Xây dựng phương pháp định lượng saponin toàn phần trong giảo cổ lam bằng phương pháp đo quang

LỜI CẢM ƠNKhóa luận “Xây dựng phương pháp định lượng saponin toàn phần trong Giảo cổ lam bằng phương pháp đo quang” được tôi hoàn thành tại bộ môn Dược liệu, trường Đại học Dược Hà Nội với sự làm việc nghiêm túc, nỗ lực hết mình của bản thân và sự khích lệ từ phía nhà trường, thầy cô, gia đình và bè bạn.Trước hết tôi xin được bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới ThS. Phạm Tuấn Anhngười thầy đã dành nhiều thời gian và tâm huyết hướng dẫn nghiên cứu, giúp tôi hoàn thành khóa luận tốt nghiệp.Tôi xin chân thành cảm ơn ThS. Lê Thanh Bình đã giúp đỡ, chỉ bảo, động viên trong quá trình tôi thực hiện khóa luận tai bộ mônTôi xin chân thành cảm ơn Ban giám hiệu, các thầy cô giáo Trường Đại học Dược Hà Nội cũng như các thầy cô giáo, các anh chị kĩ thuật viên bộ môn Dược liệu đã tạo điều kiện tốt nhất cho tôi trong quá trình học tập và nghiên cứu.Cuối cùng tôi xin tỏ lòng biết ơn gia đình, bạn bè đã động viên tôi về mọi mặt và giúp đỡ tôi tận tình trong quá trình học tập, nghiên cứu, là động lực không nhỏđể tôi có kết quả ngày hôm nay.Chân thành cảm ơnHà Nội, tháng 05 năm 2013Sinh viênTrịnh Thị Diệp Thanh

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI TRỊNH THỊ DIỆP THANH XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG SAPONIN TOÀN PHẦN TRONG GIẢO CỔ LAM BẰNG PHƯƠNG PHÁP ĐO QUANG KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ HÀ NỘI – 2013 BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI TRỊNH THỊ DIỆP THANH XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG SAPONIN TOÀN PHẦN TRONG GIẢO CỔ LAM BẰNG PHƯƠNG PHÁP ĐO QUANG KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ Người hướng dẫn ThS. Phạm Tuấn Anh Nơi thực hiện Bộ môn Dược liệu HÀ NỘI – 2013 LỜI CẢM ƠN Khóa luận “Xây dựng phương pháp định lượng saponin toàn phần trong Giảo cổ lam bằng phương pháp đo quang” được tôi hoàn thành tại bộ môn Dược liệu, trường Đại học Dược Hà Nội với sự làm việc nghiêm túc, nỗ lực hết mình của bản thân và sự khích lệ từ phía nhà trường, thầy cô, gia đình và bè bạn. Trước hết tôi xin được bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới ThS. Phạm Tuấn Anh người thầy đã dành nhiều thời gian và tâm huyết hướng dẫn nghiên cứu, giúp tôi hoàn thành khóa luận tốt nghiệp. Tôi xin chân thành cảm ơn ThS. Lê Thanh Bình đã giúp đỡ, chỉ bảo, động viên trong quá trình tôi thực hiện khóa luận tai bộ môn Tôi xin chân thành cảm ơn Ban giám hiệu, các thầy cô giáo Trường Đại học Dược Hà Nội cũng như các thầy cô giáo, các anh chị kĩ thuật viên bộ môn Dược liệu đã tạo điều kiện tốt nhất cho tôi trong quá trình học tập và nghiên cứu. Cuối cùng tôi xin tỏ lòng biết ơn gia đình, bạn bè đã động viên tôi về mọi mặt và giúp đỡ tôi tận tình trong quá trình học tập, nghiên cứu, là động lực không nhỏ để tôi có kết quả ngày hôm nay. Chân thành cảm ơn! Hà Nội, tháng 05 năm 2013 Sinh viên Trịnh Thị Diệp Thanh MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ 1 CHƯƠNG I. TỔNG QUAN 2 1.1. TỔNG QUAN VỀ SAPONIN VÀ SAPONIN NHÂN DAMMARAN 2 1.1.1. Saponin 2 1.1.2. Saponin nhân Dammaran 2 1.2. TỔNG QUAN VỀ CHI GYNOSTEMMA BLUME VÀ LOÀI GYNOSTEMMA PENTAPHYLLUM 6 1.2.1. Chi Gynostemma Blume 6 1.2.2. TỔNG QUAN VỀ LOÀI GYNOSTEMMA PENTAPHYLLUM 7 1.3. MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP CHIẾT XUẤT, TINH CHẾ VÀ ĐỊNH LƯỢNG SAPONIN 9 1.3.1. Chiết xuất 9 1.3.2. Tinh chế 9 1.3.3. Định lượng 10 1.4. TỔNG QUAN VỀ QUANG PHỔ TỬ NGOẠI-KHẢ KIẾN (UV – VIS) 11 1.4.1. Phổ hấp thụ UV-VIS 11 1.4.2. Định luật Lambert – Beer. 11 1.4.3. Ứng dụng quang phổ UV-VIS trong phân tích định lượng dung dịch một thành phần 13 1.5. TỔNG QUAN VỀ NHỰA HẤP PHỤ 15 1.5.1. Định nghĩa và phân loại 15 1.5.2. Ứng dụng trong tách và tinh chế Saponin 15 CHƯƠNG 2. NGUYÊN VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 17 2.1. NGUYÊN VẬT LIỆU, THIẾT BỊ, HÓA CHẤT 17 2.1.1. Nguyên liệu 17 2.2.2. Dụng cụ thiết bị 17 2.1.3. Hóa chất 18 2.2. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 18 2.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18 2.3.1. Chiết xuất 18 2.3.2. Tinh chế 22 2.3.3. Định lượng bằng phương pháp đo quang 22 2.3.4. Thẩm định và đánh giá phương pháp 24 2.3.5. Phương pháp xử lý số liệu 25 2.3.6. Ứng dụng phương pháp xây dựng được để định lượng saponin toàn phần trong một số mẫu Giảo cổ lam. 27 CHƯƠNG 3. THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ 28 3.1. KHẢO SÁT PHƯƠNG PHÁP CHIẾT XUẤT VÀ TINH CHẾ MẪU 28 3.1.1. Khảo sát phương pháp chiết xuất 28 3.1.2. Khảo sát phương pháp tinh chế 29 3.1.3. Quy trình xử lí mẫu 30 3.3. KHẢO SÁT CỰC ĐẠI HẤP THỤ QUANG VÀ ĐIỀU KIỆN PHẢN ỨNG 31 3.3.1. Khảo sát cực đại hấp thụ quang 31 3.3.2. Khảo sát điều kiện phản ứng 32 3.4. THẨM ĐỊNH VÀ ĐÁNH GIÁ PHƯƠNG PHÁP UV-VIS KHI ĐỊNH LƯỢNG SAPONIN TOÀN PHẦN TRONG GIẢO CỔ LAM. 36 3.4.1. Thẩm định phương pháp 36 3.4.2. Đánh giá phương pháp. 41 3.5. ỨNG DỤNG PHƯƠNG PHÁP VỪA XÂY DỰNG VÀO ĐỊNH LƯỢNG MỘT SỐ MẪU GIẢO CỔ LAM 42 3.5.1. Quy trình định lượng 42 3.5.2. Xây dựng công thức tính hàm lượng saponin toàn phần trong GCL 44 3.5.3. Kết quả 44 3.6. BÀN LUẬN 45 3.6.1. Về phương pháp chiết xuất và tinh chế mẫu 45 3.6.2. Về khảo sát điều kiện đo quang 45 3.6.3. Về thẩm định phương pháp định lượng 45 3.6.5.Về kết quả định lượng saponin trong các mẫu Giảo cổ lam 47 CHƯƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 48 4.1. KẾT LUẬN 48 4.2. ĐỀ XUẤT 49 DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT C chuẩn , C thử : Nồng độ của chất chuẩn, chất thử D : Mật độ quang ELSD : Detector tán xạ bay hơi (Evaporative light scattering detector) ESI : Ion hóa bằng phun điện tử (Electronspray ionization) EtOH : Ethanol G. : Gynostemma GCL : Giảo cổ lam HPLC : Sắc ký lỏng hiệu năng cao MeOH : Methanol RI : Chỉ số khúc xạ (Refractive Index) RSD : Độ lệch chuẩn tương đối (Relative Standard Deviation) SD : Độ lệch chuẩn(Standard Deviation) SKLM : Sắc kí lớp mỏng STT : Số thứ tự TT : Thuốc thử tt/tt : Thể tích/thể tích UV – VIS : Tử ngoại – khả kiến (Ultraviolet – Visible) V : Thể tích DANH MỤC BẢNG BIỂU STT Tên bảng biểu Trang 1 Bảng 1.1. Các nhóm thế và một số saponin tương ứng trong G. pentaphyllum 4 2 Bảng 3.1. Hàm lượng saponin toàn phần thu được từ GCL bằng các phương pháp và dung môi chiết khác nhau 28 3 Bảng 3.2. Kết quả khảo sát dung môi rửa giải 29 4 Bảng 3.3. Ảnh hưởng của nhiệt độ tới phản ứng 33 5 Bảng 3.4. Ảnh hưởng của thời gian phản ứng 33 6 Bảng 3.5. Ảnh hưởng của nồng độ thuốc thử vanillin 34 7 Bảng 3.6. Ảnh hưởng của nồng độ acid perchloric 35 8 Bảng 3.7. Kết quả xây dựng đường chuẩn 37 9 Bảng 3.8. Kết quả khảo sát độ lặp lại của phương pháp 38 10 Bảng 3.9. Kết quả khảo sát độ đúng của phương pháp 40 11 Bảng 3.10. Kết quả định lượng saponin toàn phần trong GCL bằng phương pháp cân và phương pháp UV-VIS 41 12 Bảng 3.11. Kết quả định lượng saponin toàn phần trong các mẫu Giảo cổ lam 44 DANH MỤC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ STT Tên hình vẽ, đồ thị Trang 1 Hình 1.1. Cấu trúc của các Dammaran thuộc nhóm Saponin triterpen tetracyclic 3 2 Hình 1.2. Cấu trúc saponin trong G. pentaphyllum 4 3 Hình 1.3. Các cấu trúc nhóm R7 4 4 Hình 1.4. Công thức cấu tạo của Ginsenoside Rb1 5 5 Hình 1.5. Ảnh của cây Giảo cổ lam 7 6 Hình 1.6. Kĩ thuật thêm đường chuẩn 14 7 Hình 2.1. Bộ dụng cụ chiết soxhlet 19 8 Hình 2.2. Bộ dụng cụ chiết hồi lưu 20 9 Hình 2.3. Máy chiết siêu âm 20 10 Hình 2.4. Sơ đồ định lượng saponin toàn phần theo phương pháp cân bằng các phương pháp chiết và dung môi khác nhau 21 11 Hình 3.1. Quy trình tinh chế saponin bằng chiết lỏng-rắn và chiết lỏng-lỏng 31 12 Hình 3.2. Phổ hấp thụ của sản phẩm phản ứng 32 13 Hình 3.3. Đồ thị ảnh hưởng của nhiệt độ phản ứng 33 14 Hình 3.4. Đồ thị ảnh hưởng của thời gian phản ứng 34 15 Hình 3.5. Đồ thị ảnh hưởng của nồng độ thuốc thử Vanilin 35 16 Hình 3.6. Đồ thị ảnh hưởng của nồng độ thuốc thử acid perchloric 36 17 Hình 3.7. Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc mật độ quang vào nồng độ chất chuẩn tại bước sóng 550nm 37 18 Hình 3.8. Đồ thị xác định hàm lượng saponin toàn phần trong mẫu GCL theo kỹ thuật thêm đường chuẩn 39 1 ĐẶT VẤN ĐỀ Ngày nay trên thế giới, xu hướng trở về với thiên nhiên, tìm kiếm nguồn thuốc mới và sử dụng thuốc từ thảo dược ngày càng tăng. Giảo cổ lam là một vị thuốc quý được người dân ở nhiều nước châu Á sử dụng từ lâu đời nhằm tăng cường sức khỏe và tuổi thọ. Nhiều báo cáo khoa học chứng minh một số tác dụng sinh học của Giảo cổ lam như: hạ đường huyết, giảm cholesterol, giảm triacylglycerol máu …, trong đó saponin được cho là thành phần tạo nên các tác dụng sinh học này. Trên thị trường Việt nam hiện nay xuất hiện rất nhiều chế phẩm Giảo cổ lam dưới dạng trà và được người dân sử dụng rộng rãi. Vì vậy việc quản lí chất lượng dược liệu là một vấn đề cần được chú trọng để đảm bảo chất lượng của các sản phẩm cũng như việc sử dụng thuốc trong dân gian có hiệu quả. Tuy nhiên Dược điển Việt Nam chưa có chuyên luận về dược liệu Giảo cổ lam nên quá trình đánh giá còn gặp nhiều khó khăn. Với mục đích xác định hàm lượng saponin trong Giảo cổ lam, đồng thời xây dựng phương pháp định lượng saponin trong các chế phẩm Giảo cổ lam đang được sử dụng tại Việt Nam, giúp kiểm nghiệm viên có thêm nhiều lựa chọn khi tìm phương pháp kiểm nghiệm phù hợp với điều kiện thực tế nơi làm việc, chúng tôi đã tiến hành đề tài: “Xây dựng phương pháp định lượng saponin trong Giảo cổ lam bằng phương pháp đo quang” với các mụ c tiêu cụ thể như sau: 1. Xây dựng quy trình chiết xuất và tinh chế saponin toàn phần từ dược liệu Giảo cổ lam. 2. Xây dựng phương pháp định lượng saponin toàn phần trong Giảo cổ lam bằng phương pháp đo quang. 3. Thẩm định phương pháp xây dựng được và ứng dụng để định lượng saponin toàn phần trong một số mẫu Giảo cổ lam. [...]... TNG QUAN 1.1 TNG QUAN V SAPONIN V SAPONIN NHN DAMMARAN 1.1.1 Saponin [15] nh ngha Saponin cũn gi l saponosid l mt nhúm glycosid ln, gp rng rói trong thc vt Saponin cng cú trong mt s ng vt nh hi sõm, cỏ sao Phõn loi, cu trỳc húa hc - V mt phõn loi, da theo cu trỳc hoỏ hc cú th chia thnh saponin triterpenoid v saponin steroid - Saponin triterpenoid cú loi trung tớnh v loi acid, saponin steroid cú loi... saponin t khi nhóo ny bng ethanol 80% núng Lc ri bc hi - Dựng Sephadex loi G-25, G-50, G-75: lng Sephadex dựng gp 50 ln saponin, em ngõm nc ct cho trng lờn, gn lng nc tha, cho gel vo ct sc ký Dung dch m c saponin trong nc cho lờn phn trờn ct ri khai trin bng nc ct Saponin cú phõn t ln s ra khi ct trc saponin cú phõn t nh - Saponin steroid cú th tinh ch bng cỏch kt hp vi cholesterol: 1g saponin ho trong. .. saponin ny cú kh nng chuyn glucose thnh glycogen v ngn nga hin tng gim glycogen Cỏc saponin trong chi Gynostemma Cỏc nghiờn cu u tiờn ó phỏt hin saponin cú mt trong gio c lam thuc nhúm dammaran ó cú trờn 100 saponin trong thnh phn G pentaphyllum c phõn lp v nhn dng cu trỳc, trong ú cú 8 saponin ging nh loi protopanaxadiol trong ginsenosid ca Panax ginseng l Rb1 (Gypenosid III) [24], [32], Rc [27], Rb3... 1.1.2 Saponin nhõn Dammaran Theo cỏc nghiờn cu [24], [27], [32] saponin l mt trong nhng nhúm cht chớnh ca cỏc loi trong chi Gynostemma, trong ú ch yu l cỏc saponin thuc nhúm Dammaran Do ú, chỳng tụi tng quan sõu hn v nhúm cu trỳc ny Dammaran l nhúm saponin triterpenic cú cu trỳc 4 vũng (triterpenoid tetracyclic) Trong cụng thc phõn t cú 30 carbon v do 6 nhúm hemiterpen ghộp li theo qui tc u uụi Cỏc saponin. .. tinh ch saponin - Xõy dng cỏc iu kin nh lng Saponin trong Gio c lam bng k thut UV-VIS nhm xỏc nh iu kin ti u: Thi gian, nhit , nng thuc th - Thm nh li phng phỏp va xõy dng: khong tuyn tớnh, lp li, ỳng - nh lng saponin ton phn t Gio c lam bng phng phỏp cõn v phng phỏp o quang S dng cỏc phộp toỏn thng kờ x lớ v so sỏnh kt qu ca hai phng phỏp trờn - T phng phỏp ó xõy dng c, tin hnh nh lng saponin trong. .. 1,08mg/ml Kho sỏt v tỡm iu kin o quang Kho sỏt cc i hp th quang Do cỏc saponin ớt cú cỏc ni ụi, nht l ni ụi liờn hp nờn ch hp th t ngoi vựng súng ngn 195-210 nm Vỡ vy nh lng c saponin bng phng phỏp o quang, chỳng tụi tin hnh phn ng Rosenthalerca saponin vi thuc th acid perchloric v vanillin trong acid acetic bng cho sn phm mu tớm hoa c Sau ú quột ph trờn mỏy o quang ph trong khong bc súng t 300 800nm... sut gim n cn, trong bỡnh hỳt m, cõn n khi khi lng khụng i Thc hin thao tỏc chit, cõn, ly trung bỡnh 3 ln v suy ra lng saponin thụ ton phn trong dc liu Cụng thc: Hm lng saponin ton phn Cõn cn v tớnh hm lng cỏc cn theo cụng thc: S= a ì 100% M ì (1 x) Trong ú S: hm lng saponin (%) a: khi lng saponin ton phn (g) M: khi lng dc liu (g) Phng phỏp HPLC õy l phng phỏp hin nay c s dng nhiu trong nh tớnh,... quang ca dung dch cht ú trong dung mụi tng ng ti bc súng ny Nng dung dch c tớnh theo cụng thc: Cx = Ax E1% 1cm Mun ỏp dng k thut ny mỏy quang ph phi c chun húa v bc súng v giỏ tr mt quang, dung dch phi trong sut v cú nng nm trong vựng ỏp ng ca nh lut Lambert Beer o so sỏnh vi dung dch chun Xỏc nh mt quang ca dung dch th cú nng Cx (cha bit) c tin hnh ng thi vi vic xỏc nh mt quang ca dung dch chun... thut ion húa ESI hay APCI) Do cỏc saponin ớt cú cỏc ni ụi, nht l ni ụi liờn hp nờn ch hp th t ngoi vựng súng ngn 195-210 nm, do ú vic s dng detector UV tng i hn ch trong phõn tớch saponin 1.4 TNG QUAN V QUANG PH T NGOI-KH KIN (UV VIS) 1.4.1 Ph hp th UV-VIS [1] Khi tia bc x tng tỏc vi vt cht cú th xy ra mt s quỏ trỡnh: phn x, tỏn x, hp th, hunh quang v quang húa Khi o quang ph t ngoi kh kin, ngi ta mong... dung dch 10 cha 2g cholesterol trong 200ml ethanol ó un núng, ta phc s to thnh Lc ta, sy khụ, phỏ phc bng cỏch ho tan trong pyridin Saponin tinh khit c ta trong ether Ho tan trong methanol loi ht cholesterol ri li ta vi ether 1.3.3 nh lng [15] Phng phỏp cõn Bt dc liu c chit vi ether du ha loi cht bộo, sau ú chit saponin bng MeOH:H2O = 4:1 Loi MeOH di ỏp sut gim Hũa cn trong nc cú dung dch 10% ri . sau: 1. Xây dựng quy trình chiết xuất và tinh chế saponin toàn phần từ dược liệu Giảo cổ lam. 2. Xây dựng phương pháp định lượng saponin toàn phần trong Giảo cổ lam bằng phương pháp đo quang. . giá phương pháp. 41 3.5. ỨNG DỤNG PHƯƠNG PHÁP VỪA XÂY DỰNG VÀO ĐỊNH LƯỢNG MỘT SỐ MẪU GIẢO CỔ LAM 42 3.5.1. Quy trình định lượng 42 3.5.2. Xây dựng công thức tính hàm lượng saponin toàn phần. Dược liệu HÀ NỘI – 2013 LỜI CẢM ƠN Khóa luận Xây dựng phương pháp định lượng saponin toàn phần trong Giảo cổ lam bằng phương pháp đo quang được tôi hoàn thành tại bộ môn Dược liệu, trường