Định tính saponin trong giảo cổ lam bằng sắc ký lớp mỏng

Hình ảnh sắc ký đồ của dịch chiết một số loài Giảo cổ lam thuộc chi Gynostemma Blume khi quan sát dưới ánh sáng tử ngoại bước sóng 254 nm 31 16 Hình 3.7.. Hình ảnh sắc ký đồ của dịch ch

B Ộ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

PHẠM THỊ LAN

ĐỊNH TÍNH SAPONIN TRONG GIẢO CỔ LAM BẰNG SẮC KÝ LỚP MỎNG KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

Người hướng dẫn

ThS Phạm Tuấn Anh

Nơi thực hiện

Bộ môn Dược liệu

Trường Đại học Dược Hà Nội

HÀ NỘI – 2013

giúp đỡ của ThS Lê Thanh Bình, người đã cho tôi sự hỗ trợ kịp thời trong

quá trình thực hiện khóa luận

Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô, các anh chị kỹ thuật viên đang công tác tại bộ môn Dược Liệu – Trường Đại học Dược Hà Nội đã tạo điều

kiện để tôi hoàn thành khóa luận đúng hạn Cuối cùng tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới gia đình, bạn bè tôi, những người đã luôn tin tưởng, cổ vũ, động viên tôi trong học tập và trong cuộc sống

Hà Nội, ngày 21 tháng 5 năm 2013

Sinh viên

Ph ạm Thị Lan

M ỤC LỤC

L ỜI CẢM ƠN

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 2

1.1 TỔNG QUAN VỀ GIẢO CỔ LAM 2

1.1.1 Đặc điểm chi Gynostemma Blume 2

1.1.1.1 Vị trí phân loại chi Gynostemma Blume 2

1.1.1.2 Đặc điểm thực vật và phân bố của chi Gynostemma Blume 2

1.1.1.3 Các loài trong chi Gynostemma Blume tại Việt Nam 3

1.1.2 Thành phần hóa học của các loài Giảo cổ lam 5

1.1.2.1 Saponin trong Giảo cổ lam 5

1.1.2.2 Nghiên cứu về flavonoid 10

1.1.2.3 Các chất khác 11

1.2 T ỔNG QUAN VỀ HỆ THỐNG SẮC KÝ LỚP MỎNG HIỆU NĂNG CAO, CAMAG REPROSTAR 3, LINOMAT 5.0 12

1.3.1 Hệ thống sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao (high performance thin layer chromatography: HPTLC) 12

1.3.2.Camag Reprostar 3 138

1.3.3.Linomat 5.0 14

CHƯƠNG 2 NGUYÊN LIỆU, THIẾT BỊ, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN C ỨU 16

2.1 Nguyên liệu 16

2.2 Phương tiện nghiên cứu 16

2.2.1 Thuốc thử, dung môi, chất chuẩn, dịch chiết so sánh 16

2.2.2 Máy móc, thiết bị, dụng cụ 17

2.3 N ội dung và phương pháp nghiên cứu 18

2.3.1 Khảo sát các điều kiện tiến hành sắc ký lớp mỏng 18

2.3.2 Định tính saponin trong Giảo cổ lam bằng sắc ký lớp mỏng 193

CHƯƠNG 3 THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 21

3.1 Th ực nghiệm và kết quả 21

3.1.1 Khảo sát các điều kiện tiến hành sắc ký lớp mỏng 21

3.1.1.1.Chuẩn bị dịch chiết 21

3.1.1.2 Điều kiện sắc ký 21

3.1.2 Định tính saponin trong dược liệu Giảo cổ lam 24

3.1.2.1 Định tính các mẫu thuộc loài Gynostemma pentaphyllum (Thunb.) Makino 24

3.1.2.2 Định tính các loài Giảo cổ lam Việt Nam 303

3.2 Bàn Lu ận 3539

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 404 TÀI LI ỆU THAM KHẢO

6 Hình 1.6 Công thức cấu tạo của vinagynostesid A 10

9 Hình 2.1 Sơ đồ quá trình chiết bằng n – BuOH bão hòa nước 18

10

Hình 3.1 Hình ảnh sắc ký đồ dịch chiết loài G pentaphyllum

(Thunb.) Makino trong n – BuOH bão hòa nước, quan sát

dưới ánh sáng tử ngoại bước sóng 254 nm, 366 nm và phun

hai loại thuốc thử hiện màu

22

11

Hình 3.2 Hình ảnh sắc ký đồ dịch chiết loài G pentaphyllum

(Thunb.) Makino ở Đắc Nông trong n – BuOH bão hòa nước

với các thể tích chấm lần lượt từ 1µl đến 5µl sau khi khai

triển với hệ dung môi (I), quan sát dưới ánh sáng tử ngoại và

phun thuốc thử hiện màu

23

12

Hình 3.3 Hình ảnhsắc ký đồ của dịch chiết 13 mẫu thuộc loài

G pentaphyllum (Thunb.) Makino khi quan sát ở ánh sáng tử

ngoại bước sóng 254 nm

25

13

Hình 3.4 Hình ảnh sắc ký đồ của dịch chiết 13 mẫu loài G

pentaphyllum (Thunb.) Makino khi quan sát ở ánh sáng tử

ngoạibước sóng 366 nm

27

14

Hình 3.5 Hình ảnh sắc ký đồ của dịch chiết 13 mẫu G

pentaphyllum (Thunb.) Makino sau khi phun thuốc thử hiện

màu

28

15

Hình 3.6 Hình ảnh sắc ký đồ của dịch chiết một số loài Giảo

cổ lam thuộc chi Gynostemma Blume khi quan sát dưới ánh

sáng tử ngoại bước sóng 254 nm

31

16

Hình 3.7 Hình ảnh sắc ký đồ của dịch chiết một số loài Giảo

cổ lam thuộc chi Gynostemma Blume Việt Nam khi quan sát

dưới ánh sáng tử ngoại có bước sóng 366 nm

32

17

Hình 3.8 Hình ảnh sắc ký đồ của dịch chiết một số loài Giảo

cổ lam Gynostemma Blume sau khi hiện màu bằng thuốc thử

vanillin – acid sulfuric

33

3 Bảng 3.1 Giá trị Rf của các vết quan sát được trên sắc ký đồ

của các mẫu G pentaphyllum (Thunb.) Makino ở ánh sáng tử

ngoại bước sóng 254 nm

25

4 Bảng 3.2 Giá trị Rf và màu sắc của các vết trên sắc ký đồ của

các mẫu G pentaphyllum (Thunb.) Makino sau khi hiện màu

28

5 Bảng 3.3 Giá trị Rf của các vết trên sắc ký đồ của dịch chiết

một số loài Giảo cổ lam thuộc chi Gynostemma Blume khi quan

sát dưới ánh sáng tử ngoại bước sóng 254 nm

31

6 Bảng 3.4 Giá trị Rf và màu sắc của các vết trên sắc ký đồ của

một số loài Giảo cổ lam thuộc chi Gynostemma Blume sau khi

hiện màu bằng thuốc thử vanillin – acid sulfuric

34

ĐẶT VẤN ĐỀ

Giảo cổ lam là một dược liệu quý, được phát hiện và sử dụng lần đầu ở

Nhật Bản với tên gọi cây trường sinh Năm 1997, GS TS Phạm Thanh Kì đã phát hiện ra Giảo cổ lam tại Lào Cai – Việt Nam Trong những năm gần đây,

Giảo cổ lam được trồng trên diện rộng ở các địa phương, được chế biến thành các sản phẩm chè Giảo cổ lam đa dạng và được lưu thông rộng rãi trên thị trường như Giảo cổ lam Tuệ Linh, Giảo cổ lam Ba Tri, Giảo cổ lam Tam Đảo… Do nguồn gốc Giảo cổ lam phức tạp, không rõ ràng lại được sử dụng

với số lượng lớn nên rất khó kiểm soát dẫn đến tình trạng dược liệu giả mạo, dược liệu kém chất lượng vẫn lưu thông tự do trên thị trường ảnh hưởng đến

sức khỏe của nhân dân Vì vậy, việc phân tích so sánh các mẫu Giảo cổ lam

và lựa chọn dược liệu sử dụng để đảm bảo chất lượng thuốc là hết sức cần thiết

Những nghiên cứu để đưa ra các tiêu chuẩn truyền thống về Giảo cổ lam trước đây như cảm quan về hình thái, đặc điểm vi phẫu, chỉ thị hóa học… rất khó để đánh giá chính xác chất lượng Giảo cổ lam Vì vậy, việc phân tích thành phần hóa học đặc biệt là thành phần saponin để bước đầu xây dựng tiêu chuẩn vân tay hóa học của Giảo cổ lam là rất quan trọng và và có ý nghĩa thực

tiễn trong kiểm soát nguồn gốc và chất lượng của dược liệu này Xuất phát từ yêu cầu thực tế trên, khóa luận “Định tính saponin trong Giảo cổ lam bằng

s ắc ký lớp mỏng” được thực hiện với 2 mục tiêu:

- Định tính thành phần saponin của loài Gynostemma pentaphyllum (Thunb.) Makino

Gynostemma ở Việt Nam

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN

1.1 TỔNG QUAN VỀ GIẢO CỔ LAM

1.1.1 Đặc điểm chi Gynostemma Blume

1.1.1.1 Vị trí phân loại chi Gynostemma Blume

Theo các tài liệu Thực vật dược và phân loại thực vật [15], Cây cỏ Việt

Nam [10], chi Gynostemma Blume được xếp vào họ Cucurbitaceae (họ Bầu bí) Vị trí của chi Gynostemma Blume trong hệ thống phân loại thực vật dược

Hiện nay, đã nhận dạng 21 loài của chi Gynostemma Blume Ở Trung

Quốc đã được ghi nhận 14 loài [22] Ở Việt Nam, chi Gynostemma Blume có

5 loài [23]

1.1.1.2 Đặc điểm thực vật và phân bố của chiGynostemma Blume

Chi Gynostemma Blume được mô tả đầu tiên bởi Blume vào năm 1825

dựa trên đặc điểm hình thái của loài G simplicifolium [22] Từ đó đến nay, đã

có thêm nhiều loài được mô tả Các loài thuộc chi Gynostemma có các đặc

điểm chung như sau [10], [45]:

Cây thảo, mảnh, thân leo, sống lâu năm Lá kép, ít khi là lá đơn, lá khía răng cưa Tua cuốn chẻ đôi, đôi khi có tua cuốn đơn Cụm hoa khác gốc, dạng chùy mảnh, dài, nhất là đối với hoa đực Hoa nhỏ, màu trắng hoặc lục nhạt, có

lá bắc con; cuống hoa có đốt Đài hoa hình bánh xe, chia 5 thùy, ngắn Tràng hình bánh xe, hơi hàn liền phần gốc tràng, có đầu nhọn Nhị 5, ở phần gốc chỉ

nhị hàn liền thành cột Bao phấn 1 ô, nhưng nhìn có vẻ như 2 ô Nhụy: bầu hình cầu nhỏ, 2 – 3 ngăn, 2 – 3 vòi nhụy với đầu nhụy chia 2 – 3 đầu nhọn

Quả hình cầu lớn hơn hạt đậu, không mở, 2 – 3 hạt hình trứng hơi dẹt 2 bên

hoặc có 3 góc Hạt sần sùi

Các loài của chi Gynostemma Blume phân bố chủ yếu ở vùng nhiệt đới

châu Á và Đông Nam Á từ Hymalaya tới Nhật Bản, Malaysia và New

Guinea Loài Gynostemma pentaphyllum (Thunb.) Makino là loài phổ biến

nhất, nó phân bố ở Ấn Độ, Nepal, Bangladesh, Srilanca, Lào, Myama, Hàn

Quốc, Nhật Bản và Việt Nam [45]

1.1.1.3 Các loài trong chi Gynostemma tại Việt Nam

Hiện nay có 3 loài thuộc chi Gynostemma đã được công bố tại Việt Nam

a Gynostemma pentaphyllum (Thunb.) Makino

- Đặc điểm thực vật:

Cây thảo, mọc leo, thân cành mảnh, có góc cạnh, không lông hoặc lông thưa thớt ở mấu Lá kép chân vịt – bàn đạp, 5 – 7 lá chét dài 3 – 9cm, rộng 1,5 – 3cm, mép lá có răng cưa.Tua cuốn mảnh, xẻ đôi ở đỉnh [6]

Cụm hoa đực dạng chùm kép Hoa có cuống mảnh cỡ 1 – 4 mm; ống đài

rất ngắn, thùy đài hình tam giác, dài khoảng 0,7 mm, đỉnh nhọn, thùy tràng hình bầu dục hoặc mũi mác, đỉnh nhọn có một gân, nhị 5

Cụm hoa cái dạng chùm ngắn hơn hoa đực Hoa cái có đài và tràng

giống hoa đực, bầu hình cầu 2 – 3 ô, vòi nhụy 3, nhị lép 5, ngắn

Quả không tự mở, hình cầu, đường kính 5 – 6 mm, khi chín màu đen

Hạt hình trứng hoặc hình tim, đường kính 4 mm, màu nâu, đỉnh tù, gốc hình tim dẹt

Mùa hoa tháng 3 – 10, quả tháng 4 – 12 [5], [6], [7]

Cây mọc trên đá vôi, đá hoa cương và đất núi lửa, trong rừng thưa, lùm

bụi từ vùng đồng bằng đến vùng núi cao 2000m [6]

- Phân bố: tại Việt Nam, cây mọc ở nhiều nơi như Lào Cai, Lạng Sơn, Quảng Ninh, Hòa Bình, Thừa Thiên – Huế, Kon Tum, Đồng Nai [5], [6]

b Gynostemma longipes C.Y.W

Hoa đơn tính khác gốc Cụm hoa đực kép 3 lần chùm, mảnh Hoa đực rất

nhỏ, màu trắng Đài 5 rời, hình tam giác Tràng 5, hình tam giác, rời Nhị 5,

chỉ nhị dính thành 1 cột ở trung tâm, hình sao; bao phấn 2 ô

Cụm hoa cái kép 3 lần chùm Hoa cái, cuống dài 1,8 – 2,0 mm Đài và tràng giống như hoa đực, bộ nhụy cấu tạo thường bởi 3 lá noãn hàn liền, 2 – 3 vòi nhụy mập, rời; núm nhụy chia 2 – 3; bầu giữa, 3 ô, mỗi ô có 1 hạt

Quả mọng, khi chín màu xanh, đường kính 6 – 7 mm, cuống quả dài 8 – 15

mm Hạt hình tim, rộng 3 – 4 mm, màu xám nhạt, 2 mặt có hoa văn dạng cục,

viền hạt có răng cưa

- Mùa hoa vào tháng 8 – 10, mùa quả vào tháng 11 – 12

- Phân bố: Hòa Bình, Lào Cai, Hà Giang, Cao Bằng [2]

c Gynostemma laxum (Wall.) Cogn

- Tên khác: Cổ yếm lá bóng, Thư tràng thưa [5]

- Đặc điểm thực vật:

Cây dây leo mảnh, phân nhánh nhiều, nhẵn hoặc có lông tơ rất thưa, gióng dài 10 – 20 cm Lá mỏng, lá kép hình chân vịt, 3 lá chét, cuống dài 1,5 – 4 cm, nhẵn, gân phụ 5 – 7 cặp Lá chét kích cỡ 4 – 10 × 2 – 3 cm; mép lá

hình sóng rãnh Hoa khác gốc Cụm hoa đực hình chùy, mọc ở ngọn hoặc ở nách lá, dài 10 – 30 cm, có lông tơ mịn Tràng hoa 5, rời, màu vàng xanh Kích thước 1,5 × 0,5 mm Nhị 5, hàn liền ở chỉ nhị và bao phấn Cụm hoa cái

giống cụm hoa đực, bầu hình cầu, đường kính 1 mm Vòi nhụy 3, rời, xẻ đôi ở đỉnh Quả hình cầu, to 6 – 8 cm, màu vàng xanh, nhẵn, không tự mở, hơi dẹt

Hạt 2 – 3, hình trứng rộng, đường kính 4 mm [5], [10] Mùa hoa vào tháng 5

1.1.2 Thành phần hóa học của các loài Giảo cổ lam

1.1.2.1 Saponin trong Giảo cổ lam

1 2

3 4 5

8 9 10

11

12 13

14 15 16

17 18 19

Hình 1.1 Cấu trúc Dammaran thuộc nhóm Saponin triterpen tetracyclic

Các nghiên cứu đầu tiên đã phát hiện saponin có mặt trong Giảo cổ lam thuộc nhóm dammaran (hình 1.1) Dammaran là nhóm saponin triterpenic có

cấu trúc 4 vòng (triterpenoid tetracyclic) Trong công thức phân tử có 30 carbon và do 6 nhóm hemiterpen ghép lại theo qui tắc đầu đuôi Các saponin thuộc nhóm này xuất hiện nhiều trong các cây thuộc chi Panax L., họ Araliaceae Đặc biệt các saponin trong Nhân sâm (Panax ginseng C A

Mayer) cho thấy nhiều tác dụng quí đã được nhiều nhà khoa học trên thế giới

nghiên cứu

a Loài Gynostemma pentaphyllum (Thunb.) Makino:

Đã có trên 100 saponintrong thành phần Gynostemma pentaphyllum

(Thunb.) Makino được phân lập và nhận dạng cấu trúc, trong đó có 8 saponin

giống như loại protoPanaxadiol trong ginsenosid của Panax ginseng C A

Mayer là Rb1 (Gypenosid III) [31], [42], Rc [33], Rb3 (Gypenosid IV), Rd

(Gypenosid VIII), F2 [33], Rg3 [35], malonyl-Rb1 và malonyl-Rd [38]

Ngoài ra cũng phát hiện Rf là 1 protoPanaxatriol [33] Những ginsenosid đó

chiếm khoảng 25% tổng gypenosid toàn phần trong cây và là minh chứng đầu

tiên của nhóm saponin nhân sâm được tìm thấy ngoài họ Araliaceae [32] Một

số Gypenosid XXVIII, XXXVII, LV, LXII, LXIII cũng tìm thấy trong loài

các gypenosid được phát hiện lần đầu ở loài G pentaphyllum (Thunb.)

OOH O

OCH3

CH 2 O OH Glu O Rha

Hình 1.2a Cấu trúc saponin trong G pentaphyllum (Thunb.) Makino Hình 1.2b Các dạng cấu trúc R7

Hình 1.2 Khung cấu trúc saponin trong G pentaphyllum (Thunb.) Makino

Bảng 1.1 Saponin thường gặp trong G pentaphyllum (Thunb.) Makino

R1 Đường glu, rham, xyl, có thể 1 hoặc 2,

3 đường kết hợp với nhau R2 - H

- OH

Gypenosid I, Rb1 Gynos TN1, Gynos TN2 R3 - CH3

- CH2OH

- CHO

Gypenosid I, Rb1

Gylongiposid I R4 - OH

- H

= O

Rb1 Gylongiposid I Gypentonosid A R5 - OH

- đường đôi; thường là glu kết hợp với

rha ho ặc xyl

Rg3, Rf Rb1, gymnemasid II

R6 - CH 3

- CH 2 OH

- CH 2 O -glu ho ặc CH 2 O –xyl

Rb1

R7 Có th ể là a, b, c, d, e, f, g, h hoặc i Các ginsenoid đều có cấu trúc a

Loại đường chính trong saponin của G pentaphyllum (Thunb.) Makino

(hầu hết thuộc dạng pyranose) là β-D-glucose, β-D-xylose, L-rhamnose, L-arabinose nối ở vị trí C-3(β) và C-20 Các nhóm chức tiêu biểu là -OH, -CH¬3, -CHO, các alcol và ít phổ biến hơn cả là nhóm chức ceton ở vị trí C-19 (R3) Nhóm –OH cũng có ở vị trí C-2(α) và C-12(β) [31], [32]

O

R2

R 1

O OH

28 29

30

12 24

26 27

18

Hình 1.3 Cấu trúc epoxy dammaran từ G.pentaphyllum (Thunb.) Makino

Các saponin dạng ocotillon có cầu nối epoxy tại vị trí C-17 cũng được phát hiện với cấu trúc 3β, 12β, 23S, 24R-tetrahydroxy-20S, 25-epoxydammaran và (20S, 24S)-20,24-epoxy-dammaran-3β, 12β, 25-triol [34]

Các saponin trong G pentaphyllum (Thunb.) Makino đa số ở dạng bột vô định hình, chỉ có một số ít ở dạng tinh thể là gypenosid A [31], Gynogenin II [33] và Gynosaponin TN1 [31]

b Loài Gynostemma longipes C.Y Wu

Năm 1993, Sun và cộng sự đã phát hiện 2 saponin là Gylongosid A: Norfurostan-19-al, 23-hydroxy-4,4,8,14,24-pentamethyl-3-[(2-O-β-D-xylopyranosyl-β-D-xylopyranosyl)oxy]- (3β,16ξ,21β)- (9Cl) và Gylongosid B: 18-Norfurostan-19-al, 3-[(O-6-deoxy-β-L-mannopyranosyl (1→2)-O-β-D-xylopyranosyl-(1→2)-β-D-xylopyranosyl)oxy]-23-hydroxy-4,4,8,14,24 -pentamethyl-, (3β,16ξ,21β)- (9Cl) [40] Năm 1997, Guo và cộng sự đã phân

18-lập được 3 saponin nhân dammaran trong đó có 1 saponin mới là Gylongiposid 1: 19-oxo-3β,20(S),21-trihydroxydammar-24-ene-3-O-{[α-L-rhamnopyranosyl(1-2)][β-D-xylopyranosyl(1-3)]} α-L-arabinopyranoside, còn 2 chất còn lại là gypenosid XLIX và ginsenosid Rb1 [24]

Hình 1.4 Công thức cấu tạo của Gylongosid A

Hình 1.5 Công thức cấu tạo của Gylongosid B

Năm 2010, Phan Thị Thảo đã tiến hành nghiên cứu loài Gynostemma

khối ESI – MS, 1H – NMR, 13C – NMR, DEPT, HMBC, HSQC, 1H - 1H – COSY đã xác định được cấu trúc của GCL1 là (20S,24R)-3β,12β,25-trihydroxy-20,24-epoxydammaran3-O-{[α-L-rhamnopyranosy(1→2)][α-L-rhamnopyranosy(1→3)][β-D-xylopyranosy(1→6)]} β-D-glucopyranoside, đây là một saponin mới nên được đặt tên là vinagynosteside A [17]

Hình 1.6 Công thức cấu tạo của vinagynostesid A

c M ột số loài khác:

- Đã phân lập được saponin 1-8 từ phần trên mặt đất của loài

8 nhóm carboxyl ở cả 2 vị trí C21 và C29, 5 có chứa một nhóm carboxylic ở C-21 và một nhóm chức aldehyd ở C-29, 6 và 7 chứa nhóm carboxylic ở C-21

và 1 nhóm hydroxymethylen ở C-29 [46] Đã nghiên cứu phân lập 6 dammaran glycosid mới từ dịch chiết ethanol của phần trên mặt đất loài

có nhóm carbonyl ở cả C21 và C28, lần đầu tiên được tìm thấy trong họ Cucurbitaceae [48]

1.1.2.2 Nghiên cứu về flavonoid

Flavonoid cũng là một trong những nhóm chất chính trong các loài thuộc

chi Gynostemma Blume nhưng ít được nghiên cứu

- Từ Gynostemma pentaphyllum (Thunb.) Makino đã phát hiện một số

flavonoid là ombuin, ombuoside, rutin [36], quercetin-di-(rhamno)-hexosid,

quercetin-rhamno-hexosid, kaempferol-rhamno-hexosidvà rutinosid [38]

kaempferol-3-O Năm 2006, Yin và các cộng sự đã phân lập được 3 flavonoid là rutin, kaempferol và quercetin từ loài Gynostemma cardiospermum Cogniaux ex

Oliver [48]

- Một nghiên cứu của các tác giả tại Đại học Y Quảng Tây (Trung Quốc)

so sánh hàm lượng của flavonoid trong 6 loài Gynostemma thu hái tại Quảng

Tây bằng phương pháp đo quang phổ tại bước sóng 510 nm, so sánh với chuẩn nội rutin cho kết quả hàm lượng flavonoid toàn phần trong loài

1.1.2.3 Các chất khác

- Sterol: chiếm 1 lượng nhỏ (khoảng 0.0001%) bao gồm các loại ergostanol, sitosterol và stigmasterol [34]

- Nghiên cứu phương pháp xác định chlorophyll và dẫn chất trong G

pentaphyllum (Thunb.) Makino bằng HPLC-MS Đã tách và xác định được

trong G pentaphyllum (Thunb.) Makino có 15 chlorophyll và dẫn chất: Pheophytina, pheophytin a’, chlorophyll a, chlorophyll a’, hydroxypheophytin

a, hydroxypheophytin a’, pheophytin b, pheophytin b’, chlorophyll b, chlorophyll b’, hydroxychlorophyll b, hydroxypheophytin b và hydroxypheophytin b’ [26]

- Bằng phương pháp phân tích điện di mao quản đã phát hiện trong dịch chiết

nước G pentaphyllum (Thunb.) Makino có 1 loại hetero polysaccharid không

tinh bột có thành phần chính là monosaccharid, galactose, arabinose, rhamnose, galacturonic acid, xylose, manosevà acid glucuronic [46]

- Nhóm alcaloid được báo cáo là không có trong G pentaphyllum (Thunb.)

Makino [19]

1.2 TỔNG QUAN VỀ HỆ THỐNG SẮC KÝ LỚP MỎNG HIỆU NĂNG CAO, CAMAG REPROSTAR 3, LINOMAT 5.0

1.3.1 Hệ thống sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao (high performance thin layer chromatography: HPTLC)

Hệ thống thiết bị tinh vi, được điều khiển bởi một nền tảng phần mềm tích hợp đảm bảo đến mức độ cao nhất tính hữu ích, độ tin cậy, và độ lặp lại

của các kết quả [20], [38]

Các dụng cụ:

- Thiết bị chia mẫu

- Thiết bị triển khai sắc ký

- Triển khai sắc ký theo chiều dọc

- Triển khai sắc ký theo chiều ngang

Hiệu quả Cao do kích thước hạt nhỏ

hơn

Thấp hơn

Pha tĩnh Nhiều sự lựa chọn như

silicagel trong trường hợp thông thường và C8, C18cho pha đảo

Silicagel, kielsulguhr,

alumina

Bình khai triển Kiểu mới do yêu cầu lượng

nhỏ hơn của pha động

Yêu cầu lượng lớn hơn

Quét hình ảnh Sử dụng UV / máy quét

huỳnh quang để quét toàn

bộ sắc ký đồ và máy quét

là hình thức cao densitometer

- 366nm, UV bước sóng dài – ánh sáng thường

- Ánh sáng trắng 400 – 750 nm – ánh sáng thường, ánh sáng truyền qua, ánh sáng thường kết hợp ánh sáng truyền qua

Máy ảnh trong các reprostar có thể là máy ảnh thông thường, máy ảnh

lấy ảnh ngay, tuy nhiên tốt nhất là nên sử dụng máy ảnh kỹ thuật số, hoặc một camera hiện đại

Để đảm bảo hình ảnh sắc nét và khả năng lặp lại giữa các lần chụp, trong camag reprostar 3 cần:

Vỏ tủ đảm bảo loại trừ hoàn toàn ánh sáng của môi trường xung quanh,

do đó cammag reprostar 3 thực hiện được việc chụp ảnh dưới các loại ánh sáng trong một phòng không được làm tối [51]

1.3.3 Linomat 5.0

Hình 1.8 Linomat 5.0

Các Linomat 5.0 là thiết bị độc lập và là công cụ lý tưởng cho việc đưa

mẫu lên bản mỏng để triển khai sắc ký lớp mỏng.Với phiên bản được điều khiển bằng phần mềm cho phép HPTLC được ứng dụng rộng rãi Linomat 5.0

là một thiết bị bán tự động có thể thay thế cho thiết bị tự động ATS 4 mà không ảnh hưởng đến chất lượng của hệ thống Thiết bị này được dùng trong phân tích định tính và định lượng, phù hợp với lượng mẫu trung bình Trái ngược với ATS 4, việc thay đổi mẫu đối với Linomat 5.0 được thực hiện thủ công

Các tính năng chính:

- Hoạt động theo chế độ độc lập hoặc theo winCATS

- Đưa mẫu thành dải hẹp bằng cách phun kỹ thuật

- Áp dụng các giải pháp trên sắc ký phẳng

- Hoạt độngbán tự động, việc thay đổi mẫu (làm sạch, làm đầy và thay

thế ống tiêm) được thực hiện bằng tay [20]

CHƯƠNG 2 NGUYÊN LIỆU, THIẾT BỊ, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG

PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Nguyên liệu

Nguyên liệu là phần trên mặt đất của 4 loài Giảo cổ lam với 16 mẫu khác nhau bao gồm:

- Loài Gynostemma pentaphyllum (Thunb.) Makino thu hái tại các địa phương khác nhau gồm: Tam Đảo (5 mẫu), Đà Lạt (4 mẫu), Đắc Nông (1

mẫu), Hòa Bình (3 mẫu) Trong 5 mẫu Tam Đảo, có 3 mẫu có cách trồng khác nhau (trồng ngoài nắng, trồng giâm hom trong nhà lưới, trồng xen kẽ với cây rừng và cây ăn quả), 2 mẫu thu hái tại thời điểm khác nhau (3 tháng, 4 tháng)

- Loài Gynostemma longipes C.Y.W

- Loài Gynostemma laxum (Wall).Cogn

- Loài Gynostemma pubescen (Gagn.) C.Y.W

Dược liệu sau khi thu hái được phơi ở nơi thoáng mát, sấy ở nhiệt độ

600C (tủ sấy Shellab có quạt thông gió), sau đó được nghiền thành bột và được bảo quản trong túi nilon ở nơi khô ráo, thoáng mát

Nguyên liệu thành phẩm: chè Giảo cổ lam Ba Tri (được cung cấp bởi công ty TNHH Hoàng Tùng), Giảo cổ lam Tuệ Linh (được cung cấp bởi công

ty TNHH Tuệ Linh)

2.2 Phương tiện nghiên cứu

2.2.1 Thuốc thử, dung môi, chất chuẩn, dịch chiết so sánh

a Các thuốc thử:

- Dung dịch H2SO4 10%/ EtOH

- Dung dịch vanillin - acid sulfuric được tạo bởi 2 dung dịch:

• Dung dịch 1: vanillin 1%/EtOH

- EtOH, n – BuOH đạt tiêu chuẩn để chiết xuất, được cung cấp bởi công

ty sinh hóa Xilong – Trung Quốc

- CHCl3, MeOH tinh khiết đạt tiêu chuẩn phân tích dùng để triển khai

sắc ký được cung cấp bởi công ty hóa dược phẩm Daejung – Hàn Quốc

c Chất chuẩn Rb1, Rg1

- Ginsenoside Rb1 phân lập từ Panax ginseng C A Mey, được cung

cấp bởi công ty Shanghai tautobiotech, độ tinh khiết đạt ≥ 97%

- Ginsenoside Rg1 phân lập từ Panax ginseng C A Mey, được cung

cấp bởi công ty Shanghai tautobiotech, độ tinh khiết đạt ≥ 98%

d Dịch chiết so sánh: dịch chiết Gynostemma chứa 98% Gypenosid, được

cung cấp bởi công ty Changsha

- Máy cất chân không BÜCHi ROTAVAPOR R-200

- Máy chấm sắc ký Linomat 5.0 (CAMAG, MuTTenz Switzerland)

- Hệ thống máy CAMAG REPROSTAR 3 cùng phần mềm winCATS

- Nồi đun cách thủy, bình chiết và bộ dụng cụ chiết hồi lưu

- Bình định mức, pipet, ống đong và các dụng cụ phân tích cần thiết khác

2.3 Nội dung và phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Khảo sát các điều kiện tiến hành sắc ký lớp mỏng

- Phương pháp chuẩn bị dịch chiết:

Theo mục 1.1.2.1 saponin trong Giảo cổ lam thuộc nhóm dammaran,

xuất hiện nhiều trong các cây thuộc chi Panax L., họ Araliaceae Saponin là

hợp chất phân cực mạnh, tan tốt trong n – BuOH Các tài liệu [25], [30], [41], [43] đã nghiên cứu về thành phần saponin trong một số loài Nhân sâm, kết

quả cho thấy n – BuOH bão hòa nước chiết xuất được phần lớn saponin trong dược liệu Vì vậy, khóa luận đã lựa chọn phương pháp chiết bằng n – BuOH bão hòa nước

Quá trình chiết như sau: Cân 2 gam bột dược liệu, chiết hồi lưu cách

thủy bằng 15 ml EtOH 70% trong 10 phút Lọc lấy dịch chiết EtOH 70%, cô cách thủy đến 5 ml, cho vào bình gạn lắc với 5 ml n – BuOH bão hòa nước

Dịch chiết n – BuOH được cô cách thủy đến 1 ml đem chấm sắc ký

Hình 2.1 Sơ đồ quá trình chiết bằng n – BuOH bão hòa nước

2 gam dược liệu

Dịch chiết EtOH 70%

5 ml dịch chiết EtOH 70%

Cô cách th ủy

1ml dịch chiết n – BuOH đem chấm sắc ký

- Lựa chọn hệ dung môi:

Theo một số tài liệu tham khảo: Dược điển Việt Nam [16], Dược điển Trung Quốc [21], đối với SKLM của saponin dammaran có hệ dung môi CHCl3 – MeOH – H2O với hai tỷ lệ (7 : 3 : 1) và (13 : 7 : 2) cho khả năng phân tách tốt Vì thế, chúng tôi lựa chọn hệ dung môi trên để triển khai sắc

ký, đồng thời điều chỉnh tỉ lệ dung môi để kết quả phân tách của các vết là tốt

nhất

- Lựa chọn thuốc thử hiện màu:

+ Dung dịch H2SO4 10%/EtOH sau khi phun lên bản mỏng sắc ký và sấy nóng sẽ cho màu tím hoa cà với các hợp chất terpenoid

+ Dung dịch vanillin- acid sulfuric sau khi phun lên bản mỏng và sấy nóng sẽ hiện màu khác nhau với các hợp chất khác nhau

- Khảo sát thể tích chấm sắc ký:

Ding Shuli, Zhu Zhaoyi đã nghiên cứu hàm lượng saponin trong 7 loài thuộc chi Gynostemma Blume trong đó có các loài G pentaphyllum (Thunb.) Makino, G.laxum (Wall.) Cogn., G longipes C.Y.W Kết quả lá và thân của các loài này đều chứa 2,37 – 6,98% saponin (so với trọng lượng khô) [50] Để đảm bảo hình ảnh sắc ký đồ cho các vết phân tách rõ ràng thuận lợi cho phân tích kết quả, chúng tôi tiến hành khảo sát trên dịch chiết 2 : 1 (chiết từ 2 gam dược liệu và cô dịch chiết trong n – BuOH đến 1 ml) với các thể tích chấm

sắc ký sau: 1µl; 2µl; 3µl; 4µl; 5µl

2.3.2 Định tính saponin trong Giảo cổ lam bằng sắc ký lớp mỏng

Các mẫu dịch chiết được chấm trên bản mỏng silicagel GF254 bằng máy Linomat 5.0, chụp ảnh sắc ký đồ bằng hệ thống máy CAMAG REPROSTAR

3 cùng phần mềm winCATS