy thuộc vào cơ chế sắc ký (bảng 1.2) Để tăng cường sức rửa giải thường kết hợp 2 dung môi Nguyên lý chia tách dựa vào hệ số phân bố giữa hai pha Tuy nhiên lựa chọn tối ưu hóa sắc

ký thường dựa chủ yếu vào kinh nghiệm Sau đây là một số gợi ý chung nhất cho pha động của SKLM:

 Dung môi cần có độ tinh khiết cao

 Cần điều chỉnh sức rửa giải của pha động để trị số Rf nằm trong khoảng 0,2 ÷ 0,8 đạt độ phân giải cực trị

 Chất phân tích dạng ion hay phân cực được rửa giải tốt bằng dung môi phân cực như hỗn hợp n-BuOH – H2O Thêm một ít acid acetic hoặc amoniac vào nước sẽ làm tăng độ tan của base hoặc acid tương ứng

 Khi dùng silicagel hoặc các chất hấp phụ phân cực khác, độ phân cực của pha động sẽ quyết định tốc độ di chuyển của chất phân tích và trị

số Rf của chúng Nếu thêm một ít dung môi ít phân cực như ether ethylic vào dung môi không phân cực như methylbenzen sẽ làm tăng đáng kể trị số Rf

1.2.4 Kỹ thuật [1], [11], [13]

Bản sắc ký thường có kích thước khác nhau Hai loại thông dụng là 10×20cm và 20×20cm Sau khi chọn được bản mỏng phù hợp, tiến hành SKLM gồm có 4 bước sau:

 Đưa mẫu phân tích lên bản mỏng

 Khai triển sắc ký với pha động phù hợp

 Phát hiện các vết trên sắc ký đồ (SKĐ)

 Thu nhận và xử lý số liệu thực nghiệm

1.2.4.1 Đưa chất phân tích lên bản mỏng [1], [11]

Trước khi thực hiện việc đưa chất phân tích lên bản mỏng cần thực hiện việc hoạt hóa bản mỏng

Dụng cụ chấm sắc ký có thể là: mao quản thủy tinh, pipet nhọn, micropipet với nhiều kích cỡ khác nhau, máy chấm sắc ký với bơm tiêm mẫu… Hiện nay có rất nhiều loại máy chấm sắc ký với bơm tiêm mẫu điều chỉnh được thể tích chấm, số lượng mẫu chấm trên một bản mỏng, vị trí chấm một cách chính xác Người dùng có thể chấm tại một điểm hoặc một vạch tùy theo yêu cầu

Lượng hỗn hợp các chất đưa lên bản mỏng có ý nghĩa rất quan trọng đối với hiệu quả tách sắc ký, ảnh hưởng đến trị số Rf Nếu lượng chất quá lớn, vết sắc ký lớn và kéo dài, khi đó các chất có trị số Rf gần nhau sẽ chồng lên nhau không tách riêng được Nếu lượng quá nhỏ có thể không phát hiện được vết (do thuốc thử không đủ độ nhạy)

Đường xuất phát (để chấm sắc ký) cách mép dưới bản mỏng khoảng 1,5÷2,0 cm và cách bề mặt pha động 0,8 ÷ 1,0 cm Các vết chấm phải nhỏ, đường kính 2-6 mm và cách nhau khoảng 15mm Các vết ở bìa phải cách bờ khoảng 1 cm Trong trường hợp bản định lượng phải dùng mao quản định mức chính xác vì độ tin cậy của kết quả phụ thuộc vào lượng chất phân tích đưa lên bản mỏng

1.2.4.2 Khai triển sắc ký [1], [11]

Thiết bị khai triển sắc ký thường là bình thủy tinh trong suốt có nút xoáy kín Thường dùng loại bình cổ điển đáy phẳng hoặc bình có đáy hai ngăn (twin trough chambers- TTC) với các kích thước khác nhau, bình 2 ngăn dùng tiết kiệm dung môi hơn Để tăng độ bão hòa dung môi pha động trong bình (nhất là đối với dung môi có độ nhớt cao, khó bay hơi) người ta đặt một tờ giấy lọc áp sát thành bình

Sau khi chấm mẫu sắc ký, bản đã khô (đã bay hết dung môi) được cho vào bình sắc ký đã bão hòa pha động Mép dưới bản mỏng được nhúng vào pha động nhưng vết chấm còn cách bề mặt pha động khoảng 1 cm

Có nhiều cách khai triển sắc ký, nhưng thường gặp 3 cách:

1 Sắc ký lên: mẫu phân tích được đưa lên từ mép dưới của bản mỏng, pha động di chuyển nhờ lực mao dẫn

2 Sắc ký ngang: mẫu phân tích được đưa lên ở 2 bờ đối diện của bản mỏng, pha động từ 2 phía chạy vào giữa bản Có bấc để dẫn pha động

đi vào bản mỏng

3 Sắc ký hai chiều: trường hợp này bản mỏng hình vuông, vết chấm sắc

ký ở một góc bản mỏng Đầu tiên chạy sắc ký với pha động A, làm khô bản mỏng, quay 90o chạy với pha động B Làm khô bản mỏng và phát hiện vết

1.2.4.3 Phát hiện vết trên sắc ký đồ [1], [11], [13]

Dựa vào tính chất lý hóa khác nhau của chất phân tích để lựa chọn cách phát hiện thích hợp các vết sắc ký

Một số kỹ thuật phát hiện thường gặp:

 Phun thuốc thử hiện màu:

Dùng thuốc thử tạo màu với chất phân tích Đôi khi người ta làm nóng bản mỏng để làm tăng tốc độ phản ứng tạo màu và cường độ vết màu

Một số thuốc thử tạo màu trong SKLM được thể hiện trong bảng sau:

Bảng 1.3 Một số thuốc thử tạo màu trong SKLM

Thuốc thử Màu của vết Ứng dụng phân tích

Nhiều chất hữu cơ Tất cả các chất hữu cơ Nhiều chất hữu cơ

-xanh hoặc lục bromocrezol

Nhiều chất hữu cơ Alcol, ceton Các chất lipid Các chất steroid Các chất bảo vệ thực vật

 Soi dưới đèn UV:

Nhiều vết chất hữu cơ trên SKĐ trở nên tối hoặc phát quang sáng khi soi dưới đèn UV ở bước sóng 254 nm hoặc 366 nm Một số bản tráng sẵn có chất phát quang không tan đưa vào pha tĩnh nên phát huỳnh quang

Rr = dR,x/dR,c Trong đó: dR,x đường đi của chất phân tích (cm)

dR,c đường đi của chất chuẩn (cm)

Rr càng gần 1 chất phân tích và chất chuẩn càng đồng nhất

1.2.5.2 Thử tinh khiết

Đây là ứng dụng rất phổ biến của SKLM, là biện pháp đơn giản để kết luận sự tinh khiết của hợp chất Khi khai triển dung dịch mẫu với các hệ dung môi khác nhau mà ngoài vết chính không kèm theo các vết khác trên sắc ký

đồ, ta có thể kết luận chất đó tinh khiết Trong các Dược điển thường quy định kiểm tra tạp chất có mặt trong dược chất bằng SKLM

1.2.5.3 Định lượng

Bằng các biện pháp chính xác hóa lượng mẫu đưa lên bản mỏng có thể

sử dụng SKLM để định lượng Tùy theo phương tiện sử dụng mà độ chính xác của phép định lượng ở cấp độ khác nhau:

- SKLM cung cấp thêm thông tin bán định lượng về các thành phần chính của thuốc và các tiền chất làm thuốc, do đó nó cho phép đánh giá chất lượng thuốc

- SKLM cung cấp hình ảnh SKĐ làm dấu vân tay cho mỗi thuốc bởi vậy phương pháp này thực sự thích hợp trong việc kiểm tra sự đồng nhất, tinh khiết của thuốc và phát hiện sự giả mạo, thay thế thuốc

Một số kỹ thuật chiết hay được sử dụng:

1.3.1 Chiết hệ dị thể rắn-lỏng

- Nguyên tắc: là kỹ thuật chiết đơn giản nhất, sử dụng dung môi hữu cơ

để chiết các đối tượng phân tích tan trong dung môi chiết từ mẫu đã được làm nhỏ

- Để chiết hiệu quả thì cần lưu ý các yếu tố sau:

 Diện tích tiếp xúc giữa mẫu và dung môi lớn làm tăng khả năng chiết, mẫu càng nhỏ thì khả năng chiết càng tốt Tuy nhiên, nếu mẫu quá mịn thì quá trình tách chiết sẽ khó thực hiện đồng thời có thể kéo thêm nhiều tạp chất

 Thời gian tiếp xúc phải đủ để dung môi thấm vào mẫu, hòa tan các chất phân tích Nếu thời gian không ảnh hưởng đến chất phân tích thì có thể ngâm mẫu trong dung môi cần chiết vài giờ hoặc qua đêm

 Nếu chiết bằng dung môi kém phân cực thì hàm ẩm không được quá lớn

Thông thường để tăng hiệu quả và rút ngắn thời gian chiết người ta có thể sử dụng các tác nhân vật lý như nhiệt độ, siêu âm…

- Ứng dụng: kỹ thuật chiết rắn-lỏng được áp dụng phổ biến cho các mẫu dạng rắn như : thuốc bột, thuốc viên, dược liệu…hoặc mẫu bán rắn như thuốc mỡ, cream…

1.3.2 Chiết Soxhlet

- Nguyên tắc: Dung môi ở nhiệt độ cao sẽ chiết lặp lại liên tục và cạn kiệt các hoạt chất trong mẫu phân tích đã làm nhỏ trong một loại trang bị chiết riêng Đây là kỹ thuật chiết toàn phần và có hiệu suất cao

- Khi chiết cần lưu ý không để nhiệt độ sôi của hỗn hợp dung môi quá cao vì có thể làm phân hủy mẫu và đồng thời chú ý đến lượng mẫu thử và thời gian chiết

- Ứng dụng: kỹ thuật chiết Soxhlet thường được dùng phổ biến để chiết các hợp chất bảo vệ thực vật từ các loại mẫu cây, lá, rau quả, thực phẩm hay mẫu đất

1.3.3 Chiết pha rắn (SPE)

- Là kỹ thuật chiết dựa trên nguyên tắc của sắc ký lỏng nhằm loại các chất có ảnh hưởng đến chất phân tích, làm giàu chất trước khi phân tích chúng Kỹ thuật này có thể làm giảm đáng kể lượng dung môi hữu cơ, chiết

có chọn lọc các chất cần quan tâm, thời gian chiết nhanh, hiệu quả chiết cao,

và độ lặp lại cao

- Ứng dụng: kỹ thuật SPE được áp dụng rộng rãi để chiết tách, tinh chế, làm giàu mẫu, đặc biệt hiệu quả cho các mẫu dịch sinh học, phân tích vi lượng, môi trường…