1. Trang chủ
  2. » Luận Văn - Báo Cáo

Xây dựng phương pháp định lượng saponin toàn phần trong giảo cổ lam bằng phương pháp đo quang

63 4,2K 18

Đang tải... (xem toàn văn)

Tài liệu hạn chế xem trước, để xem đầy đủ mời bạn chọn Tải xuống

THÔNG TIN TÀI LIỆU

Thông tin cơ bản

Định dạng
Số trang 63
Dung lượng 0,99 MB

Nội dung

LỜI CẢM ƠNKhóa luận “Xây dựng phương pháp định lượng saponin toàn phần trong Giảo cổ lam bằng phương pháp đo quang” được tôi hoàn thành tại bộ môn Dược liệu, trường Đại học Dược Hà Nội với sự làm việc nghiêm túc, nỗ lực hết mình của bản thân và sự khích lệ từ phía nhà trường, thầy cô, gia đình và bè bạn.Trước hết tôi xin được bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới ThS. Phạm Tuấn Anhngười thầy đã dành nhiều thời gian và tâm huyết hướng dẫn nghiên cứu, giúp tôi hoàn thành khóa luận tốt nghiệp.Tôi xin chân thành cảm ơn ThS. Lê Thanh Bình đã giúp đỡ, chỉ bảo, động viên trong quá trình tôi thực hiện khóa luận tai bộ mônTôi xin chân thành cảm ơn Ban giám hiệu, các thầy cô giáo Trường Đại học Dược Hà Nội cũng như các thầy cô giáo, các anh chị kĩ thuật viên bộ môn Dược liệu đã tạo điều kiện tốt nhất cho tôi trong quá trình học tập và nghiên cứu.Cuối cùng tôi xin tỏ lòng biết ơn gia đình, bạn bè đã động viên tôi về mọi mặt và giúp đỡ tôi tận tình trong quá trình học tập, nghiên cứu, là động lực không nhỏđể tôi có kết quả ngày hôm nay.Chân thành cảm ơnHà Nội, tháng 05 năm 2013Sinh viênTrịnh Thị Diệp Thanh

Trang 1

B Ộ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

ĐỊNH LƯỢNG SAPONIN TOÀN PHẦN

PHƯƠNG PHÁP ĐO QUANG

HÀ N ỘI – 2013

Trang 2

B Ộ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

ĐỊNH LƯỢNG SAPONIN TOÀN PHẦN

PHƯƠNG PHÁP ĐO QUANG

Trang 3

LỜI CẢM ƠN

Khóa luận “Xây dựng phương pháp định lượng saponin toàn phần trong Giảo

cổ lam bằng phương pháp đo quang” được tôi hoàn thành tại bộ môn Dược liệu,

trường Đại học Dược Hà Nội với sự làm việc nghiêm túc, nỗ lực hết mình của bản thân và sự khích lệ từ phía nhà trường, thầy cô, gia đình và bè bạn

Trước hết tôi xin được bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới ThS Phạm Tuấn Anh

người thầy đã dành nhiều thời gian và tâm huyết hướng dẫn nghiên cứu, giúp tôi hoàn thành khóa luận tốt nghiệp

Tôi xin chân thành cảm ơn ThS Lê Thanh Bình đã giúp đỡ, chỉ bảo, động viên trong quá trình tôi thực hiện khóa luận tai bộ môn

Tôi xin chân thành cảm ơn Ban giám hiệu, các thầy cô giáo Trường Đại học Dược Hà Nội cũng như các thầy cô giáo, các anh chị kĩ thuật viên bộ môn Dược

liệu đã tạo điều kiện tốt nhất cho tôi trong quá trình học tập và nghiên cứu

Cuối cùng tôi xin tỏ lòng biết ơn gia đình, bạn bè đã động viên tôi về mọi mặt

và giúp đỡ tôi tận tình trong quá trình học tập, nghiên cứu, là động lực không nhỏ

để tôi có kết quả ngày hôm nay

Chân thành cảm ơn!

Hà N ội, tháng 05 năm 2013

Sinh viên

Trịnh Thị Diệp Thanh

Trang 4

MỤC LỤC

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG I TỔNG QUAN 2

1.1 TỔNG QUAN VỀ SAPONIN VÀ SAPONIN NHÂN DAMMARAN 2

1.1.1 Saponin 2

1.1.2 Saponin nhân Dammaran 2

1.2 TỔNG QUAN VỀ CHI GYNOSTEMMA BLUME VÀ LOÀI GYNOSTEMMA PENTAPHYLLUM 6

1.2.1 Chi Gynostemma Blume 6

1.2.2 TỔNG QUAN VỀ LOÀI GYNOSTEMMA PENTAPHYLLUM 7

1.3 MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP CHIẾT XUẤT, TINH CHẾ VÀ ĐỊNH LƯỢNG SAPONIN 9

1.3.1 Chiết xuất 9

1.3.2 Tinh chế 9

1.3.3 Định lượng 10

1.4 TỔNG QUAN VỀ QUANG PHỔ TỬ NGOẠI-KHẢ KIẾN (UV – VIS) 11

1.4.1 Phổ hấp thụ UV-VIS 11

1.4.2 Định luật Lambert – Beer 11

1.4.3 Ứng dụng quang phổ UV-VIS trong phân tích định lượng dung dịch một thành phần 13

1.5 TỔNG QUAN VỀ NHỰA HẤP PHỤ 15

1.5.1 Định nghĩa và phân loại 15

1.5.2 Ứng dụng trong tách và tinh chế Saponin 15

CHƯƠNG 2 NGUYÊN VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 17

2.1 NGUYÊN VẬT LIỆU, THIẾT BỊ, HÓA CHẤT 17

2.1.1 Nguyên liệu 17

2.2.2 Dụng cụ thiết bị 17

Trang 5

2.1.3 Hóa chất 18

2.2 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 18

2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18

2.3.1 Chiết xuất 18

2.3.2 Tinh chế 22

2.3.3 Định lượng bằng phương pháp đo quang 22

2.3.4 Thẩm định và đánh giá phương pháp 24

2.3.5 Phương pháp xử lý số liệu 25

2.3.6 Ứng dụng phương pháp xây dựng được để định lượng saponin toàn phần trong một số mẫu Giảo cổ lam 27

CHƯƠNG 3 THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ 28

3.1 KHẢO SÁT PHƯƠNG PHÁP CHIẾT XUẤT VÀ TINH CHẾ MẪU 28

3.1.1 Khảo sát phương pháp chiết xuất 28

3.1.2 Khảo sát phương pháp tinh chế 29

3.1.3 Quy trình xử lí mẫu 30

3.3 KHẢO SÁT CỰC ĐẠI HẤP THỤ QUANG VÀ ĐIỀU KIỆN PHẢN ỨNG 31

3.3.1 Khảo sát cực đại hấp thụ quang 31

3.3.2 Khảo sát điều kiện phản ứng 32

3.4 THẨM ĐỊNH VÀ ĐÁNH GIÁ PHƯƠNG PHÁP UV-VIS KHI ĐỊNH LƯỢNG SAPONIN TOÀN PHẦN TRONG GIẢO CỔ LAM 36

3.4.1 Thẩm định phương pháp 36

3.4.2 Đánh giá phương pháp 41

3.5 ỨNG DỤNG PHƯƠNG PHÁP VỪA XÂY DỰNG VÀO ĐỊNH LƯỢNG MỘT SỐ MẪU GIẢO CỔ LAM 42

3.5.1 Quy trình định lượng 42

3.5.2 Xây dựng công thức tính hàm lượng saponin toàn phần trong GCL 44

3.5.3 Kết quả 44

3.6 BÀN LUẬN 45

3.6.1 Về phương pháp chiết xuất và tinh chế mẫu 45

Trang 6

3.6.2.Về khảo sát điều kiện đo quang 45

3.6.3.Về thẩm định phương pháp định lượng 45

3.6.5.Về kết quả định lượng saponin trong các mẫu Giảo cổ lam 47

CHƯƠNG 4 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 48

4.1 KẾT LUẬN 48

4.2 ĐỀ XUẤT 49

Trang 7

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

C chuẩn , C thử : Nồng độ của chất chuẩn, chất thử

ELSD : Detector tán xạ bay hơi

(Evaporative light scattering detector)

ESI : Ion hóa bằng phun điện tử (Electronspray ionization)

Trang 8

DANH MỤC BẢNG BIỂU

1 B ảng 1.1 Các nhóm thế và một số saponin tương ứng trong G

2 B ảng 3.1 Hàm lượng saponin toàn phần thu được từ GCL bằng

các phương pháp và dung môi chiết khác nhau 28

3 B ảng 3.2 Kết quả khảo sát dung môi rửa giải 29

4 Bảng 3.3 Ảnh hưởng của nhiệt độ tới phản ứng 33

5 Bảng 3.4 Ảnh hưởng của thời gian phản ứng 33

6 Bảng 3.5 Ảnh hưởng của nồng độ thuốc thử vanillin 34

7 Bảng 3.6 Ảnh hưởng của nồng độ acid perchloric 35

8 Bảng 3.7 Kết quả xây dựng đường chuẩn 37

9 Bảng 3.8 Kết quả khảo sát độ lặp lại của phương pháp 38

10 Bảng 3.9 Kết quả khảo sát độ đúng của phương pháp 40

11 Bảng 3.10 Kết quả định lượng saponin toàn phần trong GCL bằng

phương pháp cân và phương pháp UV-VIS 41

12 B ảng 3.11 Kết quả định lượng saponin toàn phần trong các mẫu

Trang 9

4 Hình 1.4 Công thức cấu tạo của Ginsenoside Rb1 5

5 Hình 1.5 Ảnh của cây Giảo cổ lam 7

6 Hình 1.6 Kĩ thuật thêm đường chuẩn 14

7 Hình 2.1 B ộ dụng cụ chiết soxhlet 19

8 Hình 2.2 Bộ dụng cụ chiết hồi lưu 20

9 Hình 2.3 Máy chiết siêu âm 20

10 Hình 2.4 Sơ đồ định lượng saponin toàn phần theo phương pháp

cân bằng các phương pháp chiết và dung môi khác nhau 21

11 Hình 3.1 Quy trình tinh ch ế saponin bằng chiết lỏng-rắn và chiết

12 Hình 3.2 Phổ hấp thụ của sản phẩm phản ứng 32

13 Hình 3.3 Đồ thị ảnh hưởng của nhiệt độ phản ứng 33

14 Hình 3.4 Đồ thị ảnh hưởng của thời gian phản ứng 34

15 Hình 3.5 Đồ thị ảnh hưởng của nồng độ thuốc thử Vanilin 35

16 Hình 3.6 Đồ thị ảnh hưởng của nồng độ thuốc thử acid perchloric 36

17 Hình 3.7 Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc mật độ quang vào nồng độ

chất chuẩn tại bước sóng 550nm 37

18 Hình 3.8 Đồ thị xác định hàm lượng saponin toàn phần trong

mẫu GCL theo kỹ thuật thêm đường chuẩn 39

Trang 10

ĐẶT VẤN ĐỀ

Ngày nay trên thế giới, xu hướng trở về với thiên nhiên, tìm kiếm nguồn thuốc mới và sử dụng thuốc từ thảo dược ngày càng tăng Giảo cổ lam là một vị thuốc quý được người dân ở nhiều nước châu Á sử dụng từ lâu đời nhằm tăng cường sức khỏe

và tuổi thọ Nhiều báo cáo khoa học chứng minh một số tác dụng sinh học của Giảo

cổ lam như: hạ đường huyết, giảm cholesterol, giảm triacylglycerol máu …, trong

đó saponin được cho là thành phần tạo nên các tác dụng sinh học này

Trên thị trường Việt nam hiện nay xuất hiện rất nhiều chế phẩm Giảo cổ lam dưới dạng trà và được người dân sử dụng rộng rãi Vì vậy việc quản lí chất lượng dược liệu là một vấn đề cần được chú trọng để đảm bảo chất lượng của các sản phẩm cũng như việc sử dụng thuốc trong dân gian có hiệu quả Tuy nhiên Dược điển Việt Nam chưa có chuyên luận về dược liệu Giảo cổ lam nên quá trình đánh giá còn gặp nhiều khó khăn

Với mục đích xác định hàm lượng saponin trong Giảo cổ lam, đồng thời xây

dựng phương pháp định lượng saponin trong các chế phẩm Giảo cổ lam đang được

sử dụng tại Việt Nam, giúp kiểm nghiệm viên có thêm nhiều lựa chọn khi tìm phương pháp kiểm nghiệm phù hợp với điều kiện thực tế nơi làm việc, chúng tôi đã

tiến hành đề tài: “Xây dựng phương pháp định lượng saponin trong Giảo cổ lam

bằng phương pháp đo quang” với các mục tiêu cụ thể như sau:

1 Xây dựng quy trình chiết xuất và tinh chế saponin toàn phần từ dược liệu

Trang 11

Phân loại, cấu trúc hóa học

- Về mặt phân loại, dựa theo cấu trúc hoá học có thể chia thành saponin triterpenoid và saponin steroid

- Saponin triterpenoid có loại trung tính và loại acid, saponin steroid có loại trung tính và loại kiềm

- Saponin triterpenoid có phần genin gồm 30 carbon cấu tạo bởi 6 nhóm hemiterpene, chia làm 2 loại: Saponin triterpenoid pentacyclic và saponin triterpenoid tetracyclic

+ Saponin triterpenoid pentacyclic: gồm 4 nhóm là olean, ursan, lupan hopan +Saponin triterpenoid tetracyclic: gồm 3 nhóm là dammaran, lanostan và cucurbitan

- Saponin steroid được chia thành 5 nhóm: nhóm spirostan, nhóm furostan, nhóm aminofurostan, nhóm spirosolan và nhóm solanidan

1.1.2 Saponin nhân Dammaran

Theo các nghiên cứu [24], [27], [32] saponin là một trong những nhóm chất chính của các loài trong chi Gynostemma, trong đó chủ yếu là các saponin thuộc nhóm Dammaran Do đó, chúng tôi tổng quan sâu hơn về nhóm cấu trúc này

Dammaran là nhóm saponin triterpenic có cấu trúc 4 vòng (triterpenoid tetracyclic) Trong công thức phân tử có 30 carbon và do 6 nhóm hemiterpen ghép

lại theo qui tắc đầu đuôi Các saponin thuộc nhóm này xuất hiện nhiều trong các cây thuộc chi Panax, họ Araliaceae Đặc biệt saponin trong nhân sâm (Panax ginseng)

có nhiều tác dụng quí đã được nhiều nhà khoa học trên thế giới nghiên cứu

Trang 12

1 2

3 4

5

6 7

8 9 10

11

12 13

14 15 16

17 18

Hình 1.1 Cấu trúc của các Dammaran thuộc nhóm Saponin triterpen tetracyclic

Tác dụng sinh học của các saponin nhân Dammaran

Có rất nhiều các nghiên cứu về tác dụng của triterpenoid dammaran trong nhân sâm và các loài thuộc chi Gynostemma, trong đó nổi bật là các tác dụng

- Chống mệt mỏi và tăng sức đề kháng: các saponin triterpenoid tetracyclic nhóm dammaran của nhâm sâm có tác dụng cải thiện rõ rệt tinh thần cũng như thể

chất, tác dụng kéo dài thời gian sống trên động vật thí nghiệm bị nhiễm bệnh cũng

đã được chứng minh

- Tác dụng hạ cholesterol đã được chứng minh trên động vật thí nghiệm

- Tác dụng hạ đường huyết do các saponin này có khả năng chuyển glucose thành glycogen và ngăn ngừa hiện tượng giảm glycogen

• Các saponin trong chi Gynostemma

Các nghiên cứu đầu tiên đã phát hiện saponin có mặt trong giảo cổ lam thuộc

nhóm dammaran Đã có trên 100 saponin trong thành phần G pentaphyllum được

phân lập và nhận dạng cấu trúc, trong đó có 8 saponin giống như loại protopanaxadiol trong ginsenosid của Panax ginseng là Rb1 (Gypenosid III) [24],

[32], Rc [27], Rb3 (Gypenosid IV), Rd (Gypenosid VIII), F2 [27], Rg3 [29], malonyl-Rb1 và malonyl-Rd [24] Ngoài ra cũng phát hiện Rf là 1 protopanaxatriol [27] Những ginsenosid đó chiếm khoảng 25% tổng gypenosid toàn phần trong cây

và là minh chứng đầu tiên của nhóm saponin nhân sâm được tìm thấy ngoài họ Araliaceae Một số Gypenosid XXVIII, XXXVII, LV, LXII, LXIII cũng tìm thấy

trong loài Gymnema sylvestra [35] Các saponin còn lại chiếm phần lớn các

Trang 13

gypenosid được phát hiện lần đầu ở loài G pentaphyllum Cấu trúc một số saponin trong G pentaphyllum được trình bày ở hình 1.2, hình 1.3 và bảng 1.1

R3

- CH3 hoặc - CH2OH

- CHO

Gypenosid I, Rb1 Gylongiposid I

R5

- OH

- đường đôi

Rg3, Rf Rb1, gymnemasid II

R6

- CH3 hoặc - CH2OH

- CH2O -glu hoặc CH2O –xyl Rb1

R7 Có thể là a, b, c, d, e, f, g, h hoặc i Các ginsenoid đều có cấu trúc a

Trang 14

Loại đường chính trong saponin của GCL (hầu hết thuộc dạng pyranose) là D-glucose, β-D-xylose, α-L-rhamnose, α-L-arabinose nối ở vị trí C-3(β) và C-20 Các nhóm chức tiêu biểu là -OH, -CH3, -CHO, các alcol và ít phổ biến hơn cả là nhóm chức ceton ở vị trí C-19 (R3) Nhóm –OH cũng có ở vị trí C-2(α) và C-12(β) Các saponin dạng ocotillon có cầu nối epoxy tại vi trí C-17 cũng được phát

β-hiện với cấu trúc 3β, 12β, 23S, 24R-tetrahydroxy-20S, 25-epoxydammaran và (20S, 24S)-20,24-epoxy-dammaran-3β, 12β, 25-triol [26] Các saponin trong GCL đa số ở dạng bột vô định hình, chỉ có một số ít ở dạng tinh thể là gypenosid A [28] và gynosaponin TN1 [30]

- Độ tan: tan tốt trong MeOH, EtOH,

H2O

- Tác dụng dược lý: tác dụng an thần,

tốt cho đường tiêu hóa, tăng sức chịu đựng, bảo vệ gan và là chất chống oxy hóa, chống mệt mỏi, chống co giật,

giảm đau và chống loét [17]

Trang 15

1.2 TỔNG QUAN VỀ CHI GYNOSTEMMA BLUME VÀ LOÀI

GYNOSTEMMA PENTAPHYLLUM

1.2.1 Chi Gynostemma Blume

Vị trí phân loại chi Gynostemma

Theo các tài liệu [10], [13], chi Gynostemma được xếp vào họ Cucurbitaceae

(họ bầu bí) Vị trí của chi Gynostemma trong hệ thống phân loại thực vật dược:

Đặc điểm thực vật và phân bố của chi Gynostemma

Chi Gynostemma được mô tả đầu tiên bởi Blume vào năm 1825 dựa trên đặc

điểm hình thái của loài G simplicifolium [34] Từ đó đến nay, đã có thêm nhiều loài được mô tả Các loài thuộc chi Gynostemma có các đặc điểm chung [10], [34]:

Cây thảo, mảnh, thân leo, sống lâu năm Lá kép, ít khi là lá đơn, lá khía răng cưa Tua cuốn chẻ đôi, đôi khi có tua cuốn đơn Cụm hoa khác gốc, dạng chùy

mảnh, dài, nhất là đối với hoa đực Hoa nhỏ, màu trắng hoặc lục nhạt, có lá bắc con;

cuống hoa có đốt Đài hoa hình bánh xe, chia 5 thùy, ngắn Tràng hình bánh xe, hơi hàn liền phần gốc tràng, có đầu nhọn Nhị 5, ở phần gốc chỉ nhị hàn liền thành cột Bao phấn 1 ô, nhưng nhìn có vẻ như 2 ô Bầu hình cầu nhỏ, 2-3 ngăn, 2-3 vòi nhụy

với đầu nhụy chia 2-3 đầu nhọn Quả hình cầu lớn hơn hạt đậu, không mở, 2-3 hạt hình trứng hơi dẹt 2 bên hoặc có 3 góc Hạt sần sùi

Các loài của chi Gynostemma phân bố chủ yếu ở vùng nhiệt đới châu Á và Đông Nam Á từ Himalaya tới Nhật Bản, Malaysia và Tân Guinea Loài G

pentaphyllum là loài phổ biến nhất, phân bố ở Ấn Độ, Nepal, Bangladesh, Srilanca, Lào, Myama, Hàn Quốc, Nhật Bản và Việt Nam [34]

Trang 16

Các loài trong chi Gynostemma tại Việt Nam

Ở Việt Nam, theo Võ Văn Chi và Phạm Hoàng Hộ [5], [10], chi Gynostemma

có 2 loài G pentaphyllum (Thunb.) Makino và G laxum (Wall.) Cogn Năm 2009

Ths Hoàng Văn Lâm đã công bố thêm 1 loài mới thuộc chi Gynostemma, bổ sung

vào hệ thực vật Việt Nam là G longipes C.Y Wu in C.Y WU & S.K Chen [22] Tính đến nay đã có 3 loài thuộc chi Gynostemma đã được công bố ở Việt Nam

1.2.2 TỔNG QUAN VỀ LOÀI GYNOSTEMMA PENTAPHYLLUM

Đặc điểm thực vật

Hình 1 5 Ảnh cây Giảo cổ lam

Cây thảo mọc leo, yếu, thân cành

mảnh, có góc cạnh không lông hoặc có lông thưa thớt ở mấu Lá kép chân vịt,

cuống chung dài 3-4 cm, phiến do 5-7

lá chét với mép có răng Tua cuốn mảnh, xẻ đôi ở đỉnh Cụm hoa đực

dạng chùm kép, cuống cụm hoa mảnh, phân nhánh nhiều, cỡ 10-15cm

Hoa có cuống mảnh cỡ 1-4 mm, ống đài rất ngắn, thùy đài hình tam giác, đỉnh nhọn, tràng màu xanh nhạt hoặc trắng, thùy tràng hình bầu dục hoặc mũi mác cỡ 2,5-3 × 1mm, đỉnh nhọn có 1 gân, nhị 5 Cụm hoa cái dạng chùm ngắn hơn hoa đực Hoa cái có đài và tràng giống như hoa đực, bầu hình cầu 2-3 ô, vòi nhụy 3, núm nhụy có 2 thùy Quả không tự mở, hình cầu, đường kính 5-6 mm, khi chín màu đen,

2 hạt Hạt hình trứng hoặc hình tim, màu nâu, đỉnh tù gốc hình tim dẹt [5], [6], [7]

Phân bố, thu hái

Tại Việt Nam cây mọc ở rừng, rừng thưa, lùm bụi từ vùng đồng bằng đến độ cao 2000m, ở nhiều nơi như Lào Cai, Lạng Sơn, Quảng Ninh, Hòa Bình, Vĩnh Phúc, Đà Lạt, Đắc Nông, Thừa Thiên Huế, Kon Tum, Đồng Nai [5], [6]

Trang 17

Thành phần hóa học

Bằng các phản ứng hoá học đã xác định trong cây có chứa saponin, flavonoid, acid amin, acid hữu cơ, sterol, đường khử [4], [9], [11], [14], [20] Bằng phương pháp đo phổ phát xạ tia X đã xác định được trong cây có 15 nguyên tố vô cơ: Al, Si,

Mg, P, K, Mn, Na, Fe, Ba, Ti, Cu, Cr, Pb, Ag Trong đó, nguyên tố có hàm lượng cao nhất là Si (10%), thấp nhất là Ag (0.0001%) [7]

Tác dụng dược lý

Trên thế giới loài G pentaphyllum đã được nghiên cứu nhiều về tác dụng sinh

học, trong đó [19]:

- Tác dụng hạ cholesterol: các gypenosid trong G pentaphyllum làm giảm

cholesterol toàn phần, lipoprotein tỉ trọng thấp (LDL) và rất thấp (VLDL), làm tăng lipoprotein tỉ trọng cao (HDL) và tỉ lệ HDL/LDL

- Trên đường huyết: các dịch chiết gypenosid với liều uống 100 và 200 mg/kg thể trọng chuột trong 2 tháng đã ngăn chặn được bệnh tăng đường huyết ở chuột cống lão hóa và cải thiện được khả năng dung nạp đường ở chuột lão hóa nuôi bằng glucose (2g/kg)

- Tác dụng trên tim mạch: gypenosid (nồng độ 50, 100 và 200 µg/ml) có tác dụng bảo vệ cơ tim bằng cách hạn chế thiệt hại do sự thiếu glucose và oxygen, ức chế giải phóng men creatine phosphokinase và lactate dehydrogenase (LDH)

- Tác dụng lên hệ miễn dịch: gypenosid đưa vào dạ dày chuột nhắt liều 300 mg/kg thể trọng trong 7 ngày gây tăng chức năng thực bào ở đại thực bào, tăng thành phần có hoạt tính trong huyết thanh, giảm lượng kháng thể tiêu huyết Lượng IgG huyết thanh tăng và tăng thời gian sống sót của chuột được ghép cơ tim

- Tác dụng chữa khối u: tác dụng này do một vài saponin có trong G

pentaphyllum Khi dùng gypenosid liều 30mg/kg và 300mg/kg qua dạ dày hoặc 120mg/kg tiêm phúc mạc theo dõi trong 10 ngày nhận thấy tác dụng cản trở quá trình gây u sarcoma (S180) ở chuột nhắt

- Cao G pentaphyllum (450 mg/kg) ức chế những hoạt động tự phát của chuột

nhắt khi quan sát tác dụng giảm đau của chuột đang ở trên tấm kim loại nóng

Trang 18

Các nghiên cứu về loài G pentaphyllum ở Việt Nam cho thấy dược liệu GCL

có tác dụng chống oxy hóa, hạ cholesterol máu, hạ đường huyết, chống khối u và tăng đáp ứng miễn dịch [2], [7], [8], [11], [12]

1.3 MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP CHIẾT XUẤT, TINH CHẾ VÀ ĐỊNH LƯỢNG SAPONIN

1.3.1 Chiết xuất [15]

- Saponin loại trung tính và acid: bột dược liệu được chiết với ether dầu hỏa để loại chất béo, chiết saponin bằng methanol-nước (4:1) Loại methanol dưới áp suất giảm Hoà cặn trong nước được dung dịch 10% rồi lắc với n-butanol Tách lớp n-butanol, bốc hơi dung môi dưới áp suất giảm rồi hoà cặn với methanol để chấm sắc

ký Có thể tinh chế thêm bằng cách rót từ từ dung dịch methanol vào ether có lượng lớn gấp 10-15 lần (có thể dùng aceton hoặc n-hexan thay ether)

- Saponin kiềm thuộc nhóm spirosolan và solanidan có thể chiết như sau: bột dược liệu thêm methanol đun nóng đến sôi trên nồi cách thủy Dịch lọc đem bốc hơi đến khô Cắn được hoà tan trong acid acetic 5%, đun nóng đến 800C rồi kiềm hoá bằng amoniac Tủa được ly tâm rồi hoà tan vào ethanol 96% để chấm sắc ký

- Dùng Sephadex loại G-25, G-50, G-75: lượng Sephadex dùng gấp 50 lần saponin, đem ngâm nước cất cho trương lên, gạn lượng nước thừa, cho gel vào cột sắc ký

Dung dịch đậm đặc saponin trong nước cho lên phần trên cột rồi khai triển bằng nước cất Saponin có phân tử lớn sẽ ra khỏi cột trước saponin có phân tử nhỏ

- Saponin steroid có thể tinh chế bằng cách kết hợp với cholesterol: 1g saponin hoà trong 200ml ethanol đun nóng đến 50-600C rồi cho tác dụng với một dung dịch

Trang 19

Trong đó

S: hàm lượng saponin (%) a: khối lượng saponin toàn phần (g) M: khối lượng dược liệu (g)

chứa 2g cholesterol trong 200ml ethanol đã đun nóng, tủa phức sẽ tạo thành Lọc tủa, sấy khô, phá phức bằng cách hoà tan trong pyridin Saponin tinh khiết được tủa trong ether Hoà tan trong methanol để loại hết cholesterol rồi lại tủa với ether

1.3.3 Định lượng [15]

Phương pháp cân

Bột dược liệu được chiết với ether dầu hỏa để loại chất béo, sau đó chiết saponin bằng MeOH:H2O = 4:1 Loại MeOH dưới áp suất giảm Hòa cặn trong nước để có dung dịch 10% rồi lắc với n-butanol Tách lớp n-butanol, bốc hơi dung môi dưới áp suất giảm đến cắn, để trong bình hút ẩm, cân đến khi khối lượng không đổi Thực hiện thao tác chiết, cân, lấy trung bình 3 lần và suy ra lượng saponin thô toàn phần trong dược liệu

Công thức: Hàm lượng saponin toàn phần

Cân cắn và tính hàm lượng các cắn theo công thức:

S =

) 1

nước-methanol-Detector dùng để phát hiện gồm xác định chỉ số khúc xạ (RI) hay tán xạ bay hơi (ELSD) Detector có nhiều ưu điểm nhất hiện nay là detector khối phổ (MS hay

Trang 20

MS/MS với kĩ thuật ion hóa ESI hay APCI) Do các saponin ít có các nối đôi, nhất

là nối đôi liên hợp nên chỉ hấp thụ tử ngoại ở vùng sóng ngắn 195-210 nm, do đó việc sử dụng detector UV tương đối hạn chế trong phân tích saponin

1.4 TỔNG QUAN VỀ QUANG PHỔ TỬ NGOẠI-KHẢ KIẾN (UV – VIS) 1.4.1 Ph ổ hấp thụ UV-VIS [1]

Khi tia bức xạ tương tác với vật chất có thể xảy ra một số quá trình: phản xạ, tán xạ, hấp thụ, huỳnh quang và quang hóa Khi đo quang phổ tử ngoại khả kiến, người ta mong muốn chỉ có quá trình hấp thụ xảy ra Vì bức xạ điện từ là các hạt mang năng lượng nên khi phân tử hấp thụ, nó sẽ kích thích hệ electron của phân tử

và làm tăng nội năng của nó Năng lượng tổng của một phân tử bao gồm: năng lượng chuyển động tịnh tiến của phân tử (Et), năng lượng của điện tử (Ee), năng lượng của các dao động (Ev) và năng lượng của chuyển động quay (Er)

Etổng = Et + Ee + Ev + Er (Ee >> Ev >> Er)

Sự hấp thụ bức xạ tử ngoại-khả kiến có thể làm thay đổi mức năng lượng điện

tử Ee và là nguồn gốc của phổ UV-VIS Do đó phổ UV-VIS được gọi là phổ điện tử

1.4.2 Định luật Lambert – Beer [1]

Chiếu một chùm tia sáng đơn sắc có bước sóng λ và cường độ I0 qua dung dịch đồng nhất có nồng độ C, bề dày lớp dung dịch là L Khi đi qua dung dịch, một phần ánh sáng sẽ bị hấp thụ lại, một phần bị phản xạ, phần còn lại sẽ đi qua dung dịch với cường độ I

Mối quan hệ giữa phần ánh sáng I và thể hiện bằng định luật Lambert - Beer

Với ε là hệ số hấp thụ riêng của dung dịch Hệ số này không phụ thuộc nồng

độ, chỉ phụ thuộc vào bản chất của chất tan và bước sóng của ánh sáng chiếu vào dung dịch

* Điều kiện ứng dụng của định luật

- Chùm tia sáng phải đơn sắc

- Dung dịch phải loãng (nằm trong khoảng nồng độ thích hợp)

Trang 21

- Dung dịch phải trong suốt

- Chất thử phải bền trong dung dịch và phải bền dưới tác dụng của ánh sáng (UV – VIS)

* Một số đại lượng thông dụng

- Độ truyền qua (hay còn gọi là độ thấu quang)

Đặc trưng cho độ trong suốt (về mặt hóa học) của dung dịch, được định nghĩa

Thường T tính ra phần trăm Một chất có T=1 (hay 100%) nghĩa là hoàn toàn không có hấp thụ ánh sáng, người ta nói chất đó hoàn toàn trong suốt

- Độ hấp thụ

Độ hấp thụ (hay còn gọi là mật độ quang) được định nghĩa:

Đối với 1 chất xác định (có ε xác định) thường đo trên 1 loại cốc đo và thường

có bề dày l=1cm, như vậy độ hấp thụ tỉ lệ thuận với nồng độ dung dịch:

- Hệ số hấp thụ riêng (

Theo công thức nếu l=1cm, C=1% thì

Vậy chính là độ hấp thụ của dung dịch có nồng độ 1%, dùng cốc đo có

bề dày 1cm Với 1 chất tan xác định, tại một ε xác định, là một hằng số

- Hệ số hấp thụ phân tử (

Hệ số hấp thụ phân tử (còn gọi là hệ số mol) là độ hấp thụ của dung dịch có nồng độ 1M, dùng cốc đo có bề dày 1cm

Trang 22

Cũng như , với 1 chất xác định, trong điều kiện đo nhất định (bước sóng, dung môi, nhiệt độ…) là 1 hằng số

Giữa và có mối liên hệ

Trong đó: M là phân tử lượng gam của chất tan

1.4.3 Ứng dụng quang phổ UV-VIS trong phân tích định lượng dung dịch một thành phần [3]

Đối với dung dịch một thành phần có thể sử dụng các kĩ thuật định lượng sau

• Tính toán trực tiếp từ mật độ quang đo được

Với các chất có mật độ hấp thụ riêng biết trước chính xác và ổn định ở một bước sóng nào đó, người ta có thể đo mật độ quang của dung dịch chất đó trong dung môi tương ứng tại bước sóng này Nồng độ dung dịch được tính theo công

thức:

Muốn áp dụng kĩ thuật này máy quang phổ phải được chuẩn hóa về bước sóng

và giá trị mật độ quang, dung dịch phải trong suốt và có nồng độ nằm trong vùng đáp ứng của định luật Lambert – Beer

• Đo so sánh với dung dịch chuẩn

Xác định mật độ quang của dung dịch thử có nồng độ Cx (chưa biết) được tiến hành đồng thời với việc xác định mật độ quang của dung dịch chuẩn có nồng độ Cc

đã biết chính xác, trong điều kiện thỏa mãn định luật Lambert – Beer thì Cx được tính theo công thức:

Trong kĩ thuật so sánh, kết quả càng chính xác khi nồng độ Cx càng gần với

nồng độ dung dịch chuẩn Cc

• Kỹ thuật đường chuẩn

Là so sánh dung dịch thử với nhiều dung dịch chuẩn bằng cách chuẩn bị 5-8 dung dịch chuẩn có nồng độ khác nhau Đo mật độ quang của từng dung dịch chuẩn

1%

1cm

x xE

A

C =

c c

x x c

x c

x

C.A

ACC

CA

Trang 23

và vẽ đồ thị biểu diễn mối quan hệ giữa mật độ quang và nồng độ của các dung dịch chuẩn Trong trường hợp các dung dịch đo thỏa mãn điều kiện định luật Lambert-Beer thì đường chuẩn thẳng, sau đó từ mật độ quang của dung dịch thử, dựa vào phương trình đường chuẩn để tính ra nồng độ của dung dịch thử

• Kỹ thuật thêm chuẩn

Để hạn chế ảnh hưởng của tạp chất người ta đưa thêm vào dung dịch thử một lượng chính xác chuẩn làm cho nồng độ dung dịch tăng thêm một lượng Co Đo mật

độ quang của dung dịch thử (A) và dung dịch thử thêm chuẩn (A’), nồng độ của dung dịch thử được tính theo công thức

=  Cx = * Co

• Kỹ thuật thêm đường chuẩn

Được tiến hành bằng cách thêm chính xác các lượng chất chuẩn khác nhau vào dung dịch cần định lượng Vẽ đường chuẩn thể hiện mối quan hệ của mật độ quang

và nồng độ dung dịch thử thêm chuẩn Giao điểm của đường chuẩn với trục nồng độ

là giá trị nồng độ dung dịch cần định lượng

Cx

xAA

Trang 24

1.5 TỔNG QUAN VỀ NHỰA HẤP PHỤ

1.5.1 Định nghĩa và phân loại

Nhựa hấp phụ là hạt polymer hình cầu, màu trắng, có cấu trúc xốp với các lỗ

lớn trên bề mặt; hấp phụ nhờ lực liên kết tự do Vander Waals hoặc liên kết hydro,

có cấu trúc mạng và diện tích bề mặt tiếp xúc lớn, được ứng dụng chủ yếu để tách các nhóm chất khác nhau [37]

Nhựa hấp phụ có thể được chia thành hai loại chính: không phân cực và phân

cực Theo độ phân cực được chia thành phân cực yếu, phân cực trung bình và phân cực mạnh Được sử dụng nhiều hiện nay gồm các loại nhựa: D101, DA201, D, chuỗi SIP, X5, AB8, GDX104, LD605, LD601, CAD40, DM130, RA, CHA111, WLD (loại hỗn hợp), H107, NKA9,… [20]

1.5.2 Ứng dụng trong tách và tinh chế Saponin

Tại Mỹ, nhựa hấp phụ chủ yếu được sử dụng trong công nghiệp hóa chất, luyện kim, thực phẩm với tác dụng làm sạch và khử trùng nước uống [21], loại bỏ chất thải công nghiệp chứa các ion Cr (VI) độc hại [31] Tại Trung Quốc, nhựa chủ yếu được sử dụng trong công nghệ thực phẩm và Y học cổ truyền [20]

Wang Hong và cộng sự đã sử dụng nhựa D101, ngoài ra có thể sử dụng DA20111, D3520, AB8, AASI2, D3520, D4020 để nghiên cứu và tối ưu hóa việc

tách và tinh chế saponin toàn phần từ Sơn thù du (Cornus officinalis) Kết quả thu

được hàm lượng saponin toàn phần là 2.49%, cao hơn so với phương pháp tách chiết bằng dung môi hữa cơ là 2,19% Ngoài ra có thể sử dụng các loại nhựa khác như DA20111, D3520, AB8, AASI2, D3520, D4020 Nghiên cứu đã chứng minh

nhựa hấp phụ còn cho hiệu quả tốt trong việc loại bỏ đường hòa tan trong nước và các tạp chất khác Phương pháp tách chiết dung môi thông thường có chi phí cao, quá trình phức tạp, đặc biệt là việc sử dụng chiết xuất bằng dung môi hữu cơ là khó khăn hơn trong sản xuất thực tế Quy trình mới sử dụng nước – ethanol và nhựa hấp phụ không chỉ đơn giản, tiết kiệm mà sản lượng sản phẩm và chất lượng còn được cải thiện đáng kể [33] Zhang Chongxi sử dụng nhựa D101 cho tỉ lệ thu Ginsenosides lên đến 90% với độ tinh khiết cao nhất, đưa tổng hàm lượng saponin

Trang 25

trong nhâm sâm khô đạt 60% [36] Liu Chen và cộng sự nghiên cứu sử dụng trên

Ngũ gia bì (Acanthopanax) với 3 loại nhựa D101, NKA9, AB8, sử dụng phương

pháp HPLC để định lượng glycoside D Kết quả D101, NKA9, AB8 có khả năng hấp phụ bão hòa tương ứng là 11.88 mg/g; 7.92 mg/g và 12.18 mg/g [26] Li-Sheng Wang và cộng sự dùng phương pháp TLC để kiểm tra khả năng hấp phụ của nhựa D101 đối với saponin trong Huyền sâm (Scrophularia ningpoensis) Kết quả nhựa

D101 có thể hấp phụ 8,7% đến 27,3% saponin, tăng 20% - 52,1% so với phương pháp thông thường [25]

Trang 26

CHƯƠNG 2 NGUYÊN VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ

PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 NGUYÊN VẬT LIỆU, THIẾT BỊ, HÓA CHẤT

2.1.1 Nguyên liệu

Nguyên liệu là phần trên mặt đất của 10 mẫu thuộc loài G pentaphyllum thu

hái tại các vùng trồng ở 3 địa phương khác nhau, mỗi mẫu 500g khô:

- Mẫu thu hái tại Tam Đảo: TĐ1, TĐ2, TĐ3

- Mẫu thu hái tại Hòa Bình: HB1, HB2, HB3

- Mẫu thu hái tại Đà Lạt: ĐL1, ĐL2, ĐL3, ĐL4

Dược liệu sau khi thu hái được phơi ở nơi thoáng mát, sấy ở nhiệt độ 600

C (tủ

sấy Shellab) và bảo quản trong túi nilon kín ở nơi khô ráo, thoáng mát

2.2.2 Dụng cụ thiết bị

- Tủ sấy SHELLAB

- Cân phân tích Precisa XT220A

- Máy đo hàm ẩm Precisa XM 60

- Máy chiết siêu âm Qsonica - Mỹ

- Bộ sinh hàn hồi lưu và bộ chiết soxhlet

- Bể điều nhiệt Sartoriu

- Sắc ký lớp mỏng sử dụng bản mỏng tráng sẵn Silicagel GF254 của MERCK (Đức)

- Tủ sấy BINDER – Đức

- Máy cất chân không BÜCHi ROTAVAPOR R-200

- Pipet tự động 100µl

- Máy đo quang Shanghai METASH – Trung Quốc

- Các dụng cụ thủy tinh khác: Bình định mức, pipet, ống nghiệm, ống đong, ống ly tâm, phễu lọc, cốc có mỏ, đũa thủy tinh

Nghiên cứu sử dụng các bộ dụng cụ tại phòng thí nghiệm của Bộ môn Dược

liệu trường Đại học Dược Hà Nội

Trang 27

2.1.3 Hóa chất

- Dung môi dùng cho quá trình chiết xuất: EtOH, MeOH, ether dầu hỏa, butanol, nước cất

n Chất chuẩn tinh khiết Rb1 chiết xuất từ Panax ginseng C.A.Mey của công ty

Shanghai TautoBiotech, độ tinh khiết đạt 97%

- Hóa chất tinh khiết: EtOH, Cloroform, Acid acetic băng, vanillin, acid perchloric

- Nhựa hấp phụ D101 của Anhui sanxing resin Technology Co Ltd

2.2 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU

- Xây dựng quy trình tối ưu chiết xuất saponin toàn phần từ dược liệu

- Xây dựng quy trình tinh chế saponin

- Xây dựng các điều kiện định lượng Saponin trong Giảo cổ lam bằng kỹ thuật UV-VIS nhằm xác định điều kiện tối ưu: Thời gian, nhiệt độ, nồng độ thuốc thử

- Thẩm định lại phương pháp vừa xây dựng: khoảng tuyến tính, độ lặp lại, độ đúng

- Định lượng saponin toàn phần từ Giảo cổ lam bằng phương pháp cân và phương pháp đo quang Sử dụng các phép toán thống kê để xử lí và so sánh kết quả của hai phương pháp trên

- Từ phương pháp đã xây dựng được, tiến hành định lượng saponin trong một

số mẫu Giảo cổ lam

2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.3.1 Chiết xuất

Xác định độ ẩm của bột dược liệu:

Dược liệu được sấy khô, cắt nhỏ và nghiền thành bột Lấy khoảng 1g bột mẫu nghiên cứu để xác định độ ẩm của dược liệu Bật máy đo độ ẩm, điều chỉnh nhiệt độ

ở 110oC, rắc bột dược liệu lên đĩa cân và trải đều lên mặt đĩa, đậy đĩa cân và đợi máy tự động hiện kết quả lên màn hình Đọc kết quả Tiến hành 3 lần, lấy kết quả trung bình

Trang 28

tạp chất để thuận tiện cho quá trình tinh chế và định lượng tiếp theo

Đối với saponin, chúng tôi tiến hành khảo sát quy trình chiết xuất với 3 phương pháp: chiết soxhlet, chiết hồi lưu, chiết siêu âm, với mỗi phương pháp sử

dụng 4 dung môi khác nhau là MeOH, EtOH 50%, 70%,90%

Phương pháp chiết bằng soxhlet

Hình 2.1 B ộ dụng cụ

chiết soxhlet

- Làm túi bằng giấy lọc: cắt một miếng giấy lọc vuông,

cuộn tròn, gập đáy, dùng gim để ghim mép giấy

- Cân chính xác khoảng 50g bột dược liệu thô cho vào trong túi đã chuẩn bị sẵn, gập miệng túi và đặt vào dụng cụ chiết

- Lắp dụng cụ, đặt lên nồi cách thuỷ Ðặt phễu lên

miệng ống sinh hàn Rót 500ml dung môi qua phễu (lần lượt là MeOH, EtOH 50%,70%,

90%)

- Chiết hồi lưu nhiều lần cho đến khi saponin được chiết kiệt (kiểm tra bằng SKLM với hệ dung môi CHCl3:MeOH:H2O = 65:35:10)

- Gộp dịch chiết lọc qua giấy lọc rồi cất thu hồi dung môi dưới áp suất giảm đến cắn Dùng cắn thu được

tiến hành các bước như hình 2.4

Trang 29

Phương pháp chiết hồi lưu

Hình 2.2 B ộ dụng cụ

chiết hồi lưu

- Cân chính xác khoảng 50g bột dược liệu thô cho vào bình cầu sạch dung tích 500ml, thấm ẩm bột dược liệu

bằng lượng dung môi vừa đủ rồi thêm dung môi đến

ngập hết dược liệu (tổng 250ml dung môi), lần lượt là MeOH, EtOH 50%,70%, 90%

- Lắp dụng cụ, đặt lên nồi cách thủy Đun sôi trong 30 phút Lấy dịch chiết và lọc Tiếp tục thêm dung môi đến ngập dược liệu và chiết đến khi dịch chiết trong

suốt (3 lần) Gộp dịch chiết thu được đem lọc rồi cất thu hồi dung môi dưới áp suất giảm đến cắn Dùng

cắn thu được tiến hành các bước như hình 2.4

Phương pháp chiết siêu âm

Hình 2.3

Máy chiết siêu âm

- Cân chính xác khoảng 50g bột dược liệu thô cho vào

cốc cỏ mỏ sạch dung tích 500ml, thấm ẩm bột dược

liệu bằng lượng dung môi vừa đủ rồi thêm dung môi đến ngập hết dược liệu (tổng 250ml dung môi) với dung môi lần lượt là MeOH, EtOH 50%,70%,

90%

- Tiến hành chiết bằng máy siêu âm trong thời gian 10 phút, công suất 40% Thu lấy dịch chiết Tiếp tục thêm dung môi đến ngập dược liệu và chiết đến khi dịch chiết trong suốt (3 lần) Gộp dịch chiết thu được đem lọc rồi cất thu hồi dung môi dưới áp suất giảm đến cắn Dùng cắn thu được tiến hành các bước như hình 2.4

Trang 30

Trong đó S: hàm lượng saponin (%)

a: khối lượng saponin toàn phần (g) M: khối lượng dược liệu (g)

x: Hàm ẩm dược liệu

Hình 2.4 Sơ đồ định lượng saponin toàn phần theo phương pháp cân bằng

các ph ương pháp chiết và dung môi khác nhau

Công thức: Hàm lượng saponin toàn phần

Cân cắn và tính hàm lượng các cắn theo công thức:

S =

) 1

Trang 31

2.3.2 Tinh chế

Căn cứ vào tài liệu tham khảo và quy trình thực nghiệm, chúng tôi xây dựng quy trình tinh chế mẫu bằng phương pháp chiết lỏng-rắn như sau:

Chuẩn bị

- Nhựa sử dụng: D101, được làm sạch bằng nước cất

- Cân khoảng 5g dược liệu, chiết bằng phương pháp đã lựa chọn, lấy dịch chiết bốc hơi dung môi đến cắn rồi hòa tan bằng 5ml nước thu được dung dịch (1)

- Chuẩn bị cột: Cột thủy tinh có khóa và nút mài, đường kính 2,5cm; chiều dài 25cm; rửa sạch, sấy khô, cố định trên giá theo chiều thẳng đứng, lót một lớp bông thủy tinh ở đáy cột

- Chất nhồi cột: 20g nhựa hấp phụ (đã làm sạch) ngâm trong dung dịch (1) trong 60 phút, vừa ngâm vừa lắc nhẹ để quá trình hấp phụ xảy ra hoàn toàn

Khảo sát dung môi rửa giải

Để lựa chọn dung môi rửa giải thích hợp, chúng tôi tiến hành khảo sát dung môi rửa giải từ nước cất, EtOH 10% đến EtOH 90%, MeOH

- Nhồi cột: Đưa nhựa hấp phụ ngâm trong dung dịch (1) vào cột từ từ, vừa rót

vừa gõ nhẹ để đuổi hết bọt khí

- Rửa giải:

Ban đầu rửa giải bằng nước đến hết màu

Lần lượt rửa giải với các dung môi EtOH 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% và MeOH Chuyển dung môi mới khi đã rửa kiệt saponin bằng dung môi cũ (kiểm tra bằng phản ứng tạo bọt và SKLM với hệ CHCl3:MeOH:H2O

= 65:35:10) Từng dịch rửa được hứng vào các cốc có mỏ sạch và làm khô đến cắn Định tính saponin trong các cắn thu được bằng phản ứng tạo bọt  Căn cứ vào kết quả thu được lựa chọn dung môi rửa giải thích hợp để thu được saponin toàn phần

2.3.3 Định lượng bằng phương pháp đo quang

Căn cứ vào các tài liệu tham khảo [18], [23], [38] và quy trình thực nghiệm, chúng tôi tiến hành xây dựng phương pháp định lượng như sau:

Ngày đăng: 28/07/2015, 17:55

Nguồn tham khảo

Tài liệu tham khảo Loại Chi tiết
1. Trần Tử An, Thái Nguyễn Hùng Thu (2006), Hoá phân tích II, Trường Đại học Dược Hà Nội, 46-47 Sách, tạp chí
Tiêu đề: Hoá phân tích II
Tác giả: Trần Tử An, Thái Nguyễn Hùng Thu
Năm: 2006
2. Ph ạm Tuấn Anh (2008), Nghiên cứu thành phần hóa học và một số tác dụng sinh học của cây Giảo cổ lam thu hái tại Sapa, Luận văn Thạc sỹ Dược học- Trường Đại học Dược Hà Nội Sách, tạp chí
Tiêu đề: Nghiên cứu thành phần hóa học và một số tác dụng sinh học của cây Giảo cổ lam thu hái tại Sapa
Tác giả: Ph ạm Tuấn Anh
Năm: 2008
4. Vũ Đức Cảnh (1999), Nghiên cứu thành phần hóa học và một số tác dụng sinh học của cây Gynostemma pentaphyllum (Thunb.) Makino, Cucurbitaceae, khóa luận tốt nghiệp Dược sỹ Đại học - Trường Đại học Dược Hà Nội Sách, tạp chí
Tiêu đề: Nghiên cứu thành phần hóa học và một số tác dụng sinh học của cây Gynostemma pentaphyllum (Thunb.) Makino, Cucurbitaceae
Tác giả: Vũ Đức Cảnh
Năm: 1999
7. Nguyễn Tiến Dẫn, Nghiên cứu thành phần hóa học và tác dụng sinh học của cây Th ất diệp đởm , Lu ận văn Thạc sỹ Dược học- Trường Đại học Dược Hà Nội Sách, tạp chí
Tiêu đề: Nghiên cứu thành phần hóa học và tác dụng sinh học của cây Thất diệp đởm
8. Nguy ễn Thị Thanh Duyên (2000), Tiếp tục nghiên cứu thành phần hóa học và tác dụng sinh học của cây Thất diệp đởm, Khóa luận tốt nghiệp Dược sỹ Đại h ọc - Trường Đại học Dược Hà Nội Sách, tạp chí
Tiêu đề: Tiếp tục nghiên cứu thành phần hóa học và tác dụng sinh học của cây Thất diệp đởm
Tác giả: Nguy ễn Thị Thanh Duyên
Năm: 2000
9. Nguy ễn Văn Đàn, Nguyễn Viết Tựu (1985), Phương pháp nghiên cứu hóa học cây thuốc, NXB Y học Sách, tạp chí
Tiêu đề: Phương pháp nghiên cứu hóa học cây thuốc
Tác giả: Nguy ễn Văn Đàn, Nguyễn Viết Tựu
Nhà XB: NXB Y học
Năm: 1985
11. Phạm Thanh Hương (2003), Nghiên cứu thành phần hóa học và tác dụng sinh h ọc của cây Giảo cổ lam , Khóa lu ận tốt nghiệp Dược sỹ Đại học - Trường Đại h ọc Dược Hà Nội Sách, tạp chí
Tiêu đề: Nghiên cứu thành phần hóa học và tác dụng sinh học của cây Giảo cổ lam
Tác giả: Phạm Thanh Hương
Năm: 2003
12. Phạm Thanh Kỳ, Phan Thị Phi Phi, Phan Thị Thu Anh (2007), “Nghiên cứu tác d ụng tăng đáp ứng miễn dịch của cây Giảo cổ lam ( Gynostemma pentaphyllum (Thunb.) Makino”, Tạp chí thông tin Y Dược (5) Sách, tạp chí
Tiêu đề: Nghiên cứu tác dụng tăng đáp ứng miễn dịch của cây Giảo cổ lam ("Gynostemma pentaphyllum" (Thunb.) Makino”, "Tạp chí thông tin Y Dược
Tác giả: Phạm Thanh Kỳ, Phan Thị Phi Phi, Phan Thị Thu Anh
Năm: 2007
13. Trần Văn Ơn (2004), Thực vật dược và phân loại thực vật, NXB Y học - trường Đại học Dược Hà Nội Sách, tạp chí
Tiêu đề: Thực vật dược và phân loại thực vật
Tác giả: Trần Văn Ơn
Nhà XB: NXB Y học - trường Đại học Dược Hà Nội
Năm: 2004
14. Phan Th ị Thảo (2010), Nghiên c ứu đặc điểm vi học và thành phần hóa học của cây Giảo cổ lam thu hái tại Hòa Bình, Khóa lu ận tốt nghiệp Dược sỹ Đại học - Trường Đại học Dược Hà Nội Sách, tạp chí
Tiêu đề: Nghiên cứu đặc điểm vi học và thành phần hóa học của cây Giảo cổ lam thu hái tại Hòa Bình
Tác giả: Phan Th ị Thảo
Năm: 2010
16. Vi ện kiểm nghiệm an toàn vệ sinh thực phẩm quốc gia (2010), Thẩm định phương pháp phân tích hóa học và sinh học, NXB Khoa học và Kỹ Thuật.Tài li ệu tiếng Anh Sách, tạp chí
Tiêu đề: Thẩm định phương pháp phân tích hóa học và sinh học
Tác giả: Vi ện kiểm nghiệm an toàn vệ sinh thực phẩm quốc gia
Nhà XB: NXB Khoa học và Kỹ Thuật. Tài liệu tiếng Anh
Năm: 2010
18. Chen Junhui, Ming-Yong Xie, Zhang Zhiming (2005), “12 kinds of American ginseng in total ginsenoside and ginsenoside Rb1 determination”, Materia medica, 16 (9), 845 – 847 Sách, tạp chí
Tiêu đề: 12 kinds of American ginseng in total ginsenoside and ginsenoside Rb1 determination”, "Materia medica
Tác giả: Chen Junhui, Ming-Yong Xie, Zhang Zhiming
Năm: 2005
19. China Pharmaceutical University (1996), “Encyclopedia of Chinese Herbs”, China Medicine, Science and Technology publisher, 2 (1), 1878-1882 Sách, tạp chí
Tiêu đề: Encyclopedia of Chinese Herbs”, "China Medicine, Science and Technology publisher
Tác giả: China Pharmaceutical University
Năm: 1996
20. Ding, Zhou Hui (2000), “Macroporous resin in the application of traditional Chinese medicines in the research”, Medicaltheory and practice,13 (12), 730 Sách, tạp chí
Tiêu đề: Macroporous resin in the application of traditional Chinese medicines in the research”, "Medicaltheory and practice
Tác giả: Ding, Zhou Hui
Năm: 2000
21. Dong Huaihai, Valley Wenying (2001), “Determination of soybean saponins”, China Oils and Fats, 2 (3), 57 - 59 Sách, tạp chí
Tiêu đề: Determination of soybean saponins”, "China Oils and Fats
Tác giả: Dong Huaihai, Valley Wenying
Năm: 2001
22. Hoang Van Lam, Tran Van On (2009), “Biodiversity of the genus Gynostemma in the north of Viet Nam”, Pharma Indochina VI, 83 - 88 Sách, tạp chí
Tiêu đề: Biodiversity of the genus "Gynostemma" in the north of Viet Nam”, "Pharma Indochina
Tác giả: Hoang Van Lam, Tran Van On
Năm: 2009
23. Ing–Luen S, Tzenge–Lien S, Ya–Nang W, Hsin–Tai C, Haw–Farn L, Han Chien L, et al (2009), “Quantification for saponin from a soapberry (Sapindus mukorossi Gaertn) in cleaning products by a chromatographic and two colorimetric assays”, J Fac Agr, Kyushu Univ, 54 (215), 21 Sách, tạp chí
Tiêu đề: Quantification for saponin from a soapberry ("Sapindus mukorossi" Gaertn) in cleaning products by a chromatographic and two colorimetric assays”, "J Fac Agr, Kyushu Univ
Tác giả: Ing–Luen S, Tzenge–Lien S, Ya–Nang W, Hsin–Tai C, Haw–Farn L, Han Chien L, et al
Năm: 2009
24. Kuwahara M, Kawanishi F, Komiya T & Oshio H (1989), “Dammarane saponins of Gynostemma pentaphyllum Makino anh isolation of malonylginsenosides -Rb1, -Rd, and malonyl gypenoside V.”, Chem Pharmaceut. Bull, 37 (1), 135-139 Sách, tạp chí
Tiêu đề: Dammarane saponins of "Gynostemma pentaphyllum" Makino anh isolation of malonylginsenosides -Rb1, -Rd, and malonyl gypenoside V.”, "Chem Pharmaceut. Bull
Tác giả: Kuwahara M, Kawanishi F, Komiya T & Oshio H
Năm: 1989
25. Li-Sheng Wang, Zou Jie-ming, GUO Ya-jian (2004), “D101 macroporous resin purification of total saponins of bitter figwort”, Chinese herbal medicine, 35 (5), 515 Sách, tạp chí
Tiêu đề: D101 macroporous resin purification of total saponins of bitter figwort”, "Chinese herbal medicine
Tác giả: Li-Sheng Wang, Zou Jie-ming, GUO Ya-jian
Năm: 2004
26. LIU Chen, Zhang Junshou (2004), “Macroporous resin separation and purification of D Acanthopanax glycosides”, Chinese medicine, 26 (9), 701 Sách, tạp chí
Tiêu đề: Macroporous resin separation and purification of D Acanthopanax glycosides”, "Chinese medicine
Tác giả: LIU Chen, Zhang Junshou
Năm: 2004

TỪ KHÓA LIÊN QUAN

TRÍCH ĐOẠN

TÀI LIỆU CÙNG NGƯỜI DÙNG

TÀI LIỆU LIÊN QUAN

w