Xây dựng quy trình định lượng các acid amin không thay thế trong nước mắm bằng phương pháp sắc ký lỏng ghép khối phổ hai lần (lc

TR I H C QU C GIA TP HCM NG I H C BÁCH KHOA TR N I NGH A XÂY D NG QUY TRÌNH NH L NG CÁC ACID AMIN KHÔNG THAY TH TRONG N CM M B NG PH NG PHÁP S C KÝ L NG GHÉP KH I PH HAI L N (LC/MS/MS) Chuyên ngành : Công ngh th c ph m Mã ngành : 605402 LU N V N TH C S TP H CHÍ MINH, tháng 08 n m 2011 u ng CƠNG TRÌNH C HỒN THÀNH T I TR NG I H C BÁCH KHOA – HQG -HCM Cán b h ng d n khoa h c: PGS.TS Võ Th B ch Hu Ch ký: Cán b ch m nh n xét 1: PGS.TS Ngô M nh Th ng Ch ký: Cán b ch m nh n xét 2: TS Phan Ng c Hòa Ch ký: Lu n v n th c s c b o v t i Tr ng i h c Bách Khoa, HQG Tp HCM ngày 09 tháng 08 n m 2011 Thành ph n H i PGS.TS ng ánh giá lu n v n th c s g m: ng Th Anh (Ch t ch h i ng) PGS.TS Ngô M nh Th ng ( y viên) TS Phan Ng c Hòa ( y Viên) PGS.TS Võ Th B ch Hu ( y viên) TS Ngô Thanh An (Th ký) Xác nh n c a Ch t ch H i ng ánh giá LV Tr chuyên ngành sau lu n v n ã CH T CH H I NG ng Khoa qu n lý c s a ch a (n u có) TR NG KHOA………… C NG HÒA XÃ H I CH NGH A VI T NAM c l p - T - H nh phúc I H C QU C GIA TP.HCM NG I H C BÁCH KHOA TR NHI M V LU N V N TH C S H tên h c viên: TR N I NGH A MSHV: 10110189 Ngày, tháng, n m sinh: 30/11/1985 N i sinh: Tp H Chí Minh Chun ngành: Cơng ngh th c ph m u ng Mã s : TÀI: Xây d ng quy trình nh l ng acid amin khơng thay th TÊN n c m m b ng ph ng pháp s c ký l ng ghép kh i ph! hai l"n (LC/MS/MS) I NHI M V VÀ N I DUNG: - Kh o sát quy trình tách chi t acid amin không thay th n m m - Kh o sát i u ki n phân tách b ng s c ký l ng - Kh o sát thông s - Xây d ng quy trình ng d ng quy trình nh l c u dò kh i ph hai l n ng t thông s kh o sát c xây d ng m u n c m m Nam Ng II NGÀY GIAO NHI M V : 02/ 2011 III NGÀY HOÀN THÀNH NHI M V : 07/2011 CÁN B H #NG D$N : PGS.TS Võ Th B ch Hu Tp HCM, ngày tháng n m 20 CÁN B H #NG D$N (H tên ch ký) CH NHI M B MÔN ÀO T O (H tên ch ký) TR %NG KHOA….……… (H tên ch ký) L I CAM OAN Tôi xin cam oan lu n v n k t qu nghiên c u c a riêng tôi, không chép c a N i dung lu n v n có tham kh o s d ng tài li u, thông tin c ng t i tác ph m, t p chí trang web theo danh m c tài li u c a lu n v n Tác gi lu n v n Tr n i Ngh a L IC M N Em xin chân thành c m n cô Võ Th B ch Hu truy n ã t n tình h ng d n t nh ng ki n th c kinh nghi m quý báu cho em su t th i gian em th c hi n lu n v n Em xin bày t lòng bi t n n v lãnh o anh ch tai Vi n V Sinh Y T Công C ng Tp H Chí Minh ã giúp ng nghi p t o m i i u ki n thu n l i cho em trình th c hi n lu n v n Cu i cùng, em c ng xin chân thành cám n th y cô, b n bè b môn Công ngh th c ph m khoa Cơng ngh hóa h c c a tr Tp.H Chí Minh ã giúp h c t p t i tr ng , ng i h c Bách Khoa ng vi n, t o i u ki n cho su t th i gian TÓM T T LU N V N Hi n nay, vi c nh l ng acid amin b ng ph kh i ph hai l n (LC/MS/MS) ang u i m nh y cao, ng pháp s c ký l ng ghép c nghiên c u ng d ng nhi u có l p l i t t, phân tích c nhi u n n m u, acid amin không c n ph i t o d n xu t nên th i gian phân tích c ng c rút ng n Nghiên c u kh o sát quy trình làm s ch, tách chi t acid amin không thay th n n m u n c m m k t h p v i kh o sát i u ki n s c ký tách acid amin c t phân tách cu i kh o sát thông s c a máy kh i ph nh l ng Các thơng s thích h p cm m phân tích nh sau: - M un c làm s ch b ng methanol, b t C18, than ho t tính - Vi c phân tách acid amin c t s c ký Primesep 100 theo c ch : lo i tr ion trao T Acetonitrile – n Acetonitrile – n i ion v i ch c th c hi n ng trình gradient n ng c c t (30:70) b sung TFA 0,05% (pha c c t (30:70) b sung TFA 0,3% (pha : ng A) n ng B) th i gian 30 phút - Vi c nh l ng acid amin c th c hi n b ng (MS/MS) AB Sciex Triple Quad 5500 ch u dò kh i ph l n Multiple reaction monitoring (MRM) – Electrospray ionization (ESI) positive (+) Khi ti n hành th m nh quy trình nh l ng acid amin, k t qu thu c nh sau: Kho ng n tính: 0,5 cho n 250 µmol/L Gi i h n phát hi n t 0,0167 - 0,03 µmol/g, gi i h n nh l ng t 0,05 n 0,1 µmol/g ! xác Hi u su t thu h i ! không úng d i 20% u 85% ngo i tr Lysine 80% m b o o t – 13 % ngo i tr Lysine 20% Lu"n v#n ã xây d ng th m acid amin không thay th n kh i ph hai l n nh ngh c m m b ng ph c m t quy trình nh l ng ng pháp s c ký l ng ghép ABSTRACT OF THESIS Nowadays, amino acids quantification performed by liquid chromatography – tandem mass spectrometry (LC/MS/MS) has widely been used because of many advantages: low limit of detection, good repeatability, analysing many kinds of matrices, reducing analysis time when performing without amino acids derivatization This research focused on the purification and extraction of essential amino acids from fish sauce, the separation on chromatography column and the quantification on tandem mass spectrometry The suitable technological parameters of the amino acids quantification were as follows: The amino acids from fish sauce were extracted and purified by methanol, C18 powder and activated carbon Separation was achieved on Primesep 100 column using mechanisms: ion – exclusion and ion – exchange with the concentration gradients program: From trifluoroacetic acid 0,05% in acetonitrile – water (30:70) (mobile phase A) to trifluoroacetic acid 0,3% in acetonitrile – water (30:70) (mobile phase B) in 30 minutes Quantification was acquired by tandem mass spectrometry (MS/MS) AB Sciex Triple Quad 5500 using electrospray ionization (ESI) in the MRM scan type, positive mode After performed method validation, the results were presented as follows: Calibration curves were linear over the range 0,5 – 250 µmol/L Limit of detections of each amino acids were 0,0167 - 0,03 µmol/g, limit of quantifications of each amino acid were 0,05 - 0,1 µmol/g Relative standard deviations of repeatability and accuracy were below 20% Recoveries of almost amino acids were above 85% (except 80% for Lysine) Uncertainties of almost amino acids were – 13% (except 20% for Lysine) The thesis accomplished a method validation and proposed a quantification method for essential amino acids from fish sauce performed by liquid chromatography - tandem mass spectrometry Các thu t ng ch vi t t t - A (Accuracy): úng - CE (Collision Energy): N ng l - CV (Coefficient of Variation): H s bi n - DP (Declusion potential): Th t o ion - ESI (Electrospray ionization): S ion hóa b ng - ILOD ( Instrument limit of detection): Gi i h n phát hi n c a thi t b - ILOQ ( Instrument limit of quantification): Gi i h n - LC/MS/MS (Liquid chromatography with tandem mass spectrometry): ph ng phân m nh ion ng u phun electron nh l ng c a thi t b ng pháp s c ký l ng ghép kh i ph l n - MLOD (Method limit of detection): Gi i h n phát hi n c a ph - MLOQ (Method limit of quantification): Gi i h n - MRM (multiple reaction monitoring): M t ch nh l ng pháp ng c a ph ch y nh l ng pháp ng c a máy kh i ph l n - r (Repeatability): l pl i - Rw (within – laboratory Reproducibility): - R (Reproducibility): - RSD (Relative Standard deviation): - SCX (Strong cation exchange): k thu t trao - SD (Standard deviation): - SPE (Solid phase extraction): k thu t tách chi t pha r n - TFA: Trifluoroacetic acid - U (Uncertainty): - Ubias ( Bias Uncertainty): - URw (Within – laboratory Uncertainty): tái l p n i b phịng thí nghi m tái l p không l ch chu n t ng i ion d i ng m nh l ch chu n mb o o không m b o o theo không l ch (hi u su t thu h i) m b o o theo n i b phòng thí nghi m - WCX (Weak cation exchange): k thu t trao i ion d ng y u tái l p LU N V N TH C S M cl c Ph n m u T ng quan 2.1 T ng quan v n c m m .7 2.1.1 Gi i thi u v n c m m 2.1.2 Thành ph n c a n c m m .7 2.1.3 Các h enzym s n xu t n c m m .8 2.1.4 Quy trình s n xu t n c m m 2.1.5 Các y u t nh h ng n trình ch bi n n c m m 2.1.5.1 nh h ng c a nhi t 2.1.5.2 nh h ng c a mu i 2.1.5.3 nh h ng c a nguyên li u 10 2.1.5.4 nh h ng c a di n tích ti p xúc 10 2.1.5.5 nh h ng c a ph ng pháp p mu i 11 2.1.6 Tiêu chu n ánh giá ch t l ng n c m m 11 2.2 T ng quan v acid amin .12 2.2.1 Gi i thi u chung v acid amin 12 2.2.2 Phân lo i acid amin 12 2.2.3 Các tính ch t chung c a acid amin 16 2.2.3.1 Tính tan 16 2.2.3.2 Tính phân c c 16 2.2.3.3 Tính quang ho t .17 2.2.3.3 Vai trò c a acid amin .17 2.3 T ng quan v ph ng pháp phân tích acid amin 17 2.3.1 Ph ng pháp s c ký gi y .17 2.3.2 Ph ng pháp s c ký b n m ng .18 2.3.3 Ph ng pháp s c ký khí (GC) 18 2.3.4 Ph ng pháp s c ký l ng hi u n ng cao (HPLC) 18 M c tiêu nghiên c u 20 Nguyên li u ph ng pháp nghiên c u 21 4.1 Nguyên li u .21 4.1.1 Ch t chu n 21 4.1.2 i t ng nghiên c u 21 4.2 D ng c , trang thi t b , hóa ch t 22 4.2.1 D ng c 22 4.2.2 Trang thi t b 23 4.2.3 Hóa ch t .24 4.3 N i dung nghiên c u 25 4.3.1 Kh o sát thông s kh i ph .27 4.3.1.1 Các thông s c nh 27 4.3.1.2 Các thông s kh o sát 28 4.3.1.3 Cách th c th c hi n 28 Ng i th c hi n: TR N I NGH A PL - 32 LU N V N TH C S Hình 9.92: Giá tr S/N c a m u Arginine n ng µmol/L l n B ng 9.1 : S li u phân tích máy LC/MS/MS c a Threonine ngày phân tích th nh t Threonine Di n tích peak Chu n 0,5 µM 1,54E+04 Chu n µM 3,03E+04 Chu n 2,5 µM 7,07E+04 Chu n 10 µM 2,77E+05 Chu n 25 µM 6,54E+05 Chu n 50 µM 1,30E+06 Chu n 100 µM 2,59E+06 Chu n 250 µM 6,32E+06 N ng tính tốn (µmol/L) Kh i l ng(g) M un cm ml n1 2,82E+06 111 0,4912 M un cm ml n2 2,76E+06 108 0,4878 M un cm ml n3 2,76E+06 108 0,5016 M un c m m spike µmol/g lan 4,16E+06 164 0,5146 M un c m m spike µmol/g lan 4,17E+06 164 0,5131 M un c m m spike µmol/g lan 4,06E+06 160 0,5177 M un c m m spike µmol/g lan 4,07E+06 160 0,5003 M un c m m spike µmol/g lan 4,05E+06 159 0,5046 M un c m m spike µmol/g lan 3,95E+06 155 0,5102 Ng i th c hi n: TR N I NGH A PL - 33 LU N V N TH C S B ng 9.2 : S li u phân tích máy LC/MS/MS c a Valine ngày phân tích th nh t Valine Di n tích peak Chu n 0,5 µM 5,91E+04 Chu n µM 1,30E+05 Chu n 2,5 µM 2,76E+05 Chu n 10 µM 1,05E+06 Chu n 25 µM 2,54E+06 Chu n 50 µM 5,02E+06 Chu n 100 µM 1,01E+07 Chu n 250 µM 2,41E+07 N ng tính tốn (µmol/L) Kh i l ng(g) M un cm ml n1 1,28E+07 131 0,4912 M un cm ml n2 1,28E+07 131 0,4878 M un cm ml n3 1,28E+07 131 0,5016 M un c m m spike µmol/g lan 1,79E+07 184 0,5146 M un c m m spike µmol/g lan 1,77E+07 182 0,5131 M un c m m spike µmol/g lan 1,74E+07 179 0,5177 M un c m m spike µmol/g lan 1,74E+07 179 0,5003 M un c m m spike µmol/g lan 1,76E+07 181 0,5046 M un c m m spike µmol/g lan 1,69E+07 174 0,5102 B ng 9.3 : S li u phân tích máy LC/MS/MS c a Methionine ngày phân tích th nh t Ng Methionine Di n tích peak Chu n 0,5 µM 2,19E+04 Chu n µM 4,48E+04 Chu n 2,5 µM 9,95E+04 Chu n 10 µM 3,88E+05 Chu n 25 µM 9,21E+05 Chu n 50 µM 1,87E+06 Chu n 100 µM 3,75E+06 Chu n 250 µM 9,03E+06 N ng tính tốn (µmol/L) Kh i l ng(g) M un cm ml n1 1,37E+06 36,9 0,4912 M un cm ml n2 1,33E+06 35,8 0,4878 i th c hi n: TR N I NGH A PL - 34 M un LU N V N TH C S cm ml n3 1,34E+06 36,1 0,5016 M un c m m spike µmol/g lan 3,12E+06 85,5 0,5146 M un c m m spike µmol/g lan 3,04E+06 83,2 0,5131 M un c m m spike µmol/g lan 3,00E+06 82 0,5177 M un c m m spike µmol/g lan 2,95E+06 80,8 0,5003 M un c m m spike µmol/g lan 2,94E+06 80,4 0,5046 M un c m m spike µmol/g lan 2,86E+06 78,2 0,5102 B ng 9.4 : S li u phân tích máy LC/MS/MS c a Leucine ngày phân tích th nh t Leucine Di n tích peak Chu n 0,5 µM 8,65E+04 Chu n µM 1,86E+05 Chu n 2,5 µM 3,82E+05 Chu n 10 µM 1,45E+06 Chu n 25 µM 3,38E+06 Chu n 50 µM 6,89E+06 Chu n 100 µM 1,32E+07 Chu n 250 µM 3,17E+07 N ng tính tốn (µmol/L) Kh i l ng(g) M un cm ml n1 8,72E+06 67,2 0,4912 M un cm ml n2 8,51E+06 65,5 0,4878 M un cm ml n3 8,26E+06 63,5 0,5016 M un c m m spike µmol/g lan 1,46E+07 113 0,5146 M un c m m spike µmol/g lan 1,43E+07 111 0,5131 M un c m m spike µmol/g lan 1,44E+07 112 0,5177 M un c m m spike µmol/g lan 1,41E+07 110 0,5003 M un c m m spike µmol/g lan 1,43E+07 111 0,5046 M un c m m spike µmol/g lan 1,40E+07 109 0,5102 Ng i th c hi n: TR N I NGH A PL - 35 LU N V N TH C S B ng 9.5 : S li u phân tích máy LC/MS/MS c a Isoleucine ngày phân tích th nh t Isoleucine Di n tích peak Chu n 0,5 µM 8,26E+04 Chu n µM 1,76E+05 Chu n 2,5 µM 3,71E+05 Chu n 10 µM 1,42E+06 Chu n 25 µM 3,38E+06 Chu n 50 µM 6,57E+06 Chu n 100 µM 1,28E+07 Chu n 250 µM 3,14E+07 N ng tính tốn (µmol/L) Kh i l ng(g) M un cm ml n1 9,94E+06 78,1 0,4912 M un cm ml n2 8,51E+06 66,7 0,4878 M un cm ml n3 9,40E+06 73,8 0,5016 M un c m m spike µmol/g lan 1,60E+07 127 0,5146 M un c m m spike µmol/g lan 1,58E+07 125 0,5131 M un c m m spike µmol/g lan 1,55E+07 122 0,5177 M un c m m spike µmol/g lan 1,52E+07 120 0,5003 M un c m m spike µmol/g lan 1,50E+07 118 0,5046 M un c m m spike µmol/g lan 1,50E+07 119 0,5102 B ng 9.6 : S li u phân tích máy LC/MS/MS c a Phenylalanine ngày phân tích th nh t Ng Phenylalanine Di n tích peak Chu n 0,5 µM 1,13E+05 Chu n µM 2,39E+05 Chu n 2,5 µM 5,08E+05 Chu n 10 µM 1,95E+06 Chu n 25 µM 4,73E+06 Chu n 50 µM 9,32E+06 Chu n 100 µM 1,80E+07 Chu n 250 µM 4,17E+07 N ng tính tốn (µmol/L) Kh i l ng(g) M un cm ml n1 9,58E+06 54,9 0,4912 M un cm ml n2 9,57E+06 54,8 0,4878 M un cm ml n3 9,56E+06 54,8 0,5016 i th c hi n: TR N I NGH A PL - 36 LU N V N TH C S M un c m m spike µmol/g lan 1,84E+07 108 0,5146 M un c m m spike µmol/g lan 1,82E+07 106 0,5131 M un c m m spike µmol/g lan 1,81E+07 106 0,5177 M un c m m spike µmol/g lan 1,76E+07 103 0,5003 M un c m m spike µmol/g lan 1,73E+07 101 0,5046 M un c m m spike µmol/g lan 1,75E+07 102 0,5102 B ng 9.7 : S li u phân tích máy LC/MS/MS c a Histidine ngày phân tích th nh t Histidine Di n tích peak Chu n 0,5 µM 3.77E+04 Chu n µM 1.10E+05 Chu n 2,5 µM 3.24E+05 Chu n 10 µM 1.19E+06 Chu n 25 µM 3.30E+06 Chu n 50 µM 6.50E+06 Chu n 100 µM 1.26E+07 Chu n 250 µM 3.05E+07 N ng tính tốn (µmol/L) Kh i l ng(g) M un cm ml n1 7.07E+06 56.9 0.4912 M un cm ml n2 7.16E+06 57.7 0.4878 M un cm ml n3 7.00E+06 56.3 0.5016 M un c m m spike µmol/g lan 1.31E+07 106 0.5146 M un c m m spike µmol/g lan 1.31E+07 106 0.5131 M un c m m spike µmol/g lan 1.30E+07 106 0.5177 M un c m m spike µmol/g lan 1.25E+07 101 0.5003 M un c m m spike µmol/g lan 1.27E+07 103 0.5046 M un c m m spike µmol/g lan 1.26E+07 102 0.5102 Ng i th c hi n: TR N I NGH A PL - 37 LU N V N TH C S B ng 9.8 : S li u phân tích máy LC/MS/MS c a Lysine ngày phân tích th nh t Lysine Di n tích peak Chu n 0,5 µM 2,78E+04 Chu n µM 5,35E+04 Chu n 2,5 µM 1,58E+05 Chu n 10 µM 5,51E+05 Chu n 25 µM 1,49E+06 Chu n 50 µM 2,87E+06 Chu n 100 µM 5,68E+06 Chu n 250 µM 1,42E+07 N ng tính tốn (µmol/L) Kh i l ng(g) M un cm ml n1 1,09E+07 192 0,4912 M un cm ml n2 1,11E+07 195 0,4878 M un cm ml n3 1,09E+07 191 0,5016 M un c m m spike µmol/g lan 1,41E+07 248 0,5146 M un c m m spike µmol/g lan 1,39E+07 245 0,5131 M un c m m spike µmol/g lan 1,42E+07 250 0,5177 M un c m m spike µmol/g lan 1,36E+07 238 0,5003 M un c m m spike µmol/g lan 1,35E+07 237 0,5046 M un c m m spike µmol/g lan 1,38E+07 242 0,5102 B ng 9.9 : S li u phân tích máy LC/MS/MS c a Arginine ngày phân tích th nh t M un Ng Arginine Di n tích peak Chu n 0,5 µM 8,92E+04 Chu n µM 1,38E+05 Chu n 2,5 µM 3,31E+05 Chu n 10 µM 1,21E+06 Chu n 25 µM 2,94E+06 Chu n 50 µM 5,64E+06 Chu n 100 µM 1,14E+07 Chu n 250 µM 2,63E+07 N ng tính tốn (µmol/L) Kh i l ng(g) M un cm ml n1 2,61E+05 0,38 0,4912 M un cm ml n2 2,65E+05 0,412 0,4878 M un cm ml n3 2,64E+05 0,408 0,5016 c m m spike µmol/g lan 5,29E+06 48,1 0,5146 i th c hi n: TR N I NGH A PL - 38 LU N V N TH C S M un c m m spike µmol/g lan 5,24E+06 47,6 0,5131 M un c m m spike µmol/g lan 5,18E+06 47,1 0,5177 M un c m m spike µmol/g lan 5,00E+06 45,4 0,5003 M un c m m spike µmol/g lan 5,03E+06 45,6 0,5046 M un c m m spike µmol/g lan 5,14E+06 46,7 0,5102 B ng 9.10 : S li u phân tích máy LC/MS/MS c a Threonine ngày phân tích th hai Threonine Di n tích peak Chu n 0,5 µM 1,44E+04 Chu n µM 2,66E+04 Chu n 2,5 µM 6,23E+04 Chu n 10 µM 2,53E+05 Chu n 25 µM 5,99E+05 Chu n 50 µM 1,23E+06 Chu n 100 µM 2,33E+06 Chu n 250 µM 6,00E+06 N ng tính tốn (µmol/L) Kh i l ng(g) M un cm ml n4 3,05E+06 128 0,5231 M un cm ml n5 3,17E+06 133 0,5178 M un cm ml n6 3,21E+06 134 0,5222 M un c m m spike 2,5 µmol/g lan 3,46E+06 145 0,4872 M un c m m spike 2,5 µmol/g lan 3,45E+06 144 0,4771 M un c m m spike 2,5 µmol/g lan 3,44E+06 144 0,4765 M un c m m spike 2,5 µmol/g lan 3,42E+06 143 0,478 M un c m m spike 2,5 µmol/g lan 3,42E+06 143 0,4759 M un c m m spike 2,5 µmol/g lan 3,44E+06 144 0,4789 M un c m m spike µmol/g lan 3,90E+06 163 0,4723 M un c m m spike µmol/g lan 3,83E+06 160 0,4765 M un c m m spike µmol/g lan 3,87E+06 162 0,481 M un c m m spike µmol/g lan 10 3,81E+06 159 0,4776 M un c m m spike µmol/g lan 11 3,96E+06 165 0,4764 M un c m m spike µmol/g lan 12 3,87E+06 162 0,4792 M un c m m spike 10 µmol/g lan 4,80E+06 201 0,4744 M un c m m spike 10 µmol/g lan 4,78E+06 200 0,4731 M un c m m spike 10 µmol/g lan 4,72E+06 198 0,4689 M un c m m spike 10 µmol/g lan 4,74E+06 198 0,4567 M un c m m spike 10 µmol/g lan 4,66E+06 195 0,4465 M un c m m spike 10 µmol/g lan 4,73E+06 198 0,4689 Ng i th c hi n: TR N I NGH A PL - 39 LU N V N TH C S B ng 9.11: S li u phân tích máy LC/MS/MS c a Valine ngày phân tích th hai Valine Di n tích peak Chu n 0,5 µM 8,46E+04 Chu n µM 1,24E+05 Chu n 2,5 µM 2,57E+05 Chu n 10 µM 9,69E+05 Chu n 25 µM 2,30E+06 Chu n 50 µM 4,70E+06 Chu n 100 µM 8,66E+06 Chu n 250 µM 2,17E+07 N ng tính tốn (µmol/L) Kh i l ng(g) M un cm ml n4 1,40E+07 161 0,5231 M un cm ml n5 1,42E+07 163 0,5178 M un cm ml n6 1,44E+07 166 0,5222 M un c m m spike 2,5 µmol/g lan 1,52E+07 175 0,4872 M un c m m spike 2,5 µmol/g lan 1,50E+07 172 0,4771 M un c m m spike 2,5 µmol/g lan 1,50E+07 173 0,4765 M un c m m spike 2,5 µmol/g lan 1,50E+07 173 0,478 M un c m m spike 2,5 µmol/g lan 1,49E+07 172 0,4759 M un c m m spike 2,5 µmol/g lan 1,50E+07 173 0,4789 M un c m m spike µmol/g lan 1,67E+07 192 0,4723 M un c m m spike µmol/g lan 1,69E+07 195 0,4765 M un c m m spike µmol/g lan 1,67E+07 192 0,481 M un c m m spike µmol/g lan 10 1,67E+07 192 0,4776 M un c m m spike µmol/g lan 11 1,67E+07 192 0,4764 M un c m m spike µmol/g lan 12 1,66E+07 192 0,4792 M un c m m spike 10 µmol/g lan 1,95E+07 225 0,4744 M un c m m spike 10 µmol/g lan 1,96E+07 226 0,4731 M un c m m spike 10 µmol/g lan 1,95E+07 225 0,4689 M un c m m spike 10 µmol/g lan 1,96E+07 226 0,4567 M un c m m spike 10 µmol/g lan 1,92E+07 221 0,4465 M un c m m spike 10 µmol/g lan 1,98E+07 228 0,4689 Ng i th c hi n: TR N I NGH A PL - 40 LU N V N TH C S B ng 9.12 : S li u phân tích máy LC/MS/MS c a Methionine ngày phân tích th hai Methionine Di n tích peak Chu n 0,5 µM 1,81E+04 Chu n µM 3,47E+04 Chu n 2,5 µM 8,77E+04 Chu n 10 µM 3,48E+05 Chu n 25 µM 8,55E+05 Chu n 50 µM 1,76E+06 Chu n 100 µM 3,19E+06 Chu n 250 µM 8,26E+06 N ng tính tốn (µmol/L) Kh i l ng(g) M un cm ml n4 1,43E+06 42,9 0,5231 M un cm ml n5 1,42E+06 42,8 0,5178 M un cm ml n6 1,47E+06 44,1 0,5222 M un c m m spike 2,5 µmol/g lan 2,01E+06 60,8 0,4872 M un c m m spike 2,5 µmol/g lan 2,04E+06 61,5 0,4771 M un c m m spike 2,5 µmol/g lan 2,03E+06 61,3 0,4765 M un c m m spike 2,5 µmol/g lan 2,05E+06 61,9 0,478 M un c m m spike 2,5 µmol/g lan 2,00E+06 60,4 0,4759 M un c m m spike 2,5 µmol/g lan 2,05E+06 61,8 0,4789 M un c m m spike µmol/g lan 2,70E+06 81,7 0,4723 M un c m m spike µmol/g lan 2,71E+06 81,8 0,4765 M un c m m spike µmol/g lan 2,72E+06 82,1 0,481 M un c m m spike µmol/g lan 10 2,76E+06 83,5 0,4776 M un c m m spike µmol/g lan 11 2,72E+06 82,1 0,4764 M un c m m spike µmol/g lan 12 2,70E+06 81,6 0,4792 M un c m m spike 10 µmol/g lan 4,02E+06 122 0,4744 M un c m m spike 10 µmol/g lan 4,00E+06 121 0,4731 M un c m m spike 10 µmol/g lan 3,92E+06 119 0,4689 M un c m m spike 10 µmol/g lan 3,87E+06 117 0,4567 M un c m m spike 10 µmol/g lan 3,92E+06 119 0,4465 M un c m m spike 10 µmol/g lan 4,10E+06 124 0,4689 Ng i th c hi n: TR N I NGH A PL - 41 LU N V N TH C S B ng 9.13 : S li u phân tích máy LC/MS/MS c a Leucine ngày phân tích th hai Leucine Di n tích peak Chu n 0,5 µM 8,59E+04 Chu n µM 1,38E+05 Chu n 2,5 µM 3,47E+05 Chu n 10 µM 1,35E+06 Chu n 25 µM 3,00E+06 Chu n 50 µM 6,25E+06 Chu n 100 µM 1,17E+07 Chu n 250 µM 2,84E+07 N ng tính tốn (µmol/L) Kh i l ng(g) M un cm ml n4 8,70E+06 75 0,5231 M un cm ml n5 8,99E+06 77,6 0,5178 M un cm ml n6 9,24E+06 79,7 0,5222 M un c m m spike 2,5 µmol/g lan 1,09E+07 94,1 0,4872 M un c m m spike 2,5 µmol/g lan 1,08E+07 93,2 0,4771 M un c m m spike 2,5 µmol/g lan 1,08E+07 93,6 0,4765 M un c m m spike 2,5 µmol/g lan 1,08E+07 93,6 0,478 M un c m m spike 2,5 µmol/g lan 1,07E+07 92,8 0,4759 M un c m m spike 2,5 µmol/g lan 1,07E+07 92,8 0,4789 M un c m m spike µmol/g lan 1,32E+07 114 0,4723 M un c m m spike µmol/g lan 1,32E+07 115 0,4765 M un c m m spike µmol/g lan 1,31E+07 113 0,481 M un c m m spike µmol/g lan 10 1,33E+07 116 0,4776 M un c m m spike µmol/g lan 11 1,33E+07 115 0,4764 M un c m m spike µmol/g lan 12 1,30E+07 113 0,4792 M un c m m spike 10 µmol/g lan 1,75E+07 153 0,4744 M un c m m spike 10 µmol/g lan 1,75E+07 152 0,4731 M un c m m spike 10 µmol/g lan 1,77E+07 154 0,4689 M un c m m spike 10 µmol/g lan 1,73E+07 151 0,4567 M un c m m spike 10 µmol/g lan 1,72E+07 150 0,4465 M un c m m spike 10 µmol/g lan 1,81E+07 158 0,4689 Ng i th c hi n: TR N I NGH A PL - 42 LU N V N TH C S B ng 9.14 : S li u phân tích máy LC/MS/MS c a Isoleucine ngày phân tích th hai Isoleucine Di n tích peak Chu n 0,5 µM 8,85E+04 Chu n µM 1,44E+05 Chu n 2,5 µM 3,27E+05 Chu n 10 µM 1,26E+06 Chu n 25 µM 2,95E+06 Chu n 50 µM 5,97E+06 Chu n 100 µM 1,16E+07 Chu n 250 µM 2,78E+07 N ng tính tốn (µmol/L) Kh i l ng(g) M un cm ml n4 1,01E+07 89,8 0,5231 M un cm ml n5 9,82E+06 86,9 0,5178 M un cm ml n6 1,06E+07 94,3 0,5222 M un c m m spike 2,5 µmol/g lan 1,20E+07 107 0,4872 M un c m m spike 2,5 µmol/g lan 1,18E+07 105 0,4771 M un c m m spike 2,5 µmol/g lan 1,18E+07 105 0,4765 M un c m m spike 2,5 µmol/g lan 1,18E+07 105 0,478 M un c m m spike 2,5 µmol/g lan 1,18E+07 105 0,4759 M un c m m spike 2,5 µmol/g lan 1,20E+07 106 0,4789 M un c m m spike µmol/g lan 1,39E+07 124 0,4723 M un c m m spike µmol/g lan 1,42E+07 126 0,4765 M un c m m spike µmol/g lan 1,41E+07 126 0,481 M un c m m spike µmol/g lan 10 1,44E+07 128 0,4776 M un c m m spike µmol/g lan 11 1,44E+07 128 0,4764 M un c m m spike µmol/g lan 12 1,43E+07 127 0,4792 M un c m m spike 10 µmol/g lan 1,82E+07 162 0,4744 M un c m m spike 10 µmol/g lan 1,84E+07 164 0,4731 M un c m m spike 10 µmol/g lan 1,82E+07 162 0,4689 M un c m m spike 10 µmol/g lan 1,82E+07 162 0,4567 M un c m m spike 10 µmol/g lan 1,78E+07 159 0,4465 M un c m m spike 10 µmol/g lan 1,87E+07 167 0,4689 Ng i th c hi n: TR N I NGH A PL - 43 LU N V N TH C S B ng 9.15 : S li u phân tích máy LC/MS/MS c a Phenylalanine ngày phân tích th hai Phenylalanine Di n tích peak Chu n 0,5 µM 9,64E+04 Chu n µM 1,80E+05 Chu n 2,5 µM 4,26E+05 Chu n 10 µM 1,73E+06 Chu n 25 µM 3,99E+06 Chu n 50 µM 8,13E+06 Chu n 100 µM 1,55E+07 Chu n 250 µM 3,67E+07 N ng tính tốn (µmol/L) Kh i l ng(g) M un cm ml n4 9,74E+06 65,9 0,5231 M un cm ml n5 1,00E+07 66,2 0,5178 M un cm ml n6 1,00E+07 67,3 0,5222 M un c m m spike 2,5 µmol/g lan 1,26E+07 83,9 0,4872 M un c m m spike 2,5 µmol/g lan 1,26E+07 83,8 0,4771 M un c m m spike 2,5 µmol/g lan 1,26E+07 83,6 0,4765 M un c m m spike 2,5 µmol/g lan 1,27E+07 84,6 0,478 M un c m m spike 2,5 µmol/g lan 1,27E+07 84,3 0,4759 M un c m m spike 2,5 µmol/g lan 1,26E+07 83,9 0,4789 M un c m m spike µmol/g lan 1,55E+07 104 0,4723 M un c m m spike µmol/g lan 1,57E+07 105 0,4765 M un c m m spike µmol/g lan 1,59E+07 106 0,481 M un c m m spike µmol/g lan 10 1,59E+07 106 0,4776 M un c m m spike µmol/g lan 11 1,59E+07 106 0,4764 M un c m m spike µmol/g lan 12 1,57E+07 105 0,4792 M un c m m spike 10 µmol/g lan 2,16E+07 145 0,4744 M un c m m spike 10 µmol/g lan 2,18E+07 146 0,4731 M un c m m spike 10 µmol/g lan 2,20E+07 148 0,4689 M un c m m spike 10 µmol/g lan 2,13E+07 143 0,4567 M un c m m spike 10 µmol/g lan 2,16E+07 145 0,4465 M un c m m spike 10 µmol/g lan 2,23E+07 150 0,4689 Ng i th c hi n: TR N I NGH A PL - 44 LU N V N TH C S B ng 9.16 : S li u phân tích máy LC/MS/MS c a Histidine ngày phân tích th hai Histidine Di n tích peak Chu n 0,5 µM 3,09E+04 Chu n µM 8,60E+04 Chu n 2,5 µM 2,50E+05 Chu n 10 µM 9,62E+05 Chu n 25 µM 2,73E+06 Chu n 50 µM 5,30E+06 Chu n 100 µM 1,04E+07 Chu n 250 µM 2,45E+07 N ng tính tốn (µmol/L) Kh i l ng(g) M un cm ml n4 6,55E+06 65,3 0,5231 M un cm ml n5 7,01E+06 69,9 0,5178 M un cm ml n6 6,85E+06 68,3 0,5222 M un c m m spike 2,5 µmol/g lan 8,48E+06 84,9 0,4872 M un c m m spike 2,5 µmol/g lan 8,40E+06 84,2 0,4771 M un c m m spike 2,5 µmol/g lan 8,53E+06 85,4 0,4765 M un c m m spike 2,5 µmol/g lan 8,44E+06 84,6 0,478 M un c m m spike 2,5 µmol/g lan 8,64E+06 82,7 0,4759 M un c m m spike 2,5 µmol/g lan 8,12E+06 81,3 0,4789 M un c m m spike µmol/g lan 1,05E+07 105 0,4723 M un c m m spike µmol/g lan 1,08E+07 105 0,4765 M un c m m spike µmol/g lan 1,08E+07 108 0,481 M un c m m spike µmol/g lan 10 1,01E+07 101 0,4776 M un c m m spike µmol/g lan 11 1,07E+07 107 0,4764 M un c m m spike µmol/g lan 12 1,03E+07 103 0,4792 M un c m m spike 10 µmol/g lan 1,44E+07 145 0,4744 M un c m m spike 10 µmol/g lan 1,46E+07 148 0,4731 M un c m m spike 10 µmol/g lan 1,45E+07 147 0,4689 M un c m m spike 10 µmol/g lan 1,46E+07 146 0,4567 M un c m m spike 10 µmol/g lan 1,41E+07 143 0,4465 M un c m m spike 10 µmol/g lan 1,49E+07 150 0,4689 Ng i th c hi n: TR N I NGH A PL - 45 LU N V N TH C S B ng 9.17 : S li u phân tích máy LC/MS/MS c a Lysine ngày phân tích th hai Lysine Di n tích peak Chu n 0,5 µM 1,60E+04 Chu n µM 4,95E+04 Chu n 2,5 µM 1,29E+05 Chu n 10 µM 4,77E+05 Chu n 25 µM 9,83E+05 Chu n 50 µM 2,45E+06 Chu n 100 µM 4,73E+06 Chu n 250 µM 1,15E+07 N ng tính tốn (µmol/L) Kh i l ng(g) M un cm ml n4 1,07E+07 230 0,5231 M un cm ml n5 1,09E+07 236 0,5178 M un cm ml n6 1,07E+07 232 0,5222 M un c m m spike 2,5 µmol/g lan 1,11E+07 239 0,4872 M un c m m spike 2,5 µmol/g lan 1,08E+07 234 0,4771 M un c m m spike 2,5 µmol/g lan 1,07E+07 232 0,4765 M un c m m spike 2,5 µmol/g lan 1,08E+07 234 0,478 M un c m m spike 2,5 µmol/g lan 1,07E+07 232 0,4759 M un c m m spike 2,5 µmol/g lan 1,09E+07 235 0,4789 M un c m m spike µmol/g lan 1,14E+07 247 0,4723 M un c m m spike µmol/g lan 1,15E+07 249 0,4765 M un c m m spike µmol/g lan 1,17E+07 253 0,481 M un c m m spike µmol/g lan 10 1,15E+07 248 0,4776 M un c m m spike µmol/g lan 11 1,17E+07 252 0,4764 M un c m m spike µmol/g lan 12 1,17E+07 254 0,4792 M un c m m spike 10 µmol/g lan 1,31E+07 282 0,4744 M un c m m spike 10 µmol/g lan 1,30E+07 281 0,4731 M un c m m spike 10 µmol/g lan 1,31E+07 283 0,4689 M un c m m spike 10 µmol/g lan 1,26E+07 273 0,4567 M un c m m spike 10 µmol/g lan 1,26E+07 272 0,4465 M un c m m spike 10 µmol/g lan 1,32E+07 284 0,4689 Ng i th c hi n: TR N I NGH A PL - 46 LU N V N TH C S B ng 9.18 : S li u phân tích máy LC/MS/MS c a Arginine ngày phân tích th hai Arginine Di n tích peak Chu n 0,5 µM 6,07E+04 Chu n µM 8,05E+04 Chu n 2,5 µM 2,58E+05 Chu n 10 µM 4,59E+05 Chu n 25 µM 1,50E+06 Chu n 50 µM 4,69E+06 Chu n 100 µM 9,09E+06 Chu n 250 µM 2,15E+07 N ng tính tốn (µmol/L) Kh i l ng(g) M un cm ml n4 2,41E+05 3,62 0,5231 M un cm ml n5 2,28E+05 3,48 0,5178 M un cm ml n6 2,30E+05 3,5 0,5222 M un c m m spike 2,5 µmol/g lan 2,22E+06 26,3 0,4872 M un c m m spike 2,5 µmol/g lan 2,22E+06 26,3 0,4771 M un c m m spike 2,5 µmol/g lan 2,19E+06 25,9 0,4765 M un c m m spike 2,5 µmol/g lan 2,21E+06 26,2 0,478 M un c m m spike 2,5 µmol/g lan 2,14E+06 25,4 0,4759 M un c m m spike 2,5 µmol/g lan 2,17E+06 25,8 0,4789 M un c m m spike µmol/g lan 4,30E+06 47,1 0,4723 M un c m m spike µmol/g lan 4,33E+06 48 0,4765 M un c m m spike µmol/g lan 3,30E+06 47,8 0,481 M un c m m spike µmol/g lan 10 4,16E+06 48,6 0,4776 M un c m m spike µmol/g lan 11 4,38E+06 48,2 0,4764 M un c m m spike µmol/g lan 12 4,18E+06 48,8 0,4792 M un c m m spike 10 µmol/g lan 7,97E+06 92,3 0,4744 M un c m m spike 10 µmol/g lan 8,16E+06 94,4 0,4731 M un c m m spike 10 µmol/g lan 8,05E+06 93,2 0,4689 M un c m m spike 10 µmol/g lan 7,93E+06 91,8 0,4567 M un c m m spike 10 µmol/g lan 8,20E+06 89 0,4465 M un c m m spike 10 µmol/g lan 8,33E+06 91,6 0,4689 Ng i th c hi n: TR N I NGH A ... TÀI: Xây d ng quy trình nh l ng acid amin khơng thay th TÊN n c m m b ng ph ng pháp s c ký l ng ghép kh i ph! hai l"n (LC/ MS/MS) I NHI M V VÀ N I DUNG: - Kh o sát quy trình tách chi t acid amin không. .. 20% Lu"n v#n ã xây d ng th m acid amin không thay th n kh i ph hai l n nh ngh c m m b ng ph c m t quy trình nh l ng ng pháp s c ký l ng ghép ABSTRACT OF THESIS Nowadays, amino acids quantification... hi n Xây d ng m b ng cách c ph ng pháp xác tài nh m: nh acid amin n th* nhóm acid amin khơng thay th - b ng ph cm m-c ng pháp s c ký l ng ghép kh i ph l n (LC/ MS/MS) Làm c s * xác nh ch t l amin