LỜI CẢM ƠNKhóa luận “Xây dựng phương pháp định lượng saponin toàn phần trong Giảo cổ lam bằng phương pháp đo quang” được tôi hoàn thành tại bộ môn Dược liệu, trường Đại học Dược Hà Nội với sự làm việc nghiêm túc, nỗ lực hết mình của bản thân và sự khích lệ từ phía nhà trường, thầy cô, gia đình và bè bạn.Trước hết tôi xin được bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới ThS. Phạm Tuấn Anhngười thầy đã dành nhiều thời gian và tâm huyết hướng dẫn nghiên cứu, giúp tôi hoàn thành khóa luận tốt nghiệp.Tôi xin chân thành cảm ơn ThS. Lê Thanh Bình đã giúp đỡ, chỉ bảo, động viên trong quá trình tôi thực hiện khóa luận tai bộ mônTôi xin chân thành cảm ơn Ban giám hiệu, các thầy cô giáo Trường Đại học Dược Hà Nội cũng như các thầy cô giáo, các anh chị kĩ thuật viên bộ môn Dược liệu đã tạo điều kiện tốt nhất cho tôi trong quá trình học tập và nghiên cứu.Cuối cùng tôi xin tỏ lòng biết ơn gia đình, bạn bè đã động viên tôi về mọi mặt và giúp đỡ tôi tận tình trong quá trình học tập, nghiên cứu, là động lực không nhỏđể tôi có kết quả ngày hôm nay.Chân thành cảm ơnHà Nội, tháng 05 năm 2013Sinh viênTrịnh Thị Diệp Thanh
Trang 1B Ộ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI
ĐỊNH LƯỢNG SAPONIN TOÀN PHẦN
PHƯƠNG PHÁP ĐO QUANG
HÀ N ỘI – 2013
Trang 2B Ộ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI
ĐỊNH LƯỢNG SAPONIN TOÀN PHẦN
PHƯƠNG PHÁP ĐO QUANG
Trang 3LỜI CẢM ƠN
Khóa luận “Xây dựng phương pháp định lượng saponin toàn phần trong Giảo
cổ lam bằng phương pháp đo quang” được tôi hoàn thành tại bộ môn Dược liệu,
trường Đại học Dược Hà Nội với sự làm việc nghiêm túc, nỗ lực hết mình của bản thân và sự khích lệ từ phía nhà trường, thầy cô, gia đình và bè bạn
Trước hết tôi xin được bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới ThS Phạm Tuấn Anh
người thầy đã dành nhiều thời gian và tâm huyết hướng dẫn nghiên cứu, giúp tôi hoàn thành khóa luận tốt nghiệp
Tôi xin chân thành cảm ơn ThS Lê Thanh Bình đã giúp đỡ, chỉ bảo, động viên trong quá trình tôi thực hiện khóa luận tai bộ môn
Tôi xin chân thành cảm ơn Ban giám hiệu, các thầy cô giáo Trường Đại học Dược Hà Nội cũng như các thầy cô giáo, các anh chị kĩ thuật viên bộ môn Dược
liệu đã tạo điều kiện tốt nhất cho tôi trong quá trình học tập và nghiên cứu
Cuối cùng tôi xin tỏ lòng biết ơn gia đình, bạn bè đã động viên tôi về mọi mặt
và giúp đỡ tôi tận tình trong quá trình học tập, nghiên cứu, là động lực không nhỏ
để tôi có kết quả ngày hôm nay
Chân thành cảm ơn!
Hà N ội, tháng 05 năm 2013
Sinh viên
Trịnh Thị Diệp Thanh
Trang 4MỤC LỤC
ĐẶT VẤN ĐỀ 1
CHƯƠNG I TỔNG QUAN 2
1.1 TỔNG QUAN VỀ SAPONIN VÀ SAPONIN NHÂN DAMMARAN 2
1.1.1 Saponin 2
1.1.2 Saponin nhân Dammaran 2
1.2 TỔNG QUAN VỀ CHI GYNOSTEMMA BLUME VÀ LOÀI GYNOSTEMMA PENTAPHYLLUM 6
1.2.1 Chi Gynostemma Blume 6
1.2.2 TỔNG QUAN VỀ LOÀI GYNOSTEMMA PENTAPHYLLUM 7
1.3 MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP CHIẾT XUẤT, TINH CHẾ VÀ ĐỊNH LƯỢNG SAPONIN 9
1.3.1 Chiết xuất 9
1.3.2 Tinh chế 9
1.3.3 Định lượng 10
1.4 TỔNG QUAN VỀ QUANG PHỔ TỬ NGOẠI-KHẢ KIẾN (UV – VIS) 11
1.4.1 Phổ hấp thụ UV-VIS 11
1.4.2 Định luật Lambert – Beer 11
1.4.3 Ứng dụng quang phổ UV-VIS trong phân tích định lượng dung dịch một thành phần 13
1.5 TỔNG QUAN VỀ NHỰA HẤP PHỤ 15
1.5.1 Định nghĩa và phân loại 15
1.5.2 Ứng dụng trong tách và tinh chế Saponin 15
CHƯƠNG 2 NGUYÊN VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 17
2.1 NGUYÊN VẬT LIỆU, THIẾT BỊ, HÓA CHẤT 17
2.1.1 Nguyên liệu 17
2.2.2 Dụng cụ thiết bị 17
Trang 52.1.3 Hóa chất 18
2.2 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 18
2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18
2.3.1 Chiết xuất 18
2.3.2 Tinh chế 22
2.3.3 Định lượng bằng phương pháp đo quang 22
2.3.4 Thẩm định và đánh giá phương pháp 24
2.3.5 Phương pháp xử lý số liệu 25
2.3.6 Ứng dụng phương pháp xây dựng được để định lượng saponin toàn phần trong một số mẫu Giảo cổ lam 27
CHƯƠNG 3 THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ 28
3.1 KHẢO SÁT PHƯƠNG PHÁP CHIẾT XUẤT VÀ TINH CHẾ MẪU 28
3.1.1 Khảo sát phương pháp chiết xuất 28
3.1.2 Khảo sát phương pháp tinh chế 29
3.1.3 Quy trình xử lí mẫu 30
3.3 KHẢO SÁT CỰC ĐẠI HẤP THỤ QUANG VÀ ĐIỀU KIỆN PHẢN ỨNG 31
3.3.1 Khảo sát cực đại hấp thụ quang 31
3.3.2 Khảo sát điều kiện phản ứng 32
3.4 THẨM ĐỊNH VÀ ĐÁNH GIÁ PHƯƠNG PHÁP UV-VIS KHI ĐỊNH LƯỢNG SAPONIN TOÀN PHẦN TRONG GIẢO CỔ LAM 36
3.4.1 Thẩm định phương pháp 36
3.4.2 Đánh giá phương pháp 41
3.5 ỨNG DỤNG PHƯƠNG PHÁP VỪA XÂY DỰNG VÀO ĐỊNH LƯỢNG MỘT SỐ MẪU GIẢO CỔ LAM 42
3.5.1 Quy trình định lượng 42
3.5.2 Xây dựng công thức tính hàm lượng saponin toàn phần trong GCL 44
3.5.3 Kết quả 44
3.6 BÀN LUẬN 45
3.6.1 Về phương pháp chiết xuất và tinh chế mẫu 45
Trang 63.6.2.Về khảo sát điều kiện đo quang 45
3.6.3.Về thẩm định phương pháp định lượng 45
3.6.5.Về kết quả định lượng saponin trong các mẫu Giảo cổ lam 47
CHƯƠNG 4 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 48
4.1 KẾT LUẬN 48
4.2 ĐỀ XUẤT 49
Trang 7DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT
C chuẩn , C thử : Nồng độ của chất chuẩn, chất thử
ELSD : Detector tán xạ bay hơi
(Evaporative light scattering detector)
ESI : Ion hóa bằng phun điện tử (Electronspray ionization)
Trang 8DANH MỤC BẢNG BIỂU
1 B ảng 1.1 Các nhóm thế và một số saponin tương ứng trong G
2 B ảng 3.1 Hàm lượng saponin toàn phần thu được từ GCL bằng
các phương pháp và dung môi chiết khác nhau 28
3 B ảng 3.2 Kết quả khảo sát dung môi rửa giải 29
4 Bảng 3.3 Ảnh hưởng của nhiệt độ tới phản ứng 33
5 Bảng 3.4 Ảnh hưởng của thời gian phản ứng 33
6 Bảng 3.5 Ảnh hưởng của nồng độ thuốc thử vanillin 34
7 Bảng 3.6 Ảnh hưởng của nồng độ acid perchloric 35
8 Bảng 3.7 Kết quả xây dựng đường chuẩn 37
9 Bảng 3.8 Kết quả khảo sát độ lặp lại của phương pháp 38
10 Bảng 3.9 Kết quả khảo sát độ đúng của phương pháp 40
11 Bảng 3.10 Kết quả định lượng saponin toàn phần trong GCL bằng
phương pháp cân và phương pháp UV-VIS 41
12 B ảng 3.11 Kết quả định lượng saponin toàn phần trong các mẫu
Trang 94 Hình 1.4 Công thức cấu tạo của Ginsenoside Rb1 5
5 Hình 1.5 Ảnh của cây Giảo cổ lam 7
6 Hình 1.6 Kĩ thuật thêm đường chuẩn 14
7 Hình 2.1 B ộ dụng cụ chiết soxhlet 19
8 Hình 2.2 Bộ dụng cụ chiết hồi lưu 20
9 Hình 2.3 Máy chiết siêu âm 20
10 Hình 2.4 Sơ đồ định lượng saponin toàn phần theo phương pháp
cân bằng các phương pháp chiết và dung môi khác nhau 21
11 Hình 3.1 Quy trình tinh ch ế saponin bằng chiết lỏng-rắn và chiết
12 Hình 3.2 Phổ hấp thụ của sản phẩm phản ứng 32
13 Hình 3.3 Đồ thị ảnh hưởng của nhiệt độ phản ứng 33
14 Hình 3.4 Đồ thị ảnh hưởng của thời gian phản ứng 34
15 Hình 3.5 Đồ thị ảnh hưởng của nồng độ thuốc thử Vanilin 35
16 Hình 3.6 Đồ thị ảnh hưởng của nồng độ thuốc thử acid perchloric 36
17 Hình 3.7 Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc mật độ quang vào nồng độ
chất chuẩn tại bước sóng 550nm 37
18 Hình 3.8 Đồ thị xác định hàm lượng saponin toàn phần trong
mẫu GCL theo kỹ thuật thêm đường chuẩn 39
Trang 10ĐẶT VẤN ĐỀ
Ngày nay trên thế giới, xu hướng trở về với thiên nhiên, tìm kiếm nguồn thuốc mới và sử dụng thuốc từ thảo dược ngày càng tăng Giảo cổ lam là một vị thuốc quý được người dân ở nhiều nước châu Á sử dụng từ lâu đời nhằm tăng cường sức khỏe
và tuổi thọ Nhiều báo cáo khoa học chứng minh một số tác dụng sinh học của Giảo
cổ lam như: hạ đường huyết, giảm cholesterol, giảm triacylglycerol máu …, trong
đó saponin được cho là thành phần tạo nên các tác dụng sinh học này
Trên thị trường Việt nam hiện nay xuất hiện rất nhiều chế phẩm Giảo cổ lam dưới dạng trà và được người dân sử dụng rộng rãi Vì vậy việc quản lí chất lượng dược liệu là một vấn đề cần được chú trọng để đảm bảo chất lượng của các sản phẩm cũng như việc sử dụng thuốc trong dân gian có hiệu quả Tuy nhiên Dược điển Việt Nam chưa có chuyên luận về dược liệu Giảo cổ lam nên quá trình đánh giá còn gặp nhiều khó khăn
Với mục đích xác định hàm lượng saponin trong Giảo cổ lam, đồng thời xây
dựng phương pháp định lượng saponin trong các chế phẩm Giảo cổ lam đang được
sử dụng tại Việt Nam, giúp kiểm nghiệm viên có thêm nhiều lựa chọn khi tìm phương pháp kiểm nghiệm phù hợp với điều kiện thực tế nơi làm việc, chúng tôi đã
tiến hành đề tài: “Xây dựng phương pháp định lượng saponin trong Giảo cổ lam
bằng phương pháp đo quang” với các mục tiêu cụ thể như sau:
1 Xây dựng quy trình chiết xuất và tinh chế saponin toàn phần từ dược liệu
Trang 11• Phân loại, cấu trúc hóa học
- Về mặt phân loại, dựa theo cấu trúc hoá học có thể chia thành saponin triterpenoid và saponin steroid
- Saponin triterpenoid có loại trung tính và loại acid, saponin steroid có loại trung tính và loại kiềm
- Saponin triterpenoid có phần genin gồm 30 carbon cấu tạo bởi 6 nhóm hemiterpene, chia làm 2 loại: Saponin triterpenoid pentacyclic và saponin triterpenoid tetracyclic
+ Saponin triterpenoid pentacyclic: gồm 4 nhóm là olean, ursan, lupan hopan +Saponin triterpenoid tetracyclic: gồm 3 nhóm là dammaran, lanostan và cucurbitan
- Saponin steroid được chia thành 5 nhóm: nhóm spirostan, nhóm furostan, nhóm aminofurostan, nhóm spirosolan và nhóm solanidan
1.1.2 Saponin nhân Dammaran
Theo các nghiên cứu [24], [27], [32] saponin là một trong những nhóm chất chính của các loài trong chi Gynostemma, trong đó chủ yếu là các saponin thuộc nhóm Dammaran Do đó, chúng tôi tổng quan sâu hơn về nhóm cấu trúc này
Dammaran là nhóm saponin triterpenic có cấu trúc 4 vòng (triterpenoid tetracyclic) Trong công thức phân tử có 30 carbon và do 6 nhóm hemiterpen ghép
lại theo qui tắc đầu đuôi Các saponin thuộc nhóm này xuất hiện nhiều trong các cây thuộc chi Panax, họ Araliaceae Đặc biệt saponin trong nhân sâm (Panax ginseng)
có nhiều tác dụng quí đã được nhiều nhà khoa học trên thế giới nghiên cứu
Trang 121 2
3 4
5
6 7
8 9 10
11
12 13
14 15 16
17 18
Hình 1.1 Cấu trúc của các Dammaran thuộc nhóm Saponin triterpen tetracyclic
• Tác dụng sinh học của các saponin nhân Dammaran
Có rất nhiều các nghiên cứu về tác dụng của triterpenoid dammaran trong nhân sâm và các loài thuộc chi Gynostemma, trong đó nổi bật là các tác dụng
- Chống mệt mỏi và tăng sức đề kháng: các saponin triterpenoid tetracyclic nhóm dammaran của nhâm sâm có tác dụng cải thiện rõ rệt tinh thần cũng như thể
chất, tác dụng kéo dài thời gian sống trên động vật thí nghiệm bị nhiễm bệnh cũng
đã được chứng minh
- Tác dụng hạ cholesterol đã được chứng minh trên động vật thí nghiệm
- Tác dụng hạ đường huyết do các saponin này có khả năng chuyển glucose thành glycogen và ngăn ngừa hiện tượng giảm glycogen
• Các saponin trong chi Gynostemma
Các nghiên cứu đầu tiên đã phát hiện saponin có mặt trong giảo cổ lam thuộc
nhóm dammaran Đã có trên 100 saponin trong thành phần G pentaphyllum được
phân lập và nhận dạng cấu trúc, trong đó có 8 saponin giống như loại protopanaxadiol trong ginsenosid của Panax ginseng là Rb1 (Gypenosid III) [24],
[32], Rc [27], Rb3 (Gypenosid IV), Rd (Gypenosid VIII), F2 [27], Rg3 [29], malonyl-Rb1 và malonyl-Rd [24] Ngoài ra cũng phát hiện Rf là 1 protopanaxatriol [27] Những ginsenosid đó chiếm khoảng 25% tổng gypenosid toàn phần trong cây
và là minh chứng đầu tiên của nhóm saponin nhân sâm được tìm thấy ngoài họ Araliaceae Một số Gypenosid XXVIII, XXXVII, LV, LXII, LXIII cũng tìm thấy
trong loài Gymnema sylvestra [35] Các saponin còn lại chiếm phần lớn các
Trang 13gypenosid được phát hiện lần đầu ở loài G pentaphyllum Cấu trúc một số saponin trong G pentaphyllum được trình bày ở hình 1.2, hình 1.3 và bảng 1.1
R3
- CH3 hoặc - CH2OH
- CHO
Gypenosid I, Rb1 Gylongiposid I
R5
- OH
- đường đôi
Rg3, Rf Rb1, gymnemasid II
R6
- CH3 hoặc - CH2OH
- CH2O -glu hoặc CH2O –xyl Rb1
R7 Có thể là a, b, c, d, e, f, g, h hoặc i Các ginsenoid đều có cấu trúc a
Trang 14Loại đường chính trong saponin của GCL (hầu hết thuộc dạng pyranose) là D-glucose, β-D-xylose, α-L-rhamnose, α-L-arabinose nối ở vị trí C-3(β) và C-20 Các nhóm chức tiêu biểu là -OH, -CH3, -CHO, các alcol và ít phổ biến hơn cả là nhóm chức ceton ở vị trí C-19 (R3) Nhóm –OH cũng có ở vị trí C-2(α) và C-12(β) Các saponin dạng ocotillon có cầu nối epoxy tại vi trí C-17 cũng được phát
β-hiện với cấu trúc 3β, 12β, 23S, 24R-tetrahydroxy-20S, 25-epoxydammaran và (20S, 24S)-20,24-epoxy-dammaran-3β, 12β, 25-triol [26] Các saponin trong GCL đa số ở dạng bột vô định hình, chỉ có một số ít ở dạng tinh thể là gypenosid A [28] và gynosaponin TN1 [30]
- Độ tan: tan tốt trong MeOH, EtOH,
H2O
- Tác dụng dược lý: tác dụng an thần,
tốt cho đường tiêu hóa, tăng sức chịu đựng, bảo vệ gan và là chất chống oxy hóa, chống mệt mỏi, chống co giật,
giảm đau và chống loét [17]
Trang 151.2 TỔNG QUAN VỀ CHI GYNOSTEMMA BLUME VÀ LOÀI
GYNOSTEMMA PENTAPHYLLUM
1.2.1 Chi Gynostemma Blume
• Vị trí phân loại chi Gynostemma
Theo các tài liệu [10], [13], chi Gynostemma được xếp vào họ Cucurbitaceae
(họ bầu bí) Vị trí của chi Gynostemma trong hệ thống phân loại thực vật dược:
• Đặc điểm thực vật và phân bố của chi Gynostemma
Chi Gynostemma được mô tả đầu tiên bởi Blume vào năm 1825 dựa trên đặc
điểm hình thái của loài G simplicifolium [34] Từ đó đến nay, đã có thêm nhiều loài được mô tả Các loài thuộc chi Gynostemma có các đặc điểm chung [10], [34]:
Cây thảo, mảnh, thân leo, sống lâu năm Lá kép, ít khi là lá đơn, lá khía răng cưa Tua cuốn chẻ đôi, đôi khi có tua cuốn đơn Cụm hoa khác gốc, dạng chùy
mảnh, dài, nhất là đối với hoa đực Hoa nhỏ, màu trắng hoặc lục nhạt, có lá bắc con;
cuống hoa có đốt Đài hoa hình bánh xe, chia 5 thùy, ngắn Tràng hình bánh xe, hơi hàn liền phần gốc tràng, có đầu nhọn Nhị 5, ở phần gốc chỉ nhị hàn liền thành cột Bao phấn 1 ô, nhưng nhìn có vẻ như 2 ô Bầu hình cầu nhỏ, 2-3 ngăn, 2-3 vòi nhụy
với đầu nhụy chia 2-3 đầu nhọn Quả hình cầu lớn hơn hạt đậu, không mở, 2-3 hạt hình trứng hơi dẹt 2 bên hoặc có 3 góc Hạt sần sùi
Các loài của chi Gynostemma phân bố chủ yếu ở vùng nhiệt đới châu Á và Đông Nam Á từ Himalaya tới Nhật Bản, Malaysia và Tân Guinea Loài G
pentaphyllum là loài phổ biến nhất, phân bố ở Ấn Độ, Nepal, Bangladesh, Srilanca, Lào, Myama, Hàn Quốc, Nhật Bản và Việt Nam [34]
Trang 16• Các loài trong chi Gynostemma tại Việt Nam
Ở Việt Nam, theo Võ Văn Chi và Phạm Hoàng Hộ [5], [10], chi Gynostemma
có 2 loài G pentaphyllum (Thunb.) Makino và G laxum (Wall.) Cogn Năm 2009
Ths Hoàng Văn Lâm đã công bố thêm 1 loài mới thuộc chi Gynostemma, bổ sung
vào hệ thực vật Việt Nam là G longipes C.Y Wu in C.Y WU & S.K Chen [22] Tính đến nay đã có 3 loài thuộc chi Gynostemma đã được công bố ở Việt Nam
1.2.2 TỔNG QUAN VỀ LOÀI GYNOSTEMMA PENTAPHYLLUM
• Đặc điểm thực vật
Hình 1 5 Ảnh cây Giảo cổ lam
Cây thảo mọc leo, yếu, thân cành
mảnh, có góc cạnh không lông hoặc có lông thưa thớt ở mấu Lá kép chân vịt,
cuống chung dài 3-4 cm, phiến do 5-7
lá chét với mép có răng Tua cuốn mảnh, xẻ đôi ở đỉnh Cụm hoa đực
dạng chùm kép, cuống cụm hoa mảnh, phân nhánh nhiều, cỡ 10-15cm
Hoa có cuống mảnh cỡ 1-4 mm, ống đài rất ngắn, thùy đài hình tam giác, đỉnh nhọn, tràng màu xanh nhạt hoặc trắng, thùy tràng hình bầu dục hoặc mũi mác cỡ 2,5-3 × 1mm, đỉnh nhọn có 1 gân, nhị 5 Cụm hoa cái dạng chùm ngắn hơn hoa đực Hoa cái có đài và tràng giống như hoa đực, bầu hình cầu 2-3 ô, vòi nhụy 3, núm nhụy có 2 thùy Quả không tự mở, hình cầu, đường kính 5-6 mm, khi chín màu đen,
2 hạt Hạt hình trứng hoặc hình tim, màu nâu, đỉnh tù gốc hình tim dẹt [5], [6], [7]
• Phân bố, thu hái
Tại Việt Nam cây mọc ở rừng, rừng thưa, lùm bụi từ vùng đồng bằng đến độ cao 2000m, ở nhiều nơi như Lào Cai, Lạng Sơn, Quảng Ninh, Hòa Bình, Vĩnh Phúc, Đà Lạt, Đắc Nông, Thừa Thiên Huế, Kon Tum, Đồng Nai [5], [6]
Trang 17• Thành phần hóa học
Bằng các phản ứng hoá học đã xác định trong cây có chứa saponin, flavonoid, acid amin, acid hữu cơ, sterol, đường khử [4], [9], [11], [14], [20] Bằng phương pháp đo phổ phát xạ tia X đã xác định được trong cây có 15 nguyên tố vô cơ: Al, Si,
Mg, P, K, Mn, Na, Fe, Ba, Ti, Cu, Cr, Pb, Ag Trong đó, nguyên tố có hàm lượng cao nhất là Si (10%), thấp nhất là Ag (0.0001%) [7]
• Tác dụng dược lý
Trên thế giới loài G pentaphyllum đã được nghiên cứu nhiều về tác dụng sinh
học, trong đó [19]:
- Tác dụng hạ cholesterol: các gypenosid trong G pentaphyllum làm giảm
cholesterol toàn phần, lipoprotein tỉ trọng thấp (LDL) và rất thấp (VLDL), làm tăng lipoprotein tỉ trọng cao (HDL) và tỉ lệ HDL/LDL
- Trên đường huyết: các dịch chiết gypenosid với liều uống 100 và 200 mg/kg thể trọng chuột trong 2 tháng đã ngăn chặn được bệnh tăng đường huyết ở chuột cống lão hóa và cải thiện được khả năng dung nạp đường ở chuột lão hóa nuôi bằng glucose (2g/kg)
- Tác dụng trên tim mạch: gypenosid (nồng độ 50, 100 và 200 µg/ml) có tác dụng bảo vệ cơ tim bằng cách hạn chế thiệt hại do sự thiếu glucose và oxygen, ức chế giải phóng men creatine phosphokinase và lactate dehydrogenase (LDH)
- Tác dụng lên hệ miễn dịch: gypenosid đưa vào dạ dày chuột nhắt liều 300 mg/kg thể trọng trong 7 ngày gây tăng chức năng thực bào ở đại thực bào, tăng thành phần có hoạt tính trong huyết thanh, giảm lượng kháng thể tiêu huyết Lượng IgG huyết thanh tăng và tăng thời gian sống sót của chuột được ghép cơ tim
- Tác dụng chữa khối u: tác dụng này do một vài saponin có trong G
pentaphyllum Khi dùng gypenosid liều 30mg/kg và 300mg/kg qua dạ dày hoặc 120mg/kg tiêm phúc mạc theo dõi trong 10 ngày nhận thấy tác dụng cản trở quá trình gây u sarcoma (S180) ở chuột nhắt
- Cao G pentaphyllum (450 mg/kg) ức chế những hoạt động tự phát của chuột
nhắt khi quan sát tác dụng giảm đau của chuột đang ở trên tấm kim loại nóng
Trang 18Các nghiên cứu về loài G pentaphyllum ở Việt Nam cho thấy dược liệu GCL
có tác dụng chống oxy hóa, hạ cholesterol máu, hạ đường huyết, chống khối u và tăng đáp ứng miễn dịch [2], [7], [8], [11], [12]
1.3 MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP CHIẾT XUẤT, TINH CHẾ VÀ ĐỊNH LƯỢNG SAPONIN
1.3.1 Chiết xuất [15]
- Saponin loại trung tính và acid: bột dược liệu được chiết với ether dầu hỏa để loại chất béo, chiết saponin bằng methanol-nước (4:1) Loại methanol dưới áp suất giảm Hoà cặn trong nước được dung dịch 10% rồi lắc với n-butanol Tách lớp n-butanol, bốc hơi dung môi dưới áp suất giảm rồi hoà cặn với methanol để chấm sắc
ký Có thể tinh chế thêm bằng cách rót từ từ dung dịch methanol vào ether có lượng lớn gấp 10-15 lần (có thể dùng aceton hoặc n-hexan thay ether)
- Saponin kiềm thuộc nhóm spirosolan và solanidan có thể chiết như sau: bột dược liệu thêm methanol đun nóng đến sôi trên nồi cách thủy Dịch lọc đem bốc hơi đến khô Cắn được hoà tan trong acid acetic 5%, đun nóng đến 800C rồi kiềm hoá bằng amoniac Tủa được ly tâm rồi hoà tan vào ethanol 96% để chấm sắc ký
- Dùng Sephadex loại G-25, G-50, G-75: lượng Sephadex dùng gấp 50 lần saponin, đem ngâm nước cất cho trương lên, gạn lượng nước thừa, cho gel vào cột sắc ký
Dung dịch đậm đặc saponin trong nước cho lên phần trên cột rồi khai triển bằng nước cất Saponin có phân tử lớn sẽ ra khỏi cột trước saponin có phân tử nhỏ
- Saponin steroid có thể tinh chế bằng cách kết hợp với cholesterol: 1g saponin hoà trong 200ml ethanol đun nóng đến 50-600C rồi cho tác dụng với một dung dịch
Trang 19Trong đó
S: hàm lượng saponin (%) a: khối lượng saponin toàn phần (g) M: khối lượng dược liệu (g)
chứa 2g cholesterol trong 200ml ethanol đã đun nóng, tủa phức sẽ tạo thành Lọc tủa, sấy khô, phá phức bằng cách hoà tan trong pyridin Saponin tinh khiết được tủa trong ether Hoà tan trong methanol để loại hết cholesterol rồi lại tủa với ether
1.3.3 Định lượng [15]
• Phương pháp cân
Bột dược liệu được chiết với ether dầu hỏa để loại chất béo, sau đó chiết saponin bằng MeOH:H2O = 4:1 Loại MeOH dưới áp suất giảm Hòa cặn trong nước để có dung dịch 10% rồi lắc với n-butanol Tách lớp n-butanol, bốc hơi dung môi dưới áp suất giảm đến cắn, để trong bình hút ẩm, cân đến khi khối lượng không đổi Thực hiện thao tác chiết, cân, lấy trung bình 3 lần và suy ra lượng saponin thô toàn phần trong dược liệu
Công thức: Hàm lượng saponin toàn phần
Cân cắn và tính hàm lượng các cắn theo công thức:
S =
) 1
nước-methanol-Detector dùng để phát hiện gồm xác định chỉ số khúc xạ (RI) hay tán xạ bay hơi (ELSD) Detector có nhiều ưu điểm nhất hiện nay là detector khối phổ (MS hay
Trang 20MS/MS với kĩ thuật ion hóa ESI hay APCI) Do các saponin ít có các nối đôi, nhất
là nối đôi liên hợp nên chỉ hấp thụ tử ngoại ở vùng sóng ngắn 195-210 nm, do đó việc sử dụng detector UV tương đối hạn chế trong phân tích saponin
1.4 TỔNG QUAN VỀ QUANG PHỔ TỬ NGOẠI-KHẢ KIẾN (UV – VIS) 1.4.1 Ph ổ hấp thụ UV-VIS [1]
Khi tia bức xạ tương tác với vật chất có thể xảy ra một số quá trình: phản xạ, tán xạ, hấp thụ, huỳnh quang và quang hóa Khi đo quang phổ tử ngoại khả kiến, người ta mong muốn chỉ có quá trình hấp thụ xảy ra Vì bức xạ điện từ là các hạt mang năng lượng nên khi phân tử hấp thụ, nó sẽ kích thích hệ electron của phân tử
và làm tăng nội năng của nó Năng lượng tổng của một phân tử bao gồm: năng lượng chuyển động tịnh tiến của phân tử (Et), năng lượng của điện tử (Ee), năng lượng của các dao động (Ev) và năng lượng của chuyển động quay (Er)
Etổng = Et + Ee + Ev + Er (Ee >> Ev >> Er)
Sự hấp thụ bức xạ tử ngoại-khả kiến có thể làm thay đổi mức năng lượng điện
tử Ee và là nguồn gốc của phổ UV-VIS Do đó phổ UV-VIS được gọi là phổ điện tử
1.4.2 Định luật Lambert – Beer [1]
Chiếu một chùm tia sáng đơn sắc có bước sóng λ và cường độ I0 qua dung dịch đồng nhất có nồng độ C, bề dày lớp dung dịch là L Khi đi qua dung dịch, một phần ánh sáng sẽ bị hấp thụ lại, một phần bị phản xạ, phần còn lại sẽ đi qua dung dịch với cường độ I
Mối quan hệ giữa phần ánh sáng I và thể hiện bằng định luật Lambert - Beer
Với ε là hệ số hấp thụ riêng của dung dịch Hệ số này không phụ thuộc nồng
độ, chỉ phụ thuộc vào bản chất của chất tan và bước sóng của ánh sáng chiếu vào dung dịch
* Điều kiện ứng dụng của định luật
- Chùm tia sáng phải đơn sắc
- Dung dịch phải loãng (nằm trong khoảng nồng độ thích hợp)
Trang 21- Dung dịch phải trong suốt
- Chất thử phải bền trong dung dịch và phải bền dưới tác dụng của ánh sáng (UV – VIS)
* Một số đại lượng thông dụng
- Độ truyền qua (hay còn gọi là độ thấu quang)
Đặc trưng cho độ trong suốt (về mặt hóa học) của dung dịch, được định nghĩa
Thường T tính ra phần trăm Một chất có T=1 (hay 100%) nghĩa là hoàn toàn không có hấp thụ ánh sáng, người ta nói chất đó hoàn toàn trong suốt
- Độ hấp thụ
Độ hấp thụ (hay còn gọi là mật độ quang) được định nghĩa:
Đối với 1 chất xác định (có ε xác định) thường đo trên 1 loại cốc đo và thường
có bề dày l=1cm, như vậy độ hấp thụ tỉ lệ thuận với nồng độ dung dịch:
- Hệ số hấp thụ riêng (
Theo công thức nếu l=1cm, C=1% thì
Vậy chính là độ hấp thụ của dung dịch có nồng độ 1%, dùng cốc đo có
bề dày 1cm Với 1 chất tan xác định, tại một ε xác định, là một hằng số
- Hệ số hấp thụ phân tử (
Hệ số hấp thụ phân tử (còn gọi là hệ số mol) là độ hấp thụ của dung dịch có nồng độ 1M, dùng cốc đo có bề dày 1cm
Trang 22Cũng như , với 1 chất xác định, trong điều kiện đo nhất định (bước sóng, dung môi, nhiệt độ…) là 1 hằng số
Giữa và có mối liên hệ
Trong đó: M là phân tử lượng gam của chất tan
1.4.3 Ứng dụng quang phổ UV-VIS trong phân tích định lượng dung dịch một thành phần [3]
Đối với dung dịch một thành phần có thể sử dụng các kĩ thuật định lượng sau
• Tính toán trực tiếp từ mật độ quang đo được
Với các chất có mật độ hấp thụ riêng biết trước chính xác và ổn định ở một bước sóng nào đó, người ta có thể đo mật độ quang của dung dịch chất đó trong dung môi tương ứng tại bước sóng này Nồng độ dung dịch được tính theo công
thức:
Muốn áp dụng kĩ thuật này máy quang phổ phải được chuẩn hóa về bước sóng
và giá trị mật độ quang, dung dịch phải trong suốt và có nồng độ nằm trong vùng đáp ứng của định luật Lambert – Beer
• Đo so sánh với dung dịch chuẩn
Xác định mật độ quang của dung dịch thử có nồng độ Cx (chưa biết) được tiến hành đồng thời với việc xác định mật độ quang của dung dịch chuẩn có nồng độ Cc
đã biết chính xác, trong điều kiện thỏa mãn định luật Lambert – Beer thì Cx được tính theo công thức:
Trong kĩ thuật so sánh, kết quả càng chính xác khi nồng độ Cx càng gần với
nồng độ dung dịch chuẩn Cc
• Kỹ thuật đường chuẩn
Là so sánh dung dịch thử với nhiều dung dịch chuẩn bằng cách chuẩn bị 5-8 dung dịch chuẩn có nồng độ khác nhau Đo mật độ quang của từng dung dịch chuẩn
1%
1cm
x xE
A
C =
c c
x x c
x c
x
C.A
ACC
CA
Trang 23và vẽ đồ thị biểu diễn mối quan hệ giữa mật độ quang và nồng độ của các dung dịch chuẩn Trong trường hợp các dung dịch đo thỏa mãn điều kiện định luật Lambert-Beer thì đường chuẩn thẳng, sau đó từ mật độ quang của dung dịch thử, dựa vào phương trình đường chuẩn để tính ra nồng độ của dung dịch thử
• Kỹ thuật thêm chuẩn
Để hạn chế ảnh hưởng của tạp chất người ta đưa thêm vào dung dịch thử một lượng chính xác chuẩn làm cho nồng độ dung dịch tăng thêm một lượng Co Đo mật
độ quang của dung dịch thử (A) và dung dịch thử thêm chuẩn (A’), nồng độ của dung dịch thử được tính theo công thức
= Cx = * Co
• Kỹ thuật thêm đường chuẩn
Được tiến hành bằng cách thêm chính xác các lượng chất chuẩn khác nhau vào dung dịch cần định lượng Vẽ đường chuẩn thể hiện mối quan hệ của mật độ quang
và nồng độ dung dịch thử thêm chuẩn Giao điểm của đường chuẩn với trục nồng độ
là giá trị nồng độ dung dịch cần định lượng
Cx
xAA
Trang 241.5 TỔNG QUAN VỀ NHỰA HẤP PHỤ
1.5.1 Định nghĩa và phân loại
Nhựa hấp phụ là hạt polymer hình cầu, màu trắng, có cấu trúc xốp với các lỗ
lớn trên bề mặt; hấp phụ nhờ lực liên kết tự do Vander Waals hoặc liên kết hydro,
có cấu trúc mạng và diện tích bề mặt tiếp xúc lớn, được ứng dụng chủ yếu để tách các nhóm chất khác nhau [37]
Nhựa hấp phụ có thể được chia thành hai loại chính: không phân cực và phân
cực Theo độ phân cực được chia thành phân cực yếu, phân cực trung bình và phân cực mạnh Được sử dụng nhiều hiện nay gồm các loại nhựa: D101, DA201, D, chuỗi SIP, X5, AB8, GDX104, LD605, LD601, CAD40, DM130, RA, CHA111, WLD (loại hỗn hợp), H107, NKA9,… [20]
1.5.2 Ứng dụng trong tách và tinh chế Saponin
Tại Mỹ, nhựa hấp phụ chủ yếu được sử dụng trong công nghiệp hóa chất, luyện kim, thực phẩm với tác dụng làm sạch và khử trùng nước uống [21], loại bỏ chất thải công nghiệp chứa các ion Cr (VI) độc hại [31] Tại Trung Quốc, nhựa chủ yếu được sử dụng trong công nghệ thực phẩm và Y học cổ truyền [20]
Wang Hong và cộng sự đã sử dụng nhựa D101, ngoài ra có thể sử dụng DA20111, D3520, AB8, AASI2, D3520, D4020 để nghiên cứu và tối ưu hóa việc
tách và tinh chế saponin toàn phần từ Sơn thù du (Cornus officinalis) Kết quả thu
được hàm lượng saponin toàn phần là 2.49%, cao hơn so với phương pháp tách chiết bằng dung môi hữa cơ là 2,19% Ngoài ra có thể sử dụng các loại nhựa khác như DA20111, D3520, AB8, AASI2, D3520, D4020 Nghiên cứu đã chứng minh
nhựa hấp phụ còn cho hiệu quả tốt trong việc loại bỏ đường hòa tan trong nước và các tạp chất khác Phương pháp tách chiết dung môi thông thường có chi phí cao, quá trình phức tạp, đặc biệt là việc sử dụng chiết xuất bằng dung môi hữu cơ là khó khăn hơn trong sản xuất thực tế Quy trình mới sử dụng nước – ethanol và nhựa hấp phụ không chỉ đơn giản, tiết kiệm mà sản lượng sản phẩm và chất lượng còn được cải thiện đáng kể [33] Zhang Chongxi sử dụng nhựa D101 cho tỉ lệ thu Ginsenosides lên đến 90% với độ tinh khiết cao nhất, đưa tổng hàm lượng saponin
Trang 25trong nhâm sâm khô đạt 60% [36] Liu Chen và cộng sự nghiên cứu sử dụng trên
Ngũ gia bì (Acanthopanax) với 3 loại nhựa D101, NKA9, AB8, sử dụng phương
pháp HPLC để định lượng glycoside D Kết quả D101, NKA9, AB8 có khả năng hấp phụ bão hòa tương ứng là 11.88 mg/g; 7.92 mg/g và 12.18 mg/g [26] Li-Sheng Wang và cộng sự dùng phương pháp TLC để kiểm tra khả năng hấp phụ của nhựa D101 đối với saponin trong Huyền sâm (Scrophularia ningpoensis) Kết quả nhựa
D101 có thể hấp phụ 8,7% đến 27,3% saponin, tăng 20% - 52,1% so với phương pháp thông thường [25]
Trang 26CHƯƠNG 2 NGUYÊN VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ
PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1 NGUYÊN VẬT LIỆU, THIẾT BỊ, HÓA CHẤT
2.1.1 Nguyên liệu
Nguyên liệu là phần trên mặt đất của 10 mẫu thuộc loài G pentaphyllum thu
hái tại các vùng trồng ở 3 địa phương khác nhau, mỗi mẫu 500g khô:
- Mẫu thu hái tại Tam Đảo: TĐ1, TĐ2, TĐ3
- Mẫu thu hái tại Hòa Bình: HB1, HB2, HB3
- Mẫu thu hái tại Đà Lạt: ĐL1, ĐL2, ĐL3, ĐL4
Dược liệu sau khi thu hái được phơi ở nơi thoáng mát, sấy ở nhiệt độ 600
C (tủ
sấy Shellab) và bảo quản trong túi nilon kín ở nơi khô ráo, thoáng mát
2.2.2 Dụng cụ thiết bị
- Tủ sấy SHELLAB
- Cân phân tích Precisa XT220A
- Máy đo hàm ẩm Precisa XM 60
- Máy chiết siêu âm Qsonica - Mỹ
- Bộ sinh hàn hồi lưu và bộ chiết soxhlet
- Bể điều nhiệt Sartoriu
- Sắc ký lớp mỏng sử dụng bản mỏng tráng sẵn Silicagel GF254 của MERCK (Đức)
- Tủ sấy BINDER – Đức
- Máy cất chân không BÜCHi ROTAVAPOR R-200
- Pipet tự động 100µl
- Máy đo quang Shanghai METASH – Trung Quốc
- Các dụng cụ thủy tinh khác: Bình định mức, pipet, ống nghiệm, ống đong, ống ly tâm, phễu lọc, cốc có mỏ, đũa thủy tinh
Nghiên cứu sử dụng các bộ dụng cụ tại phòng thí nghiệm của Bộ môn Dược
liệu trường Đại học Dược Hà Nội
Trang 272.1.3 Hóa chất
- Dung môi dùng cho quá trình chiết xuất: EtOH, MeOH, ether dầu hỏa, butanol, nước cất
n Chất chuẩn tinh khiết Rb1 chiết xuất từ Panax ginseng C.A.Mey của công ty
Shanghai TautoBiotech, độ tinh khiết đạt 97%
- Hóa chất tinh khiết: EtOH, Cloroform, Acid acetic băng, vanillin, acid perchloric
- Nhựa hấp phụ D101 của Anhui sanxing resin Technology Co Ltd
2.2 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU
- Xây dựng quy trình tối ưu chiết xuất saponin toàn phần từ dược liệu
- Xây dựng quy trình tinh chế saponin
- Xây dựng các điều kiện định lượng Saponin trong Giảo cổ lam bằng kỹ thuật UV-VIS nhằm xác định điều kiện tối ưu: Thời gian, nhiệt độ, nồng độ thuốc thử
- Thẩm định lại phương pháp vừa xây dựng: khoảng tuyến tính, độ lặp lại, độ đúng
- Định lượng saponin toàn phần từ Giảo cổ lam bằng phương pháp cân và phương pháp đo quang Sử dụng các phép toán thống kê để xử lí và so sánh kết quả của hai phương pháp trên
- Từ phương pháp đã xây dựng được, tiến hành định lượng saponin trong một
số mẫu Giảo cổ lam
2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.3.1 Chiết xuất
• Xác định độ ẩm của bột dược liệu:
Dược liệu được sấy khô, cắt nhỏ và nghiền thành bột Lấy khoảng 1g bột mẫu nghiên cứu để xác định độ ẩm của dược liệu Bật máy đo độ ẩm, điều chỉnh nhiệt độ
ở 110oC, rắc bột dược liệu lên đĩa cân và trải đều lên mặt đĩa, đậy đĩa cân và đợi máy tự động hiện kết quả lên màn hình Đọc kết quả Tiến hành 3 lần, lấy kết quả trung bình
Trang 28tạp chất để thuận tiện cho quá trình tinh chế và định lượng tiếp theo
Đối với saponin, chúng tôi tiến hành khảo sát quy trình chiết xuất với 3 phương pháp: chiết soxhlet, chiết hồi lưu, chiết siêu âm, với mỗi phương pháp sử
dụng 4 dung môi khác nhau là MeOH, EtOH 50%, 70%,90%
Phương pháp chiết bằng soxhlet
Hình 2.1 B ộ dụng cụ
chiết soxhlet
- Làm túi bằng giấy lọc: cắt một miếng giấy lọc vuông,
cuộn tròn, gập đáy, dùng gim để ghim mép giấy
- Cân chính xác khoảng 50g bột dược liệu thô cho vào trong túi đã chuẩn bị sẵn, gập miệng túi và đặt vào dụng cụ chiết
- Lắp dụng cụ, đặt lên nồi cách thuỷ Ðặt phễu lên
miệng ống sinh hàn Rót 500ml dung môi qua phễu (lần lượt là MeOH, EtOH 50%,70%,
90%)
- Chiết hồi lưu nhiều lần cho đến khi saponin được chiết kiệt (kiểm tra bằng SKLM với hệ dung môi CHCl3:MeOH:H2O = 65:35:10)
- Gộp dịch chiết lọc qua giấy lọc rồi cất thu hồi dung môi dưới áp suất giảm đến cắn Dùng cắn thu được
tiến hành các bước như hình 2.4
Trang 29 Phương pháp chiết hồi lưu
Hình 2.2 B ộ dụng cụ
chiết hồi lưu
- Cân chính xác khoảng 50g bột dược liệu thô cho vào bình cầu sạch dung tích 500ml, thấm ẩm bột dược liệu
bằng lượng dung môi vừa đủ rồi thêm dung môi đến
ngập hết dược liệu (tổng 250ml dung môi), lần lượt là MeOH, EtOH 50%,70%, 90%
- Lắp dụng cụ, đặt lên nồi cách thủy Đun sôi trong 30 phút Lấy dịch chiết và lọc Tiếp tục thêm dung môi đến ngập dược liệu và chiết đến khi dịch chiết trong
suốt (3 lần) Gộp dịch chiết thu được đem lọc rồi cất thu hồi dung môi dưới áp suất giảm đến cắn Dùng
cắn thu được tiến hành các bước như hình 2.4
Phương pháp chiết siêu âm
Hình 2.3
Máy chiết siêu âm
- Cân chính xác khoảng 50g bột dược liệu thô cho vào
cốc cỏ mỏ sạch dung tích 500ml, thấm ẩm bột dược
liệu bằng lượng dung môi vừa đủ rồi thêm dung môi đến ngập hết dược liệu (tổng 250ml dung môi) với dung môi lần lượt là MeOH, EtOH 50%,70%,
90%
- Tiến hành chiết bằng máy siêu âm trong thời gian 10 phút, công suất 40% Thu lấy dịch chiết Tiếp tục thêm dung môi đến ngập dược liệu và chiết đến khi dịch chiết trong suốt (3 lần) Gộp dịch chiết thu được đem lọc rồi cất thu hồi dung môi dưới áp suất giảm đến cắn Dùng cắn thu được tiến hành các bước như hình 2.4
Trang 30Trong đó S: hàm lượng saponin (%)
a: khối lượng saponin toàn phần (g) M: khối lượng dược liệu (g)
x: Hàm ẩm dược liệu
Hình 2.4 Sơ đồ định lượng saponin toàn phần theo phương pháp cân bằng
các ph ương pháp chiết và dung môi khác nhau
Công thức: Hàm lượng saponin toàn phần
Cân cắn và tính hàm lượng các cắn theo công thức:
S =
) 1
Trang 312.3.2 Tinh chế
Căn cứ vào tài liệu tham khảo và quy trình thực nghiệm, chúng tôi xây dựng quy trình tinh chế mẫu bằng phương pháp chiết lỏng-rắn như sau:
• Chuẩn bị
- Nhựa sử dụng: D101, được làm sạch bằng nước cất
- Cân khoảng 5g dược liệu, chiết bằng phương pháp đã lựa chọn, lấy dịch chiết bốc hơi dung môi đến cắn rồi hòa tan bằng 5ml nước thu được dung dịch (1)
- Chuẩn bị cột: Cột thủy tinh có khóa và nút mài, đường kính 2,5cm; chiều dài 25cm; rửa sạch, sấy khô, cố định trên giá theo chiều thẳng đứng, lót một lớp bông thủy tinh ở đáy cột
- Chất nhồi cột: 20g nhựa hấp phụ (đã làm sạch) ngâm trong dung dịch (1) trong 60 phút, vừa ngâm vừa lắc nhẹ để quá trình hấp phụ xảy ra hoàn toàn
• Khảo sát dung môi rửa giải
Để lựa chọn dung môi rửa giải thích hợp, chúng tôi tiến hành khảo sát dung môi rửa giải từ nước cất, EtOH 10% đến EtOH 90%, MeOH
- Nhồi cột: Đưa nhựa hấp phụ ngâm trong dung dịch (1) vào cột từ từ, vừa rót
vừa gõ nhẹ để đuổi hết bọt khí
- Rửa giải:
Ban đầu rửa giải bằng nước đến hết màu
Lần lượt rửa giải với các dung môi EtOH 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% và MeOH Chuyển dung môi mới khi đã rửa kiệt saponin bằng dung môi cũ (kiểm tra bằng phản ứng tạo bọt và SKLM với hệ CHCl3:MeOH:H2O
= 65:35:10) Từng dịch rửa được hứng vào các cốc có mỏ sạch và làm khô đến cắn Định tính saponin trong các cắn thu được bằng phản ứng tạo bọt Căn cứ vào kết quả thu được lựa chọn dung môi rửa giải thích hợp để thu được saponin toàn phần
2.3.3 Định lượng bằng phương pháp đo quang
Căn cứ vào các tài liệu tham khảo [18], [23], [38] và quy trình thực nghiệm, chúng tôi tiến hành xây dựng phương pháp định lượng như sau: