XÂY DỰNG QUY TRÌNH PHÂN TÍCH HÀM LƯỢNG MELAMINE TRÊN SỮA, THỨC ĂN GIA SÚC BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ KHÍ GHÉP KHỐI PHỔ (Gas Chromatography Mass Spectrometry)

Xuất phát từ tình hình trên, được sự cho phép của Bộ môn Công Nghệ Sinh Học – Trường Đại học Nông Lâm Tp.HCM, chúng tôi tiến hành đề tài: “Xây dựng quy trình phân tích hàm lượng melamine

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC

***000***

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

XÂY DỰNG QUY TRÌNH PHÂN TÍCH HÀM LƯỢNG MELAMINE TRÊN SỮA, THỨC ĂN GIA SÚC BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ KHÍ GHÉP KHỐI PHỔ

(Gas Chromatography - Mass Spectrometry)

Ngành học: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Sinh viên thực hiện: PHẠM THỊ THANH VÂN

Niên khóa: 2005 – 2009

Tháng 08/2009

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

XÂY DỰNG QUY TRÌNH PHÂN TÍCH HÀM LƯỢNG MELAMINE TRÊN SỮA, THỨC ĂN GIA SÚC BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ KHÍ GHÉP KHỐI PHỔ (Gas Chromatography - Mass Spectrometry)

ThS PHÙNG VÕ CẨM HỒNG PHẠM THỊ THANH VÂN

KS HUỲNH VĨNH KHANG

Tháng 08/2009

LỜI CẢM ƠN

Xin chân thành cảm ơn

Ban Giám Hiệu trường Đại học Nông Lâm Tp Hồ Chí Minh đã tạo mọi điều kiện cho tôi trong suốt thời gian học tập

Các Thầy Cô trong Bộ môn Công Nghệ Sinh Học cùng các Thầy Cô đã trực tiếp giảng dạy trong suốt bốn năm qua

ThS Phùng Võ Cẩm Hồng và KS Huỳnh Vĩnh Khang đã tận tình hướng dẫn, dìu dắt và động viên em trong thời gian thực hiện đề tài tốt nghiệp

KS Trịnh Thị Phi Ly đã dành cho em nhiều sự hỗ trợ cần thiết, tận tình giúp đỡ

em vượt qua những khó khăn và cung cấp nhiều kiến thức qúy báu

Các Thầy cô, anh chị tại Viện Công Nghệ Sinh Học và Công Nghê Môi Trường – Trường Đại học Nông Lâm Tp HCM luôn tận tình hướng dẫn, giảng dạy và giúp đỡ tôi

Cùng toàn thể lớp CNSH 31 đã hỗ trợ, giúp đỡ và động viên tôi trong suốt thời gian làm đề tài

Con thành kính ghi ơn ba mẹ cùng những người thân trong gia đình luôn tạo điều kiện và động viên con trong suốt quá trình học tập tại trường

Tháng 08 năm 2009 Phạm Thị Thanh Vân

TÓM TẮT

Melamine xuất hiện trong thực phẩm nhất là sữa bột cho trẻ em và thức ăn cho các thú cưng gây nguy cơ tử vong và sạn thận cao là vấn đề đáng lo ngại, tạo ra tâm trạng hoang mang, lo lắng cho người dân, các doanh nghiệp làm ăn chân chính bị thiệt hại không ít Xuất phát từ tình hình trên, được sự cho phép của Bộ môn Công Nghệ Sinh Học – Trường Đại học Nông Lâm Tp.HCM, chúng tôi tiến hành đề tài: “Xây dựng quy trình phân tích hàm lượng melamine trên sữa, thức ăn gia súc bằng phương pháp sắc ký khí ghép khối phổ (Gas Chromatography – Mass Spectrometry)”

Melamine là một hợp chất hữu cơ có hàm lượng đạm cao được thêm vào thực phẩm là một hành vi gian lận nhằm làm tăng độ đạm tổng số Khi melamine được hấp thụ lâu ngày trong cơ thể và với nồng độ cao có thể gây nên các bệnh về sỏi thận và sỏi bàng quang Việc cố tình thêm melamine vào thức ăn cho vật nuôi là nguyên nhân của những cái chết hàng loạt trên chó và mèo Chúng tôi đã đưa ra quy trình phân tích hàm lượng melamine trên sữa, thức ăn gia súc trên thiết bị GC-MS sử dụng hệ thống Aligent 6890 GC, 5973 MS, bộ bơm mẫu tự động 7689 với cột mao quản Aligent ZB-5ms 30 m × 0,25 mm × 0,25 µm Dựa trên quy trình đã công bố bởi cơ quan quản lý thực phẩm và dược phẩm Hoa Kỳ (U.S.FDA), 2008, áp dụng trên các loại vật liệu khô (sữa bột, thức ăn gia súc…) Mẫu được chiết với hỗn hợp Diethyamine/H2O/Acetonitrile (DEA/H2O/ACN) và được tạo dẫn xuất Trimethysilyl (dẫn xuất TMS) trước khi đưa vào phân tích trên hệ thống GC-MS Khoảng tuyến tính được xây dựng ở nồng độ từ 50 ppb đến 1000 ppb Giới hạn phát hiện (LOD) của melamine đạt được là 15 ppb

The illicit additives melamine in milk power and pet food caused people to worry, the damage of the truth businesses Prom that situation, had been permitted of Faculty of Biotechnology – Nong Lam University, we had been made the topic:

“Procedured development for the detecting and quantifing melamine content in milk powder, pet – food by Gas Chromatography – Mass Spectrometry”

Melamine is a nitrogen rich organic compound which has been added to food and feed to fraudulently increase the apparent protein content Dietary long term exposure to high levels of melamine may lead to kidney and bladder diseases The illicit additives melamine in pet-food have caused the death of cats and dogs in the United States in 2007 To apply a GC-MS method publishing by the U.S Food and Drug Administration (U.S.FDA), we have achieved the improved procedure for detecting and quanlifing melamine content in milk-powder, pet-food using Aligent

6890 GC, 5973 MS, 7683 series injector with a 30 m × 0,25 mm × 0,25 µm Aligent ZB-5ms capillary column The procedure was developed to screen various kinds of matrice for the presence of melamine Samples are extracted using a mixture of Diethylamine/Water/Acetonitrile (DEA/H2O/ACN) and the analytes are subsequently converted to Trimethylsilyl derivatives (TMS derivatives) before injection The linear range is from 50 ppb to 1000 ppb for melamine and the limit of detection is 15 ppb

MỤC LỤC

Trang

LỜI CẢM ƠN iii

TÓM TẮT iv

SUMMARY v

MỤC LỤC vi

DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT ix

DANH SÁCH CÁC BẢNG x

DANH SÁCH CÁC HÌNH xi

Chương 1 MỞ ĐẦU 1

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Yêu cầu 2

1.3 Nội dung thực hiện 2

Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

2.1 Giới thiệu về melamine 3

2.1.1 Melamine là gì 3

2.1.2 Sự ra đời và phương pháp tổng hợp melamine 3

2.1.3 Mục tiêu sử dụng của melamine 4

2.1.4 Vì sao melamine lại đi vào chuỗi thực phẩm 4

2.1.5 Melamine gây độc ra sao 5

2.1.6 Có quy định về sử dụng melamine hay không 6

2.1.7 Có cách nào để nhận diện melamine hay không 8

2.2 Giới thiệu chung về phương pháp sắc ký 9

2.2.1 Lịch sử phương pháp sắc ký 9

2.2.2 Nguyên tắc căn bản phương pháp sắc ký 9

2.2.3 Phân loại các phương pháp sắc ký 10

2.3 Một số phương pháp sắc ký sử dụng trong phân tích melamine 12

2.3.1 Sắc ký lỏng cao áp 12

2.3.2 Sắc ký lỏng ghép khối phổ 13

2.3.3 Sắc ký khí ghép khối phổ 13

2.3.3.1 Ứng dụng GC-MS 14

2.3.3.2 Cấu tạo và hoạt động GC-MS 15

2.3.3.3 Ưu và nhược điểm của việc kết hợp GC và MS 18

2.3.3.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến việc tách mẫu 19

2.3.3.5 GC-MS trong phân tích melamine 19

2.4 Tình hình phân tích melamine ở Việt Nam 20

Chương 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22

3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu 22

3.2 Vật liệu 22

3.2.1 Đối tượng thí nghiệm 22

3.2.2 Hóa chất sử dụng 22

3.2.3 Dụng cụ và thiết bị 23

3.3 Phương pháp nghiên cứu 24

3.3.1 Xác định hàm lượng đạm tổng số trong mẫu đem phân tích 24

3.3.2 Chuẩn bị mẫu 25

3.3.2.1 Quy trình được công bố bởi U.S.FDA 25

3.3.2.2 Quy trình cải tiến từ quy trình được công bố bởi U.S.FDA 26

3.3.3 Điều kiện chạy máy 26

3.3.3.1 Điều kiện GC 26

3.3.3.2 Điều kiện MS 26

3.3.4 Đánh giá quy trình 25

3.3.4.1 Chuẩn bị chuẩn 27

3.3.4.2 Xác định hiệu suất thu hồi 28

3.3.4.3 Xác định giới hạn phát hiện (LOD) melamine 29

Chương 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 30

4.1 Kết quả đo hàm lượng đạm tổng số bằng phương pháp Kjeldahl 30

4.2 Nhận diện tín hiệu từ sắc ký đồ 30

4.3 Quy trình chuẩn bị mẫu phân tích theo công bố của U.S.FDA 33

4.4 Quy trình phân tích hàm lượng melamine trên nền sữa 34

4.5 Quy trình phân tích hàm lượng melamine trên nền thức ăn gia súc 38

4.6 Giới hạn phát hiện (LOD) melamine của phương pháp 41

Chương 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 43

5.1 Kết luận 43

5.2 Đề nghị 44 TÀI LIỆU THAM KHẢO 45 PHỤ LỤC

EFSA : Tiêu chuẩn thực phẩm Châu Âu

EIA : Enzyme Immunoassay

ELISA : Enzyme Linked Immunosorbent Assay

GC-MS : Gas Chromatography Mass Spectrometry (Sắc ký khí ghép khối phổ)

H2SO4dd : Acid sunfuric đậm đặc

HPLC : High Performance Liquid Chromatography (Sắc ký lỏng cao áp) LC-MS-MS: Sắc ký lỏng ghép khối phổ hai lần

LOD : Limit of Detection (Giới hạn phát hiện)

S/N : Signal-to-Noise ratio (Tỉ số tương đối của tín hiệu so với nhiễu nền)

S : Diện tích peak

SIM : Selected ion monitoring (Chế độ quét chọn lọc)

SPE : Solid phase extraction (Cột chiết pha rắn)

DANH SÁCH CÁC BẢNG

Trang

Bảng 2.1 Các phương pháp sắc ký cơ bản 11

Bảng 2.2 12 sở y tế được kiểm nghiệm melamine 21

Bảng 3.1 Điều kiện MS (SIM) 26

Bảng 3.2 Melamine và melamine tri-TMS trước và sau khi tạo dẫn xuất 27

Bảng 3.3 Thêm chuẩn melamine vào mẫu 27

Bảng 3.4 Quy trình U.S.FDA và quy trình cải tiến 28

Bảng 4.1 Kết quả đo hàm lượng đạm tổng số trong mẫu đem phân tích 30

Bảng 4.2 Kết quả xây dựng đường chuẩn 5 điểm melamine tri-TMS 34

Bảng 4.3 Kết quả phân tích melamine trên sữa 37

Bảng 4.4 Tương quan tỉ lệ trung bình C, V Melamine tri-TMS, Nội chuẩn trên sữa 37

Bảng 4.5 Kết quả xây dựng đường chuẩn dựa trên nồng độ melamine tri-TMS 38

Bảng 4.6 Kết quả phân tích melamine trên thức ăn gia súc 40

Bảng 4.7 Tương quan tỉ lệ trung bình C,V Melamine tri-TMS, Nội chuẩn 40

Bảng 4.8 Thời gian lưu và diện tích của các nhiễu nền 41

DANH SÁCH CÁC HÌNH

Trang

Hình 2.1 Cấu trúc phân tử melamine 3

Hình 2.2 Quá trình tách trong sắc ký 6

Hình 2.3 Kết hợp melamine và acid cyanuric 10

Hình 2.4 Các bộ phận chính của máy HPLC 12

Hinh 2.5 Liên hợp GC-MS .14

Hình 2.6 Cấu tạo chính của máy sắc ký khí .15

Hình 2.7 Thành phần cơ bản của hệ thống khối phổ .16

Hình 2.8 Sơ đồ phổ khối .17

Hình 3.1 Nền mẫu sử dụng làm thí nghiệm 22

Hình 3.2 Máy sắc ký khí ghép khối phổ Aligent 23

Hình 3.3 Quá trình tạo dẫn xuất melamine tri-TMS với Sylon BFT 28

Hình 4.1 Melamine tri-TMS 1000 ppb (11,16 phút), DACP 1000 ppb (10,29 phút) 31

Hình 4.2 Phổ khối của melamine tri-TMS ở phút 11,2 31

Hình 4.3 Phổ khối của chất nội chuẩn (DACP) ở phút 10,3 31

Hình 4.4 Melamine tri-TMS 1000 ppb (11,91 phút), DACP 1000 ppb (11,07 phút) 32

Hình 4.5 Phổ khối của melamine tri-TMS ở phút 11,9 32

Hình 4.6 Phổ khối của chất nội chuẩn (DACP) ở phút 11,07 32

Hình 4.7 Melamine tri-TMS 100 ppb, DACP 1000 ppb theo quy trình U.S.FDA 33

Hình 4.8 Melamine tri-TMS 100 ppb, DACP 1000 ppb theo quy trình cải tiến 33

Hình 4.9 Melamine tri-TMS 500 ppb ở phút 11,22 34

Hình 4.10 Đồ thị đường chuẩn 5 điểm melamine tri-TMS với R2 = 0,9612 34

Hình 4.11 Mẫu sữa không thêm melamine, thêm nội chuẩn 36

Hình 4.12 Dung môi chiết mẫu, không thêm melamine, thêm nội chuẩn 36

Hình 4.13 Melamine tri-TMS 250 ppb, DACP 1000 ppb trên nền sữa 36

Hình 4.14 Sơ đồ đường chuẩn melamine trên sữa với R2 = 0,9989 37

Hình 4.15 Đồ thị đường chuẩn 5 điểm melamine tri-TMS với R2 = 0,9987 38

Hình 4.16 Melamine tri-TMS 500 ppb ở phút 11,9 39

Hình 4.17 Mẫu thức ăn không thêm melamine, thêm nội chuẩn 39

Hình 4.18 Melamine tri-TMS 250 ppb, DACP 1000 ppb trên thức ăn gia súc 39

Hình 4.19 Đồ thị đường chuẩn melamine trên thức ăn với R2 = 0,9993 40

Hình 4.20 Melamine tri-TMS tại LOD = 15 ppb 42

Sơ đồ 3.1 Quy trình chuẩn bị mẫu được công bố bởi U.S.FDA 25

Việc phân tích chính xác melamine trong nền mẫu không phải là dễ dàng kể cả khâu tách chiết melamine ra khỏi nền mẫu và ở khâu vận hành thiết bị Cho đến nay, ngoài việc sử dụng phương pháp ELISA để sàng lọc thì chỉ có ba kỹ thuật tương đối hiện đại để phân tích melamine trong thực phẩm: phương pháp sắc ký lỏng HPLC với đầu dò UV chỉ thích hợp khi dùng để phân tích một hàm lượng melamine tương đối lớn Còn hai phương pháp nữa là sắc ký khí ghép khối phổ và sắc ký lỏng ghép khối phổ Với những phương pháp này, người ta cũng có thể gặp trở ngại khiến kết quả đạt thấp hơn trị số thực, nếu không giải quyết tốt vấn đề chiết tách melamine ra khỏi protein thực phẩm

Từ thực tế trên, chúng tôi đã xây dựng quy trình phân tích hàm lượng melamine trên sữa và thức ăn gia súc bằng phương pháp sắc ký khí ghép khối phổ (GC-MS), dựa trên quy trình đã được công bố bởi U.S.FDA, 2008

1.2 Yêu cầu

Tạo đựợc mẫu đưa vào phân tích có độ tinh sạch cao

Sử dụng thiết bị GC-MS của Viện Công Nghệ Sinh Học và Công Nghệ Môi Trường – Trường Đại học Nông Lâm Tp.HCM để tiến hành phân tích định lượng melamine

1.3 Nội dung thực hiện

 Dựng đường chuẩn 5 điểm melamine

 Đo hàm lượng đạm tổng số trên 2 nền mẫu đem phân tích

 Xây dựng quy trình phân tích, xác định hiệu suất thu hồi của melamine trên nền sữa

 Xây dựng quy trình phân tích, xác định hiệu suất thu hồi của melamine trên nền thức ăn gia súc

 Tìm giới hạn phát hiện (LOD) của melamine

Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Giới thiệu về melamine

2.1.1 Melamine là gì ?

Melamine (tên đầy đủ 1,3,5-triazine-2,4,6-triamine) là một bazơ hữu cơ có công thức hóa học C3H6N6 tạo thành từ 3 phân tử cyanamide (CN2H2) Nếu tính tỷ lệ các nguyên tố cacbon (C), nitơ (N) và hydro (H) thì nitơ chiếm tới 66% tính theo khối lượng Melamine tan ít trong nước, có khả năng giải phóng N khi gặp nhiệt độ cao và được sử dụng làm chất chống cháy

Melamine còn là dẫn chất của thuốc trừ sâu cyromazine và có thể được hình thành trong cơ thể động vật có vú từ cyromazine Có nghiên cứu cho rằng melamine cũng được hình thành từ cyromazine khi cyromazine có mặt trong mô thực vật (Nguyễn Bá Tiếp, 2008)

Hình 2.1 Cấu trúc phân tử melamine

2.1.2 Sự ra đời và phương pháp tổng hợp melamine

Melamine được nhà hóa học Đức Justus von Liebig tổng hợp lần đầu năm 1834 Trước đây, đầu tiên người ta biến calci Cyanamid thành ra dicyandiamide, sau đó đốt lên quá nhiệt độ nóng chảy để tạo melamine Ngày nay người ta dùng ure để chế tạo melamine theo 2 bước:

- Dùng phản ứng đẳng nhiệt để biến ure thành acid cyanic và ammoniac

6(NH2)2CO → 6HCNO + 6NH3

- Acid cyanic trùng hợp hóa tạo ra melamine và carbon dioxid

6HCNO → C3H6N6 + 3CO2 (Nguyễn Bá Tiếp, 2008)

2.1.3 Mục tiêu sử dụng của melamine

Melamine không phải là chất phụ gia thực phẩm trong tất cả các loại thực phẩm

và đồ uống Nó được sản xuất ra để phục vụ cho các lĩnh vực công nghiệp như:

Melamine được sử dụng để sản xuất ra melamine resin (một loại polymer công nghiệp)

Melamine cũng được sử dụng để sản xuất keo dán gỗ trong công nghệ gỗ

Trong ngành công nghiệp chất dẻo, người ta cũng sử dụng melamine để sản xuất dụng cụ gia đình như: ca nhựa, dĩa nhựa, kính mica… nhờ có phản ứng melamine formaldehyde tạo ra một loại polymer tổng hợp chịu nhiệt, chống cháy, làm chất chậm cháy Melamine cũng là thành phần chính trong màu mực in trên các dụng cụ bằng chất dẻo

Trong lĩnh vực xây dựng, melamine cũng được sử dụng trong sản xuất beton chịu lực, vì nó làm giảm hàm lượng nước, hạn chế tạo xốp để làm tăng độ bền của beton

Do sở hữu hàm lượng nitơ cao nên ngay từ những năm 50, melamine được sử dụng làm phân bón Tuy nhiên, do phản ứng thủy phân melamine nên tác dụng của nó đối với đất trồng rất hạn chế Melamine cũng có mặt trong thuốc có gốc asen được dùng trong điều trị xoắn trùng châu Phi Đã từ lâu người ta dùng melamine như một nguồn cung cấp nitơ không phải là protein cho động vật nhai lại (tuy nhiên, quan điểm

về ứng dụng này còn chưa nhất quán)

Dẫn xuất của melamine là acid cyanuric, cũng được sản xuất ra với số lượng lớn

để làm nguyên liệu sản xuất chất dẻo cùng với melamine, sản xuất thuốc nhuộm, thuốc diệt cỏ và làm thuốc chống khuẩn, nó còn được sử dụng để làm chất ổn định, tẩy uế

nước trong các bể bơi…(Dương Thanh Liêm, 2008)

2.1.4 Vì sao melamine lại đi vào chuỗi thực phẩm ?

Melamine không phải là hợp chất tự nhiên (natural chemicals), nó là chất tổng hợp nhân tạo Vậy nó đi vào thực phẩm có thể bằng hai con đường:

Con đường thứ nhất, khi chúng ta sử dụng dụng cụ có liên quan với chất dẻo để chế biến hoặc chứa đựng thực phẩm trong các hoàn cảnh nhiệt độ và pH khác nhau, có thể melamine từ dụng cụ đó đi vào thực phẩm, hoặc vào trong nước, rồi từ nước đi vào thực phẩm Tất nhiên con đường này thì lượng melamine vào thực phẩm không thể nhiều được, không thể gây ra ngộ độc trên phạm vi rộng lớn như ngộ độc do sữa bột

Trung Quốc vừa qua và cũng không thể gây ra cái chết hàng vạn chó mèo trên phạm vi thế giới do ăn thức ăn công nghiệp nhiễm melamine trong những năm vừa qua

Con đường thứ hai, do gian lận thương mại Điều này có thể khẳng định là chắc chắn, vì cứ đưa 1% melamine vào trong sữa bột thì làm tăng lên 4,13% protein thô Việc kiểm tra hàm lượng protein trong sữa, người ta cũng chỉ kiểm tra protein thô, những nhà sản xuất gian lận lợi dụng điều này để làm mau đầy két tiền nhà mình và gây ra những cái chết đáng thương của trẻ thơ và hàng chục ngàn trẻ em Trung Quốc phải nhập viện để điều trị Đây mới là con đường melamine đi vào chuỗi thực phẩm gây ngộ độc thực phẩm trên phạm vi rộng lớn vừa qua (Dương Thanh Liêm, 2008) Tuy nhiên, kết quả phân tích những mẫu sữa hay sản phẩm từ sữa cho thấy, hầu hết nồng độ melamine đều cỡ vài mg/kg trở xuống Nồng độ thấp nhất được thông báo

là 7 µg/kg - rất nhỏ, còn mẫu có nồng độ cao nhất là trên 1000 mg/kg, tức là chưa đến một độ đạm Qua các cách đo melamine và phối kiểm lại các kết quả công khai, dù kết quả đo được có thể nhỏ hơn thực tế, nhưng khó có thể cho rằng một mẫu có hàm lượng melamine lớn nhằm tăng độ đạm lại cho kết quả phân tích rất nhỏ như vậy Theo GS Chu Phạm Ngọc Sơn (Trung tâm dịch vụ và phân tích thí nghiệm, 2 Nguyễn Văn Thủ,

Q 1, Tp.HCM), nói một cách khác, các nhà khoa học đã tìm thấy những mẫu sữa và sản phẩm từ sữa chứa hàm lượng melamine nhỏ cỡ vài mg/kg trở xuống Trong trường hợp này, cho melamine vào sữa có thể nhằm mục tiêu khác thay vì tăng độ đạm

Thêm một câu hỏi được đặt ra: "Phải chăng melamine với 3 nhóm amin (-NH2)

có thể kết hợp với phân tử protein, tạo thành khối lớn hơn có tác dụng tăng độ nhớt khiến người mua có cảm giác là sữa đặc hơn” (Hương Cát, 2008)

2.1.5 Melamine gây độc ra sao ?

Theo tài liệu mới nhất mà Văn phòng đại diện WHO tại Việt Nam vừa công bố, dựa trên những nghiên cứu ngẫu nhiên về thức ăn vật nuôi có nhiễm melamine với sự phát triển của sỏi thận và suy thận cấp sau đó ở chó và mèo, đã cho thấy rằng, melamine và các chất cấu trúc tương tự như nó, như axit cyanuric có thể kết hợp với nhau tạo ra tinh thể Với liều lượng cao, đạt ngưỡng tập trung, thì tinh thể này sẽ hình thành và gây tác hại

Những nghiên cứu tiếp theo trên động vật cho thấy, khi chúng được cho ăn hỗn hợp của melamine và axit cyanuric, sẽ hình thành chất rắn trong ống thận, cuối cùng làm tắc nghẽn, gây ra suy thận và hoại thận

Hình 2.2 Kết hợp melamine và acid cyanuric

(Thanh Loan, 2008)

Về độc tính, melamine không được trao đổi chất, mà nhanh chóng bài tiết qua nước tiểu Tuy chưa có dữ liệu về độc tính của melamine qua đường miệng ở người, nhưng các nhà khoa học đã thấy có tác hại trên chuột Tệ hại hơn, Trung tâm Quốc tế nghiên cứu ung thư (IARC) đã có kết luận rằng có bằng chứng trên động vật thí nghiệm cho thấy, melamine có sản sinh chất gây ung thư trong cùng điều kiện mà nó sản sinh ra sỏi bàng quang (Thanh Loan, 2008)

2.1.6 Có quy định về sử dụng melamine hay không ?

Melamine được sử dụng trong công nghiệp nhựa, sản xuất keo dán và các sản phẩm chịu nhiệt, dụng cụ nhà bếp, làm chất chống cháy… chứ không phải là chất phụ gia thực phẩm Mục đích của việc đưa melamine vào thức ăn cho động vật và thực phẩm chỉ nhằm làm tăng hàm lượng nitơ để được các phương pháp đánh giá cho là có hàm lượng đạm cao "Đạm" ở đây là "đạm giả", không những không có giá trị dinh dưỡng mà còn gây hại Mỹ và các quốc gia thuộc EU không cho phép sử dụng melamine làm phụ gia trong thức ăn động vật và thực phẩm cho người trong bất cứ giai đoạn nào của quá trình chế biến Mặc dù bản thân melamine không có tính độc cao nhưng hỗn hợp melamine và acid cyanuric sẽ có khả năng tạo tinh thể rất lớn và gây sỏi thận

Melamine không được thêm vào có chủ định nhưng mẫu xét nghiệm vẫn có melamine? Trường hợp này có thể do melamine từ bao gói, dụng cụ chứa đã xâm nhập vào thực phẩm với hàm lượng rất thấp Các cuộc điều tra đang được tiến hành để xác định có thể dò thấy melamine ở mức nào từ loại xâm nhập này

Cơ quan quản lý thực phẩm và dược phẩm Hoa Kỳ (U.S.FDA) và Cơ quan Tiêu chuẩn thực phẩm châu Âu (EFSA) đã tiến hành đánh giá nguy cơ sơ bộ năm 2007 U.S.FDA đã công bố một đánh giá an toàn/nguy cơ tạm thời về melamine và các chất

có cấu trúc tương tự (cyanuric acid, ammelide và ammeline) và đã xác lập ngưỡng hấp thụ hàng ngày có thể chịu được (TDI) đối với người là 0,63 mg melamine/1 kg trọng lượng cơ thể mỗi ngày (Hải Yến, 2008)

TDI được định nghĩa là lượng tối đa ước tính của một chất con người có thể phơi nhiễm hàng ngày trong suốt thời gian sống mà không gây nguy cơ lớn về sức khỏe

Ngày 3/10/2008, U.S.FDA cũng đã công bố đánh giá mới về nguy cơ/an toàn đối với melamine và các hợp chất liên quan tới melamine trong thực phẩm, kể cả sữa bột trẻ em

EFSA đã đưa ra một tuyên bố tạm thời và khuyến nghị mức TDI là 0,5 mg/1 kg trọng lượng cơ thể mỗi ngày cho tổng cộng cả melamine và các chất tương tự (WHO: Melamine và Axit Cyanuric) (Hải Yến, 2008)

Bộ Y tế Canada tuyên bố một đánh giá về nguy cơ melamine trong thực phẩm chứa sữa và các thành phần dẫn xuất từ sữa Theo đó, xác lập ngưỡng TDI là 0,35 mg melamine/1 kg trọng lượng cơ thể mỗi ngày

Như vậy, nếu sử dụng TDI là 0,5 mg melanine/1 kg trọng lượng cơ thể, tổng mức melamine phơi nhiễm mỗi ngày có thể chịu được của một người nặng 50 kg là 25 mg melamine Lúc đó, ngưỡng này sẽ được coi là ’’mức lo ngại’’

Theo tài liệu của WHO, tháng 9/2008 EU đã đưa ra giới hạn 2,5 mg melamine/kg sản phẩm chứa sữa hoặc sản phẩm sữa có nguồn gốc từ Trung Quốc Hong Kong đưa

ra giới hạn 1 mg melamine/kg sản phẩm sữa và thức ăn cho trẻ em dưới 36 tháng tuổi, phụ nữ có mang và phụ nữ đang nuôi con bằng sữa mẹ, giới hạn 2,5 mg/kg cho các sản phẩm khác New Zealand cũng đưa ra giới hạn tương tự Hong Kong

5/12/2008, WHO quyết định đưa ra ngưỡng melamine trong thực phẩm

Theo đó, mức hấp thụ hàng ngày có thể chịu được (TDI) là 0,2 mg melamine/

1 kg trọng lượng cơ thể Như vậy một người nặng 50 kg có thể hấp thụ 10 mg

melamine mỗi ngày mà không nguy hại tới sức khỏe Mức này thấp hơn các mức TDI trước kia mà một số nước đặt ra

12/12/2008 Bộ Y tế Việt Nam ban hành ngưỡng melamine tối đa là 1 mg/kg đối với thực phẩm dành cho trẻ dưới 36 tháng tuổi và 2,5 mg/kg với các thực phẩm khác, tương đương với một số nước như Mỹ, Trung Quốc, Australia, New Zealand

Bộ Y tế ban hành ngưỡng này giúp các doanh nghiệp ổn định sản xuất, người tiêu dùng đỡ hoang mang nhưng đồng thời cũng khẳng định tuyệt đối cấm mọi hình thức

cố ý đưa melamine vào trong thực phẩm

2.1.7 Có cách nào để nhận diện melamine hay không ?

Với tính ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực đặc biệt trong công nghiệp nên các phương pháp định tính, định lượng melamine cũng như các dẫn chất của melamine

đã được sử dụng rộng rãi Tuy vậy, việc phát triển các phương pháp dùng tìm dấu vết

và định lượng melamine trong thức ăn, trong mô của động vật được chú ý sau khi vụ phát hiện thức ăn nhiễm melamine nhập từ Trung Quốc (tháng 3 năm 2007) Phương pháp được dùng phổ biến hiện nay là sắc ký lỏng (Liquid Chromatography) và sắc ký lỏng cải biến, sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC), sắc ký khối phổ (Mass Spectrometry, MS), HPLC kết hợp với MS (HPLC-MS-MS) Phương pháp dựa trên nguyên lý phản ứng miễn dịch kết hợp enzyme (EIA) cũng được ứng dụng để tìm melamine trong thức

ăn Cục quản lý Dược phẩm và Thực phẩm (Mỹ) sử dụng kỹ thuật sắc ký khí ghép khối phổ (Gas Chromatography Mass Spectrometry, GC-MS) để tìm melamine trong thực phẩm Khối phổ hồng ngoại cũng được ứng dụng tìm tinh thể chứa melamine trong mô động vật (Nguyễn Bá Tiếp, 2008)

2.2 Giới thiệu chung về phương pháp sắc ký

2.2.1 Lịch sử phương pháp sắc ký

Nhà thực vật học người Nga Mikhail Tsvet (Mikhail Semyonovich Tsvet) phát minh ra kĩ thuật sắc ký vào năm 1903 khi ông đang nghiên cứu về chlorophyll Từ ngữ

“chromatography” xuất phát từ chữ “chroma” trong tiếng Latinh có nghĩa là chất màu,

nó vừa là tên của Tsvet trong nghĩa tiếng Nga, và vừa là màu của các sắc tố thực vật ông phân tích vào lúc bấy giờ Tên này vẫn tiếp tục được dùng dù các phương pháp hiện đại không còn liên quan đến màu sắc (Nguyễn Kim Phi Phụng, 2007)

Sắc ký phân bố lỏng được đề xướng vào năm 1942 bởi các nhà hóa sinh Archer John Porter Martin và Richard Laurence Millington Synge Các nhà bác học này đã nghiên cứu lí thuyết chung đầu tiên của sắc ký và đã giả thuyết rằng: việc tổ hợp pha

di động khí với pha tĩnh lỏng có những ưu điểm quan trọng Sau đó trong sắc ký còn

có một chỗ trống nữa, và mặc dù một số trong các biến dạng khác nhau đã trở nên phổ biến, tuy nhiên không có công trình nào về ứng dụng của sự tổ hợp chất khí với chất lỏng đã được công bố, cho đến năm 1952 khi Archer John Porter Martin cùng với Richard Laurence Millington Synge đã mô tả phương pháp này Công trình này như một làn sóng bùng nổ tạo ra một bước ngoặc cho sự phát triển của sắc ký và nó được tiếp tục phát triển cho đến ngày nay Ngay vào năm 1956, các phòng thí nghiệm hóa học hữu cơ khắp thế giới đã dùng phép sắc ký khí – lỏng Ngày nay, mỗi năm, tài liệu

về sắc ký có đến hàng nghìn công trình và còn lớn hơn về sự ứng dụng của phương pháp này Về mặt triển vọng, những công trình ban đầu của Martin và Synge là những công trình có tính quyết định trong sự phát triển của sắc ký phân bố và vào năm 1954

họ đã được nhận giải thưởng nobel về hóa học (Hồ Viết Quý, 2006)

2.2.2 Nguyên tắc căn bản phương pháp sắc ký

Sắc ký là một phương pháp vật lý để phân tách, phân li, phân tích các chất dựa vào sự phân bố khác nhau của chúng giữa hai pha động và pha tĩnh Có nhiều nguyên nhân đưa đến sự phân bố khác nhau giữa nhau của các chất, nhưng chính sự lặp đi lặp lại hiện tượng hấp phụ - phản hấp phụ của các chất khi dòng pha động chuyển động qua pha tĩnh là nguyên nhân chủ yếu của việc tách sắc ký

Hầu hết các phương pháp sắc ký đều được dựa theo nguyên lý trên, và hiệu quả của từng phương pháp phụ vào sự chọn lựa giữa pha động pha tĩnh

Khi tiếp xúc với pha tĩnh, các cấu tử của hỗn hợp sẽ phân bố giữa pha tĩnh và pha động tương ứng với tính chất của chúng (tính hấp phụ, tính tan) Trong các hệ thống sắc ký chỉ có các phân tử pha động mới chuyển động dọc theo hệ sắc ký Các chất khác nhau sẽ có ái lực khác nhau với pha tĩnh và pha động Trong quá trình pha động chuyển động dọc theo hệ sắc ký hết lớp pha tĩnh này đến lớp pha tĩnh khác, sẽ lặp đi lặp lại quá trình hấp phụ, phản hấp phụ Hệ quả là các chất có ái lực lớn với pha tĩnh sẽ chuyển động chậm hơn qua hệ thống sắc ký so với các chất tương tác yếu hơn với pha này Nhờ vậy mà người ta có thể tách các chất qua quá trình sắc ký (Archer J.P Martin, 1952)

Tướng động

Tướng tĩnh

Tách

Mẫu (rắn, lỏng, khí)

Hình 2.3 Quá trình tách trong sắc ký

2.2.3 Phân loại các phương pháp sắc ký

Trong phương pháp sắc ký pha động phải là các lưu thể còn pha tĩnh là các chất ở trạng thái lỏng hoặc rắn Dựa vào trạng thái tập hợp của pha động, người ta chia sắc ký thành hai nhóm sắc ký khí và sắc ký lỏng Dựa vào cơ chế trao đổi của các chất giữa pha động và pha tĩnh mà người ta lại chia các phương pháp sắc ký thành nhóm nhỏ hơn (Archer J.P Martin, 1952)

Tùy theo trạng thái tập hợp của các pha, loại tương tác và sự hình thành sắc ký

mà người ta phân biệt các loại sắc ký như sau:

2.3 Một số phương pháp sắc ký sử dụng trong phân tích melamine

2.3.1 Sắc ký lỏng cao áp (High Performance Liquid Chromatography)

Năm 1967, Horvath C là tác giả đầu tiên đã tạo máy HPLC để nghiên cứu về nucleotide Ngày nay, với các ưu điểm như áp suất cao, độ phân giải cao, vận tốc sắc

ký nhanh HPLC được áp dụng trong rất nhiều lĩnh vực nghiên cứu đa dạng như phân tích dược phẩm, các dung dịch sinh lý, polimer thiên nhiên hoặc tổng hợp, các loại dư lượng trong môi trường, nhiều loại hợp chất vô cơ, các loại nguyên tố hiện diện trong mẫu phân tích ở dạng vết… Hơn nữa, các loại đầu dò dùng cho HPLC không làm hư hại mẫu phân tích, nên sau khi phân tích, có thể thu hồi mẫu để thực hiện các loại nghiên cứu khác như phân tích phổ, thử nghiệm hoạt tính sinh học…(Nguyễn Kim Phi Phụng, 2007)

HPLC dựa vào pha động (dạng lỏng) để phân tách các thành phần trộn lẫn vào nhau Những thành phần này đầu tiên được hòa tan vào trong dung môi và sau đó dưới tác dụng của áp suất cao, chúng sẽ bị lôi kéo di chuyển qua cột sắc ký Trong cột, hỗn hợp sẽ được phân tách thành những cấu tử của chúng

Sự tương tác giữa chất tan với pha động và pha tĩnh có thể phụ thuộc vào sự chọn lựa khác nhau cả dung môi và pha tĩnh Kết quả HPLC sẽ thu được nhiều cấu tử khác nhau mà các kỹ thuật sắc ký khác không thực hiện được và nó dễ dàng phân tách số lượng lớn các chất hoá học trộn lẫn vào nhau

Hệ thống xử

lý dữ liệu Pha động

Hình 2.4 Các bộ phận chính của máy HPLC

HPLC-UV có thể cung cấp thông tin định lượng (thường sử dụng UV ở bước sóng 240 nm) Mẫu được chiết với hỗn hợp acetonitrile/H2O và được phân tích bởi sắc

ký lỏng ghép cặp ion (ion-pair HPLC) Chỉ thích hợp khi dùng để phân tích một hàm lượng melamine tương đối lớn (WHO/HSE-FOS, 2 October 08)

2.3.2 Sắc ký lỏng ghép khối phổ

LC-MS-MS là phương pháp đáng tin cậy nhất dùng trong định lượng melamine với nồng độ thấp trong nhiều loại mẫu phân tích Nó cho độ nhạy và độ chọn lọc cao trong phạm vi rộng các sản phẩm khác nhau Mẫu được chiết với hỗn hợp acetonitrile/H2O Chất chiết được làm sạch với methylene chloride bằng cột SPE Melamine được tách ra từ cột SPE với hỗn hợp ammonium hydroxide/methanol, làm khô, được tái tạo lại với chất nội chuẩn và hỗn hợp acetonitrile/H2O, đem phân tích trên hệ thống LC-MS-MS Yêu cầu sự trang bị máy móc phức tạp, thông qua sử dụng chất đồng vị đánh dấu những tiêu chuẩn định lượng đáng tin cậy ở nồng độ thấp đến mức có thể (WHO/HSE-FOS, 2 October 08)

2.3.3 Sắc ký khí ghép khối phổ

Phương pháp sắc ký khí ghép khối phổ (Gas Chromatography - Mass Spectometry, GC-MS) là một trong những phương tiện hữu ích dùng để xác định thành phần, cấu trúc hóa học của hợp chất cần khảo sát Các cấu tử được tách khỏi cột sắc ký

sẽ lần lượt được đưa vào nguồn ion của máy khối phổ Tại đó chúng được phân mảnh

và được tách khối nhờ một từ trường rồi đi vào bộ nhân quang để chuyển hóa thành tín hiệu điện Ứng với mỗi một peak trên sắc ký đồ sẽ nhận được một khối phổ riêng biệt

và hoàn chỉnh (Phạm Hùng Việt, 2005)

Van điều khiển Khí

mang

Cột

Buồng tiêm mẫu

Van điều khiển

Nguồn ion hóa

Từ trường

Nhận dạng: Nếu trong mẫu có một chất lạ xuất hiện, khối phổ có thể nhận dạng cấu trúc hóa học độc nhất của nó Cấu trúc của chất này sau đó được so sánh với một thư viện cấu trúc của các chất đã biết Nếu không tìm được chất tương ứng trong thư viện thì nhà nghiên cứu có thể dựa trên cấu trúc mới tìm được để phát triển các ý tưởng về cấu trúc hóa học Nói cách khác, nhà nghiên cứu thu được một dữ liệu mới

và có thể đóng góp vào thư viện cấu trúc nói trên sau khi tiến hành thêm các biện pháp

để xác định được chính xác loại hợp chất mới này (Dương Văn Cường, 2006)

2.3.3.2 Cấu tạo và hoạt động GC-MS

Thiết bị GC-MS được cấu tạo từ 2 thành phần Phần sắc ký khí (GC) phân tách hỗn hợp hóa chất thành một mạch theo từng chất tinh khiết Phần khối phổ (MS) xác định cả định tính và định lượng các chất này

Lò (oven): Phần vỏ của hệ thống GC chính là một lò nung đặc biệt Nhiệt độ của

lò có thể đạt tới 400oC (752oF) để đảm bảo mẫu ở trạng thái khí

Cột (column): Sử dụng cột mao quản hở với chiều dài khá lớn (25 m, 50 m,

100 m…), mặt trong được tráng bằng một loại polymer đặc biệt Các chất trong hỗn hợp được phân tách bằng cách chạy dọc theo cột này

Khối phổ (MS)

Bộ phát hiện

Ion Detector

Sort Ions by Mass (m/z)

Hình 2.7 Thành phần cơ bản của hệ thống khối phổ

Khối phổ là thiết bị phân tích dựa trên cơ sở xác định khối lượng phân tử của các hợp chất hóa học bằng việc phân tách các ion phân tử theo tỉ số giữa khối lượng và điện tích (m/z) của chúng Các ion có thể tạo ra bằng cách thêm hay bớt điện tích của chúng (loại bỏ electron, proton hóa, đề proton hóa…) Các ion tạo thành này được tách theo tỉ số m/z và phát hiện, từ đó có thể cho thông tin về khối lượng hoặc cấu trúc phân tử của hợp chất (Phạm Hùng Việt, 2005)

Các phân tử tồn tại ở mức năng lượng của trạng thái cơ bản và khi bị chiếu rọi bằng bức xạ điện từ với tần số chính xác, nếu bức xạ điện từ bị hấp thu thì phân tử bị đẩy lên mức năng lượng của trạng thái kích thích Trong phổ kế khối lượng, các phân

tử bị ion hóa và những ion này được xem xét tỉ mỉ, một khi các ion này được tạo thành thì không thể đảo ngược quá trình và lấy lại mẫu phân tích Vì thế phổ học khối lượng

là phương pháp phân tích hủy cấu trúc (Nguyễn Thanh Hồng, 2007)

Nguồn Ion hóa (ion source): Mẫu qua cột sắc ký khí, sau đó vào buồng ion hóa Một chùm electron được gia tốc với hiệu điện thế cao và vì vậy phân tử của mẫu có thể

bị chia thành các mảnh nhỏ hơn và tích điện dương Các mảnh này được gọi là ion Điều này là quan trọng bởi các hạt cần ở trạng thái tích điện mới đi qua được bộ lọc

Bộ lọc khối (Filter): Khi các ion di chuyển trong bộ phận khối phổ, dựa trên khối lượng mà chúng được sàng lọc bởi một trường điện từ Bộ lọc này có khả năng lựa chọn, chỉ cho phép các hạt có khối lượng nằm trong một giới hạn nhất định đi qua

Bộ phát hiện (detector): Các phân tử mang điện tích di chuyển dạng đường cong hướng đến detector Khi từng phần tử tích điện va chạm với bề mặt detector, một vài electron (cũng có thể là các phần tử tích điện) thoát ra khỏi bề mặt detector Sau đó, những electron này gia tốc hướng tới bề mặt thứ hai, tạo nhiều electron hơn, các electron này lại bắn phá bề mặt khác Mỗi electron mang một điện tích Thậm chí, sự

đa va chạm với nhiều bề mặt sinh ra hàng ngàn electron thoát ra ở bề mặt cuối cùng Kết quả là sự phóng đại điện tích ban đầu trong suốt từng đợt electron đến bộ phận thu nhận Tại nơi này, thiết bị đo điện tích và ghi nhận khối lượng từng mảnh

Kết quả của đầu dò khối phổ là một dãy các peak trên biểu đồ, gọi là phổ khối Mỗi peak đại diện cho giá trị khối lượng của từng mảnh Chiều cao của peak tỉ lệ với

số mảnh được phát hiện ở khối lượng nhất định

Hình 2.8 Sơ đồ phổ khối

(Dương Văn Cường, 2006)

Trên hình ta thấy phân tử ban đầu có khối lượng là 5 Trên sơ đồ khối phổ hạt lớn nhất này được gọi là ion phân tử (molecular ion) Các hạt nhỏ hơn có khối lượng 1, 2,

3 và 4 được gọi là các ion phân mảnh (fragment ions) Trong trường hợp trên ta thấy các phân tử của chất này có xu hướng bị phá vỡ thành các tổ hợp 1 - 4 hơn là 2 - 3 Các nhà nghiên cứu có thể so sánh khối phổ thu được trong thí nghiệm của họ với một thư viện khối phổ của các chất đã được xác đinh trước Việc này có thể giúp họ định danh được chất đó (nếu phép so sánh tìm được kết quả tương ứng) hoặc là cơ sở

để đăng kí một chất mới (nếu phép so sánh không tìm được kết quả tương ứng)

GC kết hợp với đầu dò MS là một dụng cụ để nhận dạng thuyết phục Phân tích GC-MS được sử dụng rộng rãi để định danh các chất, được ứng dụng nhiều trong kiểm

tra dược phẩm, môi trường, quản lí chất lượng sản xuất và một số lĩnh vực khác (Dương Văn Cường, 2006)

2.3.3.3 Ưu và nhược điểm của việc kết hợp GC và MS

Ưu điểm

Tính bay hơi: Cả GC và đầu dò MS đều có thể phân tích tất cả các hợp chất khí, lỏng, rắn nếu các hợp chất này có đặc tính áp suất hơi lớn (high vapour pressure)

Độ nhạy: Đầu dò khối phổ có độ nhạy cao, nên có thể phân tích các hợp chất đi ra

từ một cột sắc ký (đầu dò khối phổ có thể phát hiện số lượng mẫu là 1 pg)

Nhiệt độ: Cột sắc ký khí và hệ thống nhận mẫu của đầu dò khối phổ có thể hoạt động ở khoảng nhiệt độ giống nhau

Thời gian quét (scan time): Đầu dò khối phổ có vận tốc quét rất nhanh, đủ để ghi nhận hết các tín hiệu đi ra từ một cột sắc ký khí

Nhược điểm

Áp suất: GC và đầu dò MS hoạt động trong một điều kiện áp suất rất khác nhau, nên sự kết hợp hai thiết bị này với nhau là trở ngại lớn nhất

Loại cột sắc ký: Chỉ có một số loại cột sắc ký có thể sử dụng trong thiết bị

GC-MS Các cột loại polimer hữu cơ sẽ bị dứt mảnh khi nhiệt độ gia tăng, mảnh nhỏ này

sẽ đi vào khối phổ làm xuất hiện trên phổ đồ những mũi rất đặc trưng, có thể gây nhầm lẫn là các mảnh ion của mẫu khảo sát

Giá thành cao: Các phòng thí nghiệm bình thường không đủ tài chính để trang bị loại thiết bị cho những hoạt động thường nhật

Cần điều chế dẫn xuất cho mẫu khảo sát: Nhiều loại hợp chất khảo sát, do tính chất không thể bay hơi nên cần phải được biến đổi thành các dẫn xuất bay hơi được, trước khi thực hiện sắc ký khí (Nguyễn Kim Phi Phụng, 2007)

2.3.3.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến việc tách mẫu

Chìa khóa cho việc phân tách các cấu tử của một hỗn hợp đạt kết quả tốt là phải chọn một pha tĩnh phù hợp, tốc độ dòng của pha động và nhiệt độ cột đạt điều kiện tối ưu

Trước khi phân tích mẫu, cần xem xét các yếu tố sau:

Mẫu: Các mẫu cần được tinh chế sơ bộ, không có các vết nhờn, không bị ẩm trước khi bơm vào máy Không sử dụng cột vượt quá mức nhiệt độ cho phép với từng

loại cột Ống tiêm mẫu cần được rửa nhiều lần bằng dung môi thích hợp, để loại bỏ hết các tạp bẩn

Lựa chọn hệ thống pha tĩnh (cột): Loại pha tĩnh, chiều dày của pha tĩnh tráng cột Tối ưu hóa tốc độ dòng của khí mang để có thể hoàn tất việc phân tích mẫu trong khoảng thời gian ngắn nhất, thời gian chết ngắn nhất (helium là khí mang tốt nhất cho mọi loại phân tích)

Tối ưu hóa chương trình nhiệt độ hoặc lựa chọn một nhiệt độ tốt nhất cho chương trình đẳng nhiệt

Kiểm tra hệ thống thiết bị bằng cách cho phân tích thử một bộ phận chuẩn hoặc phân tích một hỗn hợp gồm nhiều chất có độ phân cực cũng như nhiệt độ sôi khác nhau (Nguyễn Kim Phi Phụng, 2007)

2.3.3.5 GC-MS trong phân tích melamine

GC-MS yêu cầu một sự chuẩn bị mẫu phức tạp hơn các phương pháp sắc ký khác như melamine phải tạo dẫn xuất TMS (dẫn xuất trimethylsilyl) trước khi chạy GC-MS Nếu thực hiện đúng cách trên một hệ thống được bảo dưỡng tốt thì độ nhạy và độ chọn lọc sẽ rất cao Có thể sử dụng trên nhiều nền mẫu khác nhau Mẫu được chiết với một hỗn hợp diethylamine/H2O/acetonitrile (DEA/H2O/ACN) và tạo dẫn xuất trimethylsilyl (TMS) trước khi đem phân tích Phương pháp được công bố bởi U.S.FDA thông báo giới hạn định lượng là 2 mg/kg, tuy nhiên độ nhạy có thể xuống tới 0.01 mg/kg Hệ thống GC-MS yêu cầu chú ý đặc biệt cẩn thận với những bước kiểm tra nghiêm ngặt trong phòng thí nghiệm trước khi phân tích những dẫn xuất của mẫu (WHO/HSE-FOS, 2 October 08)

2.3 Tình hình phân tích melamine ở Việt Nam

Bộ Nông Nghiệp – Phát Triển Nông Thôn cho biết, có 12 phòng nghiên cứu được phép tiến hành phân tích, kiểm nghiệm chất Melamine trong nguyên liệu và thức ăn chăn nuôi, nuôi trồng thuỷ sản, theo yêu cầu của cơ quan quản lý nhà nước hoặc của các tổ chức, cá nhân khác

Tuy nhiên, đây chỉ là danh sách tạm thời Các phòng nghiên cứu trên được tiến hành kiểm nghiệm, công bố chất melamine trong thức ăn chăn nuôi đến hết ngày 30/6/2009

Sau đó, một hội đồng đánh giá năng lực các phòng phân tích, thử nghiệm sẽ được thành lập để trình Bộ quyết định chỉ định chính thức

Trước đó, Bộ Nông Nghiệp – Phát Triển Nông Thôn đã chấp nhận ngưỡng melamine không lớn hơn 2,5 mg/kg trong nguyên liệu và thức ăn chăn nuôi, thuỷ sản Các bước xác định chất melamine gồm định tính bằng phương pháp ELISA hoặc HPLC-UV với giới hạn phát hiện < 2,5 ppm và định lượng khi có kết quả dương tính ở bước 1 bằng LC-MS hoặc GC-MS (Hà Yên, 2008)

Bảng 2.2 12 cơ sở y tế được kiểm nghiệm melamine

Số

TT

1 Trung tâm Kiểm tra vệ sinh thú y TW II -

Cục Thú y - Bộ NN-PTNT

521/1 Hoàng Văn Thụ, phường 4, Tân Bình, TP.HCM

2 Trung tâm Chất lượng, ATVS và thú y thuỷ

sản vùng 4 - Cục Quản lý chất lượng Nông

lâm sản và Thuỷ sản - Bộ NN-PTNT

Số 30 Hàm Nghi, phường Bến Nghé, quận 4, TP.HCM

3 Trung tâm Kiểm nghiệm VSATTP - Viện

Dinh dưỡng - Bộ Y tế

48B Tăng Bạt Hổ, Hà Nội

4 Trung tâm Kiểm nghiệm VSATTP - Viện

Pasteur Nha Trang

8-10 Trần Phú, Nha Trang, Khánh Hòa

5 Phòng Kiểm nghiệm lý hoá vi sinh - Viện

Pasteur TP.HCM

167 Pasteur, phường 8, quận 3, TP.HCM

6 Phòng Kiểm nghiệm - LHKH sản xuất công

nghệ sinh học và môi trường - Viện CNSH

Nhà A15, 18 Hoàng Quốc Việt, Cầu Giấy, Hà Nội

7 Trung tâm Kỹ thuật Tiêu chuẩn Đo lường

Chất lượng 3 - Tổng cục Tiêu chuẩn Đo

lường Chất lượng - Bộ KHCN

Số 31, Hàn Thuyên, quận 1, TP.HCM

8 Phòng Giám định hoá pháp lý - Viện Khoa

học Hình sự - Bộ Công an

99 Nguyễn Tuân, Thanh Xuân, Hà Nội

9 Trung tâm Phân tích và Giám định Thực

phẩm Quốc gia - Viện Công nghiệp Thực