Nghiên cứu xác định dư lượng tetrmethrin, permethrin, phenothrin và fenvalerate trong nước nuôi trồng thủy sản ở huyện châu phú an giang bằng phương pháp sắc ký khí ghép khối phổ (GC MS)

Việc phân loại còn có thể dựa trên bản chất của tương tác giữa chất phân tích và pha tĩnh thí dụ như sắc ký hấp phụ sắc ký pha thường khác sắc ký phân bố sắc ký pha đảo ở chỗ chất phân t

AN GIANG BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ KHÍ GHÉP

KHỐI PHỔ (GC/MS)

LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC

NGHỆ AN, 2014

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC VINH



PHAN HỒNG SẮC

NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH DƯ LƯỢNG TETRMETHRIN, PERMETHRIN, PHENOTHRIN VÀ FENVALERATE TRONG NƯỚC NUÔI TRỒNG THỦY SẢN Ở HUYỆN CHÂU PHÚ –

Để hoàn thành luận văn này, tôi luôn nhận được sự giúp đỡ, hỗ trợ về kiến thức chuyên môn, sự động viên về tinh thần của các thầy cô, các bạn bè đồng nghiệp và gia đình

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành đến:

- Thầy PGS.TS NGUYỄN HOA DU, thầy là người hướng dẫn khoa học đã tận

tình giúp đỡ tôi, cung cấp cho tôi nhiều kiến thức quý báu, luôn quan tâm, nhắc nhở

và giúp đỡ tôi rất nhiều để tôi có thể vượt qua được những khó khăn và hoàn thành luận văn này

- Các thầy cô trong khoa Hóa đã giúp đỡ, đóng góp cho tôi nhiều ý kiến quý báu để tôi thuận lợi hoàn thành luận văn này

Tôi cũng xin chân thành cám ơn: Ban giám đốc, các anh ở Phòng phân tích

thử nghiệm - Trung tâm Kỹ thuật thí nghiệm và Ứng dụng KHCN - Sở KH & CN Đồng Tháp, đã nhiệt tình giúp đỡ, hướng dẫn, đóng góp nhiều ý kiến quý báu cho tôi trong suốt quá trình học tập và hoàn thành luận văn này

An Giang, tháng 10 năm 2014 Học viên thực hiện

PHAN HỒNG SẮC

Trang Trang phụ bìa

Lời cảm ơn

Mục lục

Danh mục các kí hiệu, các chữ cái viết tắt

Danh mục các bảng

Danh mục các hình vẽ, đồ thị

MỞ ĐẦU 1

1 Lý do chọn đề tài 1

2 Mục đích nghiên cứu 2

3 Mục tiêu nghiên cứu 2

4 Nội dung nghiên cứu 3

Chương 1: TỔNG QUAN 4

1.1 SƠ LƯỢC VỀ THUỐC BVTV HỌ PYRETHROID. 4

1.1.1 Đặc điểm chung 4

1.1.2 Cơ chế tác động 4

1.2 TỔNG QUAN VỀ CÁC HỢP CHẤT CẦN NGHIÊN CỨU 5

1.2.1 Cấu tạo và tính chất của tetramethrin 5

1.2.2 Cấu tạo và tính chất của phenothrin 5

1.2.3 Cấu tạo và tính chất của permethrin 6

1.2.4 Cấu tạo và tính chất của fenvalerate 7

1.3 TÌNH HÌNH SỬ DỤNG CÁC CHẤT BVTV NHÓM PYRETHROID TRONG NÔNG NGHIỆP VÀ NTTS 8

1.3.1 Sử dụng các pyrethroid trong nông nghiệp 8

1.3.2 Sử dụng các pyrethroid trong NTTS 8

1.4.2 Phương pháp sắc ký khí 10

1.4.3 Sắc ký khí ghép khối phổ (GC-MS) 15

1.4.4 Phương pháp sắc kỷ lỏng hiệu năng cao (HPLC) 15

1.4.5 Phương pháp sắc kỷ lỏng ghép khối phổ (LC/MS) 16

1.5 CHIẾT PHA RẮN VÀ ỨNG DỤNG TRONG XỬ LÝ MẪU 17

1.5.1 Khái niệm chiết pha rắn 17

1.5.2 Cấu tạo cột SPE 18

1.5.3 Các bước tiến hành trong quá trình chiết pha rắn 18

1.5.4 Chọn cơ chế SPE theo mẫu phân tích 20

1.6 CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH DƯ LƯỢNG BVTV HỌ CÚC TỔNG HỢP 21

1.6.1 Phương pháp phân tích để xác định Pyrethrins và pyrethroid trong mẫu môi trường 21

1.6.2 Phương pháp GC –MS kết hợp với SPE và SPME để xác định thuốc trừ sâu trong các mẫu nước 26

1.6.3 Phân tích dư lượng thuốc trừ sâu trong mật ong bằng phương pháp sắc ký khí ghép khối phổ 27

1.6.4 Phân tích dư lượng thuốc trừ sâu trong trái cây bằng phương pháp chiết vi sóng - vi chiết pha rắn kết hợp với sắc ký khí ghép khối phổ 27

1.6.5 Phương pháp sắc ký khí đầu dò bắt điện tử và sắc ký khí ghép khối phổ kết hợp với chiết pha rắn để xác định dư lượng thuốc trừ sâu trong nông sản 27

Chương 2: PHƯƠNG PHÁP VÀ THỰC NGHIỆM 29

2.1 DỤNG CỤ, THIẾT BỊ, HÓA CHẤT 29

2.1.1 Dụng cụ và thiết bị 29

2.2 LẤY MẪU VÀ BẢO QUẢN MẪU 30

2.3 XÂY DỰNG QUY TRÌNH XỬ LÝ MẪU NƯỚC TÁCH CÁC HỢP CHẤT THUỐC TRỪ SÂU 32

2.3.1 Khảo sát và tối ưu hoá qui trình chiết pha rắn 32

2.3.2 Khảo sát và tối ưu hóa điều kiện phân tích mẫu trên thiết bị GC-MS 33

2.3.3 Chương trình nhiệt độ 34

Chương 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 35

3.1 Khảo sát dung môi rửa giải 35

3.2 Khảo sát tỉ lệ etylacetate: hexan trong hỗn hợp dung môi rửa giải 37

3.3 Khảo sát thể tích dung môi sử dụng để rửa giải 38

3.4 Khảo sát sự ảnh hưởng của dung môi rửa tạp 39

3.5 Khảo sát ảnh hưởng của tốc độ tải mẫu lên cột 41

3.6 XÂY DỰNG QUY TRÌNH XÁC ĐỊNH ĐỒNG THỜI CÁC THUỐC TRỪ SÂU BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ KHÍ GHÉP KHỐI PHỔ 42

3.6.1 Định danh các chất trên sắc ký đồ 42

3.6.2 Khảo sát độ lặp lại của phép đo 44

3.6.3 Khảo sát khoảng tuyến tính và xây dựng đường chuẩn xác định thuốc trừ sâu 46

3.6.4 Khảo sát giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ) 50

3.6.5 Khảo sát hiệu suất thu hồi 53

3.7 Phân tích thuốc trừ sâu trong mẫu thực 58

KẾT LUẬN 60

TÀI LIỆU THAM KHẢO 62

PHỤ LỤC 64

BVTV Bảo vệ thực vật

(Sắc ký khí khối phổ)

( Sắc ký lỏng hiệu năng cao)

(Độ lệch chuẩn tương đối)

Trang

Hình 3.1: Đồ thị biểu diễn hiệu suất thu hồi rửa giải bằng aceton,

Hình 3.2: Đồ thị hiệu suất thu hồi khi kết hợp 2 dung môi rửa giải khác

Trang

Bảng 1.1 Phương pháp phân tích để xác định Pyrethrins và pyrethroid

Bảng 3.1: Hiệu suất thu hồi khi rửa giải bằng aceton, etylacetate, hexan và

Bảng 3.2: Hiệu suất thu hồi khi kết hợp 2 dung môi khác nhau để rửa giải 36

Bảng 3.5: Ảnh hưởng của dung môi rửa tạp methanol:nước đến hiệu suất

Bảng 3.20: Hiệu suất thu hồi của tetramethrin ở nồng độ 0.25 mg/L 54

MỞ ĐẦU

1 Lý do chọn đề tài:

Theo thống kê của Tổ chức y tế thế giới, mỗi năm con người đã sử dụng hàng chục triệu tấn thuốc bảo vệ thực vật các loại bao gồm thuốc trừ sâu, thuốc diệt nấm, diệt cỏ Ngoài một phần thuốc có tác dụng diệt trừ các loài địch hại mùa màng, phần lớn khối lượng thuốc còn lại được đưa vào môi trường Dưới tác động của nước tưới, nước mưa, gió, … dư lượng thuốc bảo vệ thực vật bị phát tán vào môi trường, rửa trôi đến kênh rạch, sông hồ làm ô nhiễm nguồn nước ngọt, phần khác sẽ ngấm vào đất hay tích tụ trong các loài thực vật, động vật, trong các nông sản thực phẩm thu hoạch từ các vùng bị ô nhiễm Đối với con người, thuốc bảo vệ thực vật có thể ảnh hưởng trực tiếp gây ngộ độc mãn tính, ngộ độc cấp tính dẫn đến tử vong hoặc làm biến đổi gen gây nên các bệnh

về di truyền ảnh hưởng đến nhiều thế hệ sau Do tác hại to lớn này trong nhiều năm trở lại đây vấn đề ô nhiễm thuốc bảo vệ thực vật luôn được quan tâm nghiên cứu

Với sự phát triển cao của khoa học công nghệ các loại thuốc bảo vệ thực vật ngày nay vô cùng phong phú và đa chủng loại Trong thực tế sản xuất, để chống lại sự kháng thuốc của các loài địch hại, người nông dân thường sử dụng cùng một lúc nhiều loại thuốc bảo vệ thực vật khác nhau, chẳng hạn đối với thuốc trừ sâu người dân có thể sử dụng các loại thuốc lân hữu cơ, pyrethroid hoặc carbamate trong cùng một mùa vụ Vì vậy việc xác định tồn lượng các thuốc bảo

vệ thực vật trong môi trường ngày nay thường được phát triển theo hướng xác định đồng thời nhiều nhóm thuốc bảo vệ thực vật có thể có trong cùng một mẫu Điều này có một ý nghĩa lớn, đáp ứng yêu cầu thực tế và tiết kiệm được thời gian, hoá chất

Việt Nam là một trong những nước có ngành nuôi trồng thủy sản phát triển nhanh và có thị phần xuất khẩu khá lớn Song nhiều năm gần đây, những thị trường nhập khẩu thủy sản Việt Nam luôn đặt vấn đề về an toàn đối với thủy sản Việt Nam do lo ngại có tồn dư các chất độc hại từ việc canh tác, nuôi trồng và từ

ô nhiễm môi trường

Vì vậy, để bảo đảm sản phẩm thủy sản an toàn thực phẩm cho người tiêu dùng và phù hợp thị trường xuất khẩu, việc nghiên cứu, theo dõi dư lượng các chất độc hại trong môi trường thủy sản và đề ra biện pháp nuôi thủy sản an toàn chất lượng là cần thiết

Từ tình hình nêu trên, đề tài "Nghiên cứu xác định dư lượng tetramethrin,

permethrin, phenothrin và fenvalerate trong nước nuôi trồng thủy sản ở huyện Châu Phú - An Giang bằng phương pháp sắc ký khí ghép khối phổ (GC/MS)"

được tôi lựa chọn làm đề tài nghiên cứu của luận văn tốt nghiệp cao học chuyên ngành Hóa phân tích

2 Mục đích nghiên cứu:

Xây dựng phương pháp phân tích đồng thời và có số liệu đánh giá tình hình tồn dư một số thuốc BVTV nhóm pyrethroid trong các vực nước nuôi trồng thủy sản ở vùng Châu Phú tỉnh An Giang

3 Mục tiêu nghiên cứu:

+ Xây dựng được kế hoạch khảo sát và lấy mẫu đúng kỹ thuật, thỏa mãn các yêu cầu

+ Thiết lập được phương pháp phân tích đảm bảo độ chính xác, độ hội tụ,

độ nhạy cao, xác định được LOD và LOQ của phương pháp

+ Đưa ra được quy trình xử lý mẫu đảm bảo yêu cầu phân tích

+ Xác định được dư lượng các chất tetramethrin, permethrin, phenothrin

và fenvalerate trong các mẫu nước

+ Đánh giá được tình hình tồn dư các chất tetramethrin, permethrin, phenothrin và fenvalerate trong các mẫu nước nuôi trồng thủy sản

4 Nội dung nghiên cứu

+ Nghiên cứu xây dựng và đánh giá phương pháp phân tích trên thiết bị GC-MS

+ Nghiên cứu các điều kiện xử lý mẫu phân tích để tách chất phân tích + Xác định hàm lượng các dư lượng chất phân tích trong các mẫu nước

+ Xử lý số liệu đánh giá ý nghĩa các số liệu thu được

Chương 1TỔNG QUAN1.1 SƠ LƯỢC VỀ THUỐC BVTV HỌ PYRETHROID [3], [7]

Đây là các hợp chất có tác dụng chọn lọc cao, ít độc hại với côn trùng có ích và trừ được các chủng sâu kháng thuốc lân, clo và carbamate Pyrethroid hoà tan nhanh trong lipit, lipoprotein nên có tác dụng tiếp xúc và vị độc mạnh, không gây tác dụng nội hấp và xông hơi Thuốc gây hiện tượng choáng độc nhanh, có phổ trừ sâu rộng diệt được nhiều loại sâu bọ và côn trùng Khả năng gây độc của pyrethroid với người và động vật máu nóng thấp nhưng lại rất độc hại với cá và các loài thủy sinh

1.1.2 Cơ chế tác động

Các hoạt chất thuộc nhóm Cúc tổng hợp tác động mạnh đến tế bào thần kinh trung ương và ngoại vi, nó phá vỡ sự vận chuyển các xung động thần kinh của động vật, làm cho sinh vật bị co thắt giãy giụa và chết Khi mới trúng độc nó

sẽ tác động vào hốc P và Retizius có trong tế bào thần kinh, kích thích hoạt động của các cơ làm côn trùng mất khả năng giữ thăng bằng, gây thiếu ôxy cho các tế bào thần kinh

Trong cơ thể động vật máu nóng, cúc tổng hợp bị phân huỷ và thải ra bên ngoài nên không gây tích luỹ trong cơ thể.

1.2 TỔNG QUAN VỀ CÁC HỢP CHẤT NGHIÊN CỨU [1], [3]

1.2.1 Cấu tạo và tính chất của tetramethrin

Các tên tương ứng: 2,2-Dimethyl-3-(2-methyl-1 propenyl) cyclopropane

carboxylic acid (1,3,4,5,6,7-hexahydro-1,3-dioxo-2H-isoindol-2-yl)methyl ester; hoặc N-(3,4,5,6-tetrahydrophthalimide) methylcis,trans-chrysanthemate; N-

(chrysanthemoxymethyl)-1-cyclohexene-1,2- dicarboximide; phthalthrin

Công thức cấu tạo:

miệng là 1000mg/kg

1.2.2 Cấu tạo và tính chất của phenothrin

Các tên tương ứng: 3-phenoxybenzyl-(1R)-cis,trans -2 ,2- dimethyl

Công thức cấu tạo:

Công thức phân tử: C23H26O3;

đối với chuột tiếp xúc qua đường miệng là 5000 mg/kg

1.2.3 Cấu tạo và tính chất của permethrin

Các tên tương ứng: 3 - (2 , 2 - Dichloroethenyl) – 2 , 2 –dimethylcyclo propanecarboxylic acid (3 - phenoxyphenyl) methyl ester; hoặc 3-

cyclopropanecarboxylate; m-phenoxybenzyl

(±)-cis,trans-3-(2,2-dichlorovinyl)-2,2-dimethylcyclopropanecarboxylate

Công thức cấu tạo:

khối lượng phân tử: 391.29; nhiệt độ nóng chảy: 63 - 650C; nhiệt độ sôi:

Tính chất: permethrin tinh khiết là những tinh thể không màu ở nhiệt độ

qua đường miệng là 430-470mg/kg

1.2.4 Cấu tạo và tính chất của fenvalerate

Các tên tương ứng: 4-Chloro-α-(1-methylethyl)benzeneacetic acid cyano (3-phenoxyphenyl) methyl ester; hoặc α-cyano-3-phenoxybenzyl- α-(4-chlorophenyl) isovalerate; cyano (3-phenoxyphenyl) methyl 4-chloro-α-(1-

α-cyano-3-phenoxybenzyl-2-(4-chlorophenyl)-3-methylbutyrate; phenvalerate

Công thức cấu tạo:

Tính chất: là chất lỏng sệt màu vàng nâu, phân huỷ nhanh ở môi trường

1.3 TÌNH HÌNH SỬ DỤNG CÁC CHẤT BVTV NHÓM PYRETHROID TRONG NÔNG NGHIỆP VÀ NTTS [10]

1.3.1 Sử dụng các pyrethroid trong nông nghiệp

Việt Nam là một nước sản xuất nông nghiệp, mỗi năm sử dụng khoảng 9 triệu tấn hóa chất thuộc 500 loại thuốc khác nhau Trong đó chủ yếu là thuốc trừ sâu ngoài ra còn có thuốc trừ cỏ, trừ bệnh,… được nhập từ nước ngoài để bảo vệ mùa màng

Ở nước ta, thuốc trừ sâu sử dụng ngày càng nhiều Lượng và loại thuốc bảo vệ thực vật (BVTV) bắt đầu tăng từ những năm 1970, đặc biệt tăng nhanh từ cuối những năm 1980 đến 2010 Từ chỗ chỉ có 77 loại hoạt chất được cho phép

sử dụng năm 1991, đến năm 2010 có 437 thuốc trừ sâu, 304 thuốc diệt nấm và

160 thuốt diệt cỏ được cho phép sử dụng Trong hai thập niên này số lượng thuốc BVTV nhập khẩu tăng từ 20.300 lên 72.560 tấn Người nông dân vẫn sử dụng các thuốc trừ sâu thuộc gốc chlor hữu cơ và lân hữu cơ, tuy nhiên xu hướng sử dụng nhóm cúc tổng hợp ngày càng gia tăng Một vài loại thuốc đã cấm sử dụng tuy nhiên vẫn còn phát hiện

1.3.2 Sử dụng các pyrethroid trong NTTS

Theo Tổng cục Thủy sản, trong năm 2011, nhiều vùng nuôi trồng thủy sản trong cả nước, đặc biệt các tỉnh ven biển Đồng bằng sông Cửu Long đã xảy ra dịch bệnh, gây tổn thất kinh tế nghiêm trọng Kết quả nghiên cứu xác định một trong những nguyên nhân chính gây hội chứng hoại tử gan tụy, gây tôm chết hàng loạt là so sử dụng thuốc bảo vệ thực vật có thành phần hoạt chất nhóm cúc tổng hợp để diệt cá tạp, giáp xác trong vùng nuôi tôm [10]

Theo kết quả nghiên cứu, các thuốc bảo vệ thực vật có các hoạt chất thuộc nhóm Pyrethroid rất độc với cá, tôm và các loài thủy sinh vật khác Để vụ nuôi trồng thủy sản tiếp theo có hiệu quả, Tổng cục Thủy sản đề nghị Sở Nông nghiệp

và Phát triển nông thôn các tỉnh, thành phố thực hiện các giải pháp sau: Nghiêm cấm sử dụng các loại thuốc bảo vệ thực vật trong nuôi trồng thủy sản, Tổng cục Thủy sản đã trình lên Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn văn bản cấm sử dụng các sản phẩm diệt giáp xác dùng trong nuôi trồng thủy sản có chứa thành phần thuốc trừ sâu nhóm cúc

1.4 CÁC PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ PHÂN TÍCH DƯ LƯỢNG BVTV [2],

[4], [5], [9]

1.4.1 Đại cương về phương pháp phân tích sắc ký

Sắc ký là phương pháp tách các chất dựa vào sự phân bố khác nhau của chúng giữa hai pha động và tĩnh Mức độ tương tác với các pha phụ thuộc vào tính chất của chất phân tích tương ứng với tính chất của chúng Các loại lực tương tác bao gồm tương tác van der Waals, lưỡng cực- lưỡng cực, lưỡng cực- lưỡng cực cảm ứng, tĩnh điện Chất phân tích tương tác càng mạnh với pha tĩnh thì càng di chuyển chậm và sẽ bị rửa giải ra sau Trong quá trình chuyển động dọc theo cột sắc ký chất phân tích sẽ gặp hết lớp pha tĩnh này đến lớp pha tĩnh khác, cân bằng hấp phụ/ giải hấp phụ diễn ra nhiều lần Nhờ đặc điểm này mà người ta có thể tách các chất trong hỗn hợp, số lần xảy ra cân bằng trong cột càng nhiều thì khả năng phân tách các chất phân tích có tính chất gần nhau càng cao

Phân loại sắc ký: trạng thái vật lý khác nhau của pha động (lỏng hay khí) dẫn đến sự khác nhau cơ bản về thiết bị, từ đó người ta phân sắc ký thành hai loại, sắc ký lỏng (Liquid Chromatography-LC) và sắc ký khí (Gas

Chromatography- GC) Việc phân loại còn có thể dựa trên bản chất của tương tác giữa chất phân tích và pha tĩnh thí dụ như sắc ký hấp phụ (sắc ký pha thường) khác sắc ký phân bố (sắc ký pha đảo) ở chỗ chất phân tích tương tác tại những vị trí xác định trên pha tĩnh; hay trong sắc ký trao đổi ion cơ chế tương tác chính là lực hút tĩnh điện trên pha tĩnh; hay trong sắc ký trao đổi ion cơ chế tương tác chính là lực hút tĩnh điện trên pha tĩnh giữa các điểm điện tích trên pha tĩnh và ion trái dấu với nó trong pha động, trong khi với sắc ký loại trừ theo kích thước các chất được tách khỏi nhau dựa vào sự khác nhau của kích thước phân tử.

So sánh giữa sắc ký khí và sắc ký lỏng: sắc ký khí có khả năng tách rất cao nhờ số đĩa lý thuyết của cột sắc ký khí cao hơn rất nhiều so với sắc ký lỏng (vài trăm ngàn đĩa so với vài ngàn đĩa) Ngược lại, ưu điểm của sắc ký lỏng là có nhiều loại cột, có thể cho nhiều tương tác khác nhau và người ta có thể điều chỉnh sự lưu giữ hay độ chọn lọc thông qua thành phần pha động trong khi điều này không thể thực hiện được với pha động là khí mang Sắc ký lỏng có thể áp dụng cho tất cả các chất, dễ và khó bay hơi, bền nhiệt và không bền nhiệt Sự chọn lựa giữa sắc ký lỏng hoặc sắc ký khí thường dựa trên bản chất của chất phân tích, tuy nhiên nếu có thể dùng cả hai phương pháp sắc ký khí và sắc ký lỏng, sắc ký khí thường được lựa chọn hơn do không tốn dung môi, hiệu năng tách cao hơn, nhất là có độ nhạy cao phù hợp với phân tích lượng vết khi sử dụng với các đầu dò chọn lọc ECD, NPD, khối phổ (Mass Spectrometry- MS),…

1.4.2 Phương pháp sắc ký khí

Phương pháp sắc ký khí thường dùng để phân tích các chất tương đối dễ

C) và bền nhiệt Pha động là các khí trơ

biến nhất hiện nay có nguồn gốc là polysiloxane với các nhóm thế khác nhau để

tạo ra một loạt các pha tĩnh có độ phân cực thay đổi từ không phân cực (polymethylsiloxane), ít phân cực (polymethylphenylsiloxane) đến phân cực (polycyanopropylsiloxane) Với khả năng tách và độ nhạy rất cao cùng với những detector có tính chọn lọc cao, phương pháp GC là một phương pháp phân tích được ứng dụng rộng rãi trong các lĩnh vực phân tích môi trường và an toàn thực phẩm.

1.4.2.1 Cấu tạo máy sắc ký khí.

Gồm có những thành phần chính sau: bình chứa khí mang (carrier gas), bộ phận tiêm mẫu (syringe hoặc Auto sample), buồng tiêm (injector), lò cột (column oven), cột sắc ký (column), đầu dò (detector), và máy vi tính

Buồng tiêm mẫu- Injector

Tại buồng tiêm, mẫu được hoá hơi và theo dòng khí mang vào đầu cột sắc

ký Để đưa mẫu vào buồng tiêm có 2 cách là dùng kim tiêm (syringe) để tiêm tay hoặc bộ tiêm mẫu tự động (auto sampler) Nếu sử dụng cột nhồi, kim tiêm sẽ đưa mẫu trực tiếp vào cột, trong khi ở cột mao quản mẫu phải được hoá hơi trước một phần hay toàn thể lượng hơi mẫu được đưa vào cột tương ứng với 2 cách tiêm chia dòng và không chia dòng

Chỉ một phần nhỏ mẫu được đưa vào cột, phần còn lại được dẫn qua ngã chia dòng và thải ra ngoài theo một tỉ lệ chia dòng đặt trước, tỷ lệ chia dòng cao đảm bảo cột không bị quá tải Sự phân biệt đối xử có thể xảy ra gây bất lợi cho các thành phần của mẫu có nhiệt độ sôi cao hơn, phương pháp này thường sử dụng cho các mẫu có hàm lượng lớn (hơn 1000mg) ta chia bớt chỉ để cho một lượng nhỏ chất phân tích vào cột

● Phương pháp tiêm không chia dòng (spitless injection)

Mẫu được tiêm vào buồng tiêm nóng (nhiệt độ buồng tiêm phải đủ cao để

nhiệt độ sôi của dung môi để tạo hiệu ứng dung môi (solvent effect) nhằm giữ các chất nằm ở đầu cột mà không di chuyển trong thời gian đưa mẫu vào cột (từ 30- 60 giây) Sau thời gian này, ngã chia dòng ngược mở ra và quá trình phân tích bắt đầu cùng với nhiệt độ cột tăng dần Thường thể tích mẫu không quá 2 µL được tiêm vào buồng tiêm để tránh nhiễm bẩn các bộ phận khác

Cột sắc ký (column)

Cột sắc ký được coi là trái tim của máy sắc ký, tại đây các chất trong hỗn hợp được tách ra trước khi đi đến đầu dò Có loại cột sắc ký là cột nhồi và cột mao quản mở Cột nhồi thường ngắn, có dung lượng cao nhưng khả năng tách kém hơn nhiều so với cột mao quản mở (open tubular column) Với việc phân tích đa dư lượng thuốc BVTV trên máy sắc ký khí ta cần một cột có số đĩa lý thuyết rất lớn để có thể tách được đồng thời nhiều chất thì chỉ có cột mao quản mới đáp ứng được yêu cầu này

* Cột mao quản- Capillary column

bền về mặt vật lý rất cao và trơ về mặt hoá học

năng tách người ta có thể chế tạo các cột có chiều dài trên 100m

tubular), WCOT (wall coated open tubular)

● Cột PLOT

dày lớp xốp trong khoảng 5- 50µm

Thành ống mao quản thạch anh được phủ trực tiếp một lớp mỏng pha tĩnh, lớp pha tĩnh thường ở dạng lỏng trong điều kiện phân tích nên đây là dạng sắc ký lỏng- khí Hệ số lưu giữ và dung lượng mẫu của cột tăng khi tăng bề dày của lớp phim pha tĩnh, tuy nhiên hiệu năng cột lại giảm

polymethylsilosane bởi các nhóm phân cực nhƣ phenyl, 3-cyanopropyl, 3,3,3- trifluoropropyl,… tạo ra một loạt pha tĩnh có độ chọn lọc khác nhau

Đầu dò trong sắc ký khí có thể đƣợc chia thành các loại sau:

- Chọn lọc: chỉ cho tính hiệu với một số các hợp chất có cấu trúc đặc biệt nhƣ đầu dò bắt giữ điện tử (ECD), quang hoá ngọn lửa (FPD), nito photpho (NPD), khối phổ (MS) với chế độ giám sát một vài ion (Scan) hay một ion (Sim)

- Phổ phát: cho tín hiệu với hầu hết các hợp chất nhƣ đầu ion hoá ngọn lửa (FID), độ dẫn điện (TCD), MS (khi dùng ở chế độ quét phổ hay Scan)

- Bảo toàn chất phân tích (chất phân tích không biến đổi sau khi ra khỏi đầu dò) nhƣ đầu dò TCD

- Phá huỷ chất phân tích (chuyển hoá thành các chất khác) nhƣ: đầu dò ECD, FPD, FID, NPD, MS

Các nhóm thuốc BVTV nghiên cứu trong đề tài là các hoạt chất có chứa clo, nito, photpho nên cần đầu dò chọn lọc cho các nguyên tố này đó chính là đầu dò MS

1.4.3 Sắc ký khí ghép khối phổ (GC-MS)

Sắc ký khí ghép khối phổ (GC/MS_ Gas Chromatography Mass Spectrometry) là một trong những phương pháp sắc ký hiện đại nhất hiện nay với độ nhạy cao và được sử dụng trong các nghiên cứu và phân tích kết hợp Thiết bị GC/MS được cấu thành hai phần: phần sắc ký (GC) dùng để tách phân tích hỗn hợp và tìm ra các chất cần phân tích, phần khối phổ (MS) mô tả các hợp phần riêng lẻ bằng cách mô tả số khối Bằng sự kết hợp hai kỹ thuật này (GC/MS) các nhà khoa học có thể đánh giá, phân tích định tính và định lượng đối với một số hóa chất

1.4.4 Phương pháp sắc kỷ lỏng hiệu năng cao (HPLC)

1.4.4.1 Cơ sở lý thuyết

HPLC là chữ viết tắt của 04 chữ cái đầu bằng tiếng Anh của phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (High Performance Liquid Chromatography), trước kia gọi là phương pháp sắc ký lỏng cao áp (High Pressure Liquid Chromatography)

Phương pháp này ra đời từ năm 1967-1968 trên cơ sở phát triển và cải tiến từ phương pháp sắc ký cột cổ điển Hiện nay phương pháp HPLC ngày càng phát triển và hiện đại hóa cao nhờ sự phát triển nhanh chóng của ngành chế tạo máy phân tích Hiện nay nó áp dụng rất lớn trong nhiều ngành kiểm nghiệm đặc biệt là ứng dụng cho ngành kiểm nghiệm thuốc Và nó hiện là công cụ đắc lực trong phân tích các thuốc đa thành phần cho phép định tính và định lượng

Theo cơ chế chia tách một hỗn hợp phụ thuộc vào tính chất động học của chất hấp phụ của sắc ký, người ta phân ra các loại sau đây:

- Sắc ký hấp phụ (NP-HPLC và RP-HPLC)

- Sắc ký phân bố - sắc ký chiết (LLC).

- sẳc ký trao đổi ion (IE-HPLC)

- Sắc ký rây phân tử - sắc ký gel (IG-HPLC)

Ưu điểm của HPLC:

- Điều kiện phân tích khá dễ dàng

- Dễ dàng thu hồi chất phân tích với độ tinh khiết cao

- Độ lặp lại cao

- Thường không phân hủy mẫu

1.4.4.2 Nguyên tắc của quá trình sắc ký trong cột

Sắc ký lỏng hiệu năng cao là một phương pháp chia tách trong đó pha động là chất lỏng và pha tĩnh chứa trong cột là chất rắn đã được phân chia dưới dạng tiểu phân hoặc một chất lỏng phủ lên một chất mang rắn, hay một chất mang đã được biến đổi bằng liên kết hóa học với các nhóm chức hữu cơ Quá trình sắc ký lỏng dựa trên cơ chế hấp thụ, phân bố, trao đổi ion hay phân loại theo kích cỡ (Rây phân tử) Quá trình sắc ký dựa trên sự hấp phụ mạnh, yếu khác nhau của pha tĩnh đối với các chất tan và sự rửa giải (phản hấp phụ) của pha động để kéo chất tan ra khỏi cột

1.4.5 Phương pháp sắc kỷ lỏng ghép khối phổ (LC/MS)

1.4.5.1 Sơ lược về LC/MS

Sắc ký lỏng khối phổ là kỹ thuật phân tích có sự kết hợp khả năng phân tách các chất trong hỗ hợp của bộ phận sắc ký lỏng hiệu năng cao (High performance liquid chromatography – HPLC) và khả năng phân tích số khối (m/z) của bộ phận khối phổ (Mass spectrometry – MS)

Dựa vào máy phân tích khối phổ (Mass analyser), hệ thống LC/MS có: Tứ cực, bẫy ion, ống đo thời gian bay.

1.4.5.2 Nguyên tắc hoạt động của LC/MS

Tương tự như hệ thống HPLC thông thường, có vai trò phân tách các chất dựa vào tính chất lý hóa của chúng Hệ thống HPLC bao gồm: Bình chứa pha động, bơm cao áp, tiêm mẫu, cột phân tích và detector, tuy nhiên hệ thống HPLC của thiết bị LC/MS có một số đặc điểm khác:

- Pha động có thể là dung môi hữu cơ hoặc đệm Nếu pha động là đệm thì thường là đệm có khả năng bay hơi như amoniacetat, formic…

- Pha động khi ra khỏi cột phân tích thường qua bộ phận chia dòng để chỉ có một lượng nhất định (< 50ml/phút) vào MS, tránh lượng dung môi quá nhiều vào MS gây bẩn và hỏng máy

- Detector có thể coi MS là một detector, tuy nhiên có thể nối thêm các detector khác như UV, FR… để hỗ trợ trong phân tích

1.5 CHIẾT PHA RẮN VÀ ỨNG DỤNG TRONG XỬ LÝ MẪU [6], [8]

1.5.1 Khái niệm chiết pha rắn

Chiết pha rắn (SPE) là một phương pháp chuẩn bị mẫu để làm giàu và làm sạch mẫu phân tích từ dung dịch bằng cách cho chất cần phân tích hấp phụ lên một cột pha rắn sau đó chất phân tích sẽ được rửa giải bằng dung môi thích hợp

Cơ chế của quá trình lưu giữ bao gồm phân bố pha đảo, pha thường và trao đổi ion

Ưu điểm của phương pháp SPE là khả năng làm giàu mẫu cao, giúp loại

bỏ ảnh hưởng của các chất gây nhiễu, qui trình thực hiện dễ tự động hoá, phù

hợp với phân tích sắc ký và giảm lượng dung môi sử dụng so với phương pháp chiết lỏng - lỏng.

1.5.2 Cấu tạo cột SPE

Cột SPE có nhiều dạng nhưng loại thường sử dụng là những cột nhỏ có dạng thân ống tiêm, bên trong nhồi các pha tĩnh Pha tĩnh nhồi vào cột chiếm bề dày cột khoảng 0.5 - 2cm, lượng sử dụng từ 100mg đến 1g, trong một số trường hợp có thể lên đến vài gram Trong cột có 2 đĩa thủy tinh xốp giúp giữ chất tách không cho rơi theo dung môi để giữ cho cột ổn định

Cột SPE có 3 loại:

- Loại chứa các pha tĩnh như C18, C8, C4, C2, cyclophenyl là silic ghép các nhánh không phân cực để tách các chất không phân cực hay ít phân cực

- Loại chứa các chất tách như silica, florisil, amino alumina, có ghép các

Phần lớn được sử dụng để tách chiết trong điều kiện pha thường (cột ghép –CN

có thể sử dụng trong pha đảo)

- Loại chứa nhựa trao đổi ion để tách các hợp chất ion (cột SAX tách anion, cột SCX tách cation)

1.5.3 Các bước tiến hành trong quá trình chiết pha rắn

Bước 1: Hoạt hoá pha tĩnh

Cho dung môi thích hợp chảy qua pha tĩnh để thấm ướt vật liệu nhồi và để solvat hoá các nhóm chức của chất hấp phụ, đồng thời loại bỏ không khí và các chất bẩn trong cột

Để hoạt hoá cột có thể sử dụng hai dung môi có khả năng chiết tách mạnh:

- Dung môi 1: có khả năng chiết tách mạnh hơn hay bằng khả năng chiết tách của dung môi sẽ được sử dụng cuối cùng để rửa giải hết các chất phân tích

ra khỏi cột

- Dung môi 2: được sử dụng tiếp theo, là dung môi có khả năng tách chiết yếu hơn, hoà tan dễ dàng trong dung môi ban đầu đã được sử dụng Dung môi 2 này có khả năng chiết tách gần bằng dung môi 3 (dung môi để hoà tan hỗn hợp chất phân tích)

Trong quá trình hoạt hoá cột không được để cột bị khô dung môi

Bước 2: Cho mẫu chảy qua cột

Hoà tan mẫu phân tích vào dung môi 3 (dung môi 3 phải có khả năng chiết tách yếu đối với chất phân tích được giữ lại trên cột SPE) rồi dội mẫu qua cột

Trong quá trình này chất phân tích được giữ lại trên cột Dung môi và phần lớn tạp chất được rút từ từ ra khỏi cột dưới tác dụng của áp suất thấp tạo bởi bơm chân không

Bước 3: Rửa các tạp chất gây ảnh hưởng ra khỏi cột

Quá trình này sẽ loại bỏ tạp chất ra khỏi cột nhưng vẫn giữ lại chất phân tích Nếu mẫu hoà tan trong nước thì nên sử dụng dung dịch đệm hoặc hỗn hợp nước dung môi hữu cơ Nếu mẫu hoà tan trong dung môi hữu cơ thì khi rửa cột

có thể sử dụng chính dung môi đó

Bước 4: Giải hấp chất phân tích khỏi cột

Tách từ từ cấu tử các phân tích ra khỏi cột bằng dung môi 1 hoặc những dung môi thích hợp có khả năng chiết tách mạnh dần lên Trường hợp dung môi dùng để giải hấp không tan trong dung môi đã sử dụng để rửa tạp thì phải rút chân không nhẹ để làm khô cột trước khi cho dung môi giải hấp vào

Về nguyên tắc không nên sử dụng dung môi có khả năng chiết tách quá mạnh vì có thể lôi kéo theo cả những chất không mong muốn trong quá trình giải hấp Ngược lại nếu khả năng chiết tách của dung môi quá yếu thì sẽ phải sử dụng một lượng dung môi lớn mới có thể giải hấp hết các chất phân tích trên cột.

1.5.4 Chọn cơ chế SPE theo mẫu phân tích

1.5.4.1 Cơ chế SPE cho phép phân tích mẫu trong dung môi nước:

Sơ đồ 1.1: Cơ chế SPE phân tích mẫu trong dung môi nước

1.5.4.2 Cơ chế SPE cho phép phân tích mẫu trong dung môi khác nước

Sơ đồ 1.2: Cơ chế SPE phân tích mẫu trong dung môi khác nước

Bảng 1.1 Phương pháp phân tích để xác định Pyrethrins và pyrethroid trong mẫu môi trường [11]

Phương pháp phân tích

Giới hạn phát hiện mẫu

Tỷ lệ thu hồi

Tài liệu tham khảo

Không dư liệu

ASTM D4861 EMMI 1997

pha loãng với nước; làm sạch trên cột

với ether dầu / ethyl ether Thực

pha loãng với nước; làm sạch trên Florisil cột; rửa giải với một số loại chất eluants-

methylene chloride, hexane, và

CH3CN/nước;

pha loãng với nước; giải hấp với ether dầu khí; làm sạch trên cột Florisil; rửa giải với ether dầu /ethyl ether

chiết với ether dầu khí và methylene chloride;

GC/ECD GC/FPD

1997

fluvalinate,

permethrin

concen - cô đặc

để loại bỏ methylene chloride Thực

và Celite 545;

rửa giải với

CH3CN-benzen

GC/FPD GC/TSD

và bộ lọc; chiết với hexane; rửa bằng NaCl 4% ; làm khô trên

Na2SO4 khan;

bốc hơi đến khô; rửa giải trong hexane;

chiết với

CH3CN; bốc hơi đến khô;

rửa giải trong hexane; làm sạch trên cột Florisil; rửa giải với một hỗn hợp các ete dầu mỏ và ethyl

Na2SO4 khan;

cô đặc; thêm methyl tert- butyl ether

GC/ECD 0.5 µg/L Không có

dữ liệu

EMSL

C 508 EMMI

HPLC/UV 2 µg/L Không có

dữ liệu

EAD

1660 EMMI

GC/NPD 0.004 –

0.012 mg/kg

thêm vào cột Celite; rửa giải

1997

với ether dầu khí; lọc qua bộ lọc 0.5μm Công

thêm cồn, NaOH 0.5N và hồi lưu nhẹ nhàng; cô đặc;

chiết với ether dầu mỏ; chiết với NaOH 0,1N; thêm thuốc thử Deniges và để trong bóng tối;

thêm rượu và kết tủa HgCl với dung dịch NaCl; lọc; thêm HCl loãng;

thêm chloroform và dung dịch ICL

trừ sâu xeton 1997 Công

1997 Công

ethylenedia-chuẩn độ NaOMe 0,1N

Na2SO4 khan, Florisil và

Na2SO4 khan;

rửa với hexan;

rửa giải với acetone; cho bốc hơi đến khô; hòa tan cặn trong carbondisulfid;

1997

Dưới đây dẫn ra một vài thông tin về sử dụng phương pháp GC-MS xác định dư lượng BVTV trong một số loại đối tượng phân tích mà chúng tôi tổng quan qua tài liệu.

1.6.2 Phương pháp GC –MS kết hợp với SPE và SPME để xác định thuốc trừ sâu trong các mẫu nước [16]

Sử dụng kết hợp phương pháp chiết pha rắn (SPE), vi chiết pha rắn (SPME) để làm giàu các loại thuốc trừ sâu khác nhau bao gồm: hợp chất clo hóa,

cơ phosphorus, triazine, pyretroids và chloroacetamides hiện diện trong trong mẫu nước với hàm lượng khác nhau Xác định và định lượng được thực hiện bằng sắc ký khí ghép khối phổ (GC–MS) Phương pháp được tối ưu hóa cho thấy LOQs cỡ ng/L (khoảng 0.2 – 3.5 ng/L), độ chính xác và độ bền chấp nhận được (độ thu hồi trong khoảng 63-104%, RSD từ 4% đến 23%) [16] Đây một phương pháp mới để phân tích mẫu dạng vết, tương tự có thể đạt được bằng cách sử dụng đầu dò ECD, để xác định cấu trúc bởi MS trong việc phân tích một loạt các chất gây ô nhiễm môi trường

Phương pháp này được áp dụng cho các nghiên cứu về phân bố thời gian

và không gian của thuốc trừ sâu trong lưu vực sông Suquía (Córdoba-Argentina) Theo dự kiến, mức cao nhất của hóa chất nông nghiệp đã được quan sát trong khu vực có hoạt động nông nghiệp thâm canh là chất atrazine (tối đa = 433,9 ng/L), alpha-cypermetrine (tối đa = 121,7 ng/L) và endosulfan sulfate (tối đa = 106,7ng/L) chiếm ưu thế [16] Ở thành thị, thuốc trừ sâu phổ biến là alpha-cypermethrine Những kết quả thu hút sự chú ý đến sự cần thiết của chương trình giám sát thuốc trừ sâu trong sông, xem xét cả hai khu vực đô thị và nông thôn

1.6.3 Phân tích dư lượng thuốc trừ sâu trong mật ong bằng phương pháp sắc ký khí ghép khối phổ [17]

Việc xác định hàm lượng các thuốc trừ sâu thuốc nhóm organohalogen, organophosphorous, pyrethroids và organonitrogen trong mẫu mật ong được tiến hành như sau: mẫu mật ong được đồng hoá trong nước rồi chiết lỏng- lỏng với các dung môi acetonitrile, acetone, etyl acetate và dichloromethane Dịch chiết hữu cơ thu được đem đi cô quay rồi hoà tan lại trong etyl acetate và lọc qua giấy lọc PTFE 0.5µm Dịch qua lọc được cho qua cột SPE (Florisil) và rửa giải bằng dung môi etyl acetate: hexan Thổi khô dịch qua cột còn 1ml rồi phân tích bằng GC-MS

Trong các hợp chất thuốc trừ sâu phân tích, có LOD < 0.005mg/l và LOD

≤ 0.01mg/l Khoảng tuyến tính thu được từ 0.01- 2.0mg/l [17]

1.6.4 Phân tích dư lượng thuốc trừ sâu trong trái cây bằng phương pháp chiết vi sóng - vi chiết pha rắn kết hợp với sắc ký khí ghép khối phổ [20]

Nguyên tắc thực hiện: mẫu trái cây được nghiền và chiết vi sóng trong dung môi thích hợp, sau đó được làm sạch bằng phương pháp vi chiết pha rắn (SPME) Dịch sau chiết được phân tích bằng GC-MS

Khoảng tuyến tính 1- 250 µg/kg; giới hạn phát hiện LOD: 14 µg/kg, giới hạn định lượng LOQ: 40 µg/kg [20]

1.6.5 Phương pháp sắc ký khí đầu dò bắt điện tử và sắc ký khí ghép khối phổ kết hợp với chiết pha rắn để xác định dư lượng thuốc trừ sâu trong nông sản [12]

Dư lượng các thuốc trừ sâu họ clo hữu cơ, lân hữu cơ và pyrethroid trong các loại nông sản gồm bột ngũ cốc, trái đào và rau diếp được xác định bằng phép

phân tích GC-ECD, GC-MS theo qui trình sau: mẫu được chiết với dung môi acetone:nước (8:2) sau đó được lọc lấy dịch chiết Dịch chiết được pha loãng theo tỉ lệ 5g mẫu/200ml nước rồi cho qua cột GCB (400mg ENVI-Carb); rửa với ethyl acetate: methanol (8:2) Tiếp tục cho qua cột SAX/PSA (250mg + 250mg); rửa giải bằng ethyl acetate: methanol (8:2) Sau đó cho bay hơi dịch chiết còn 5ml và lấy dịch này tiêm vào máy sắc ký.

Giới hạn phát hiện LOD của phương pháp từ 0.0005-0.004 mg/kg và giới hạn định lượng LOQ từ 0.005-0.01 mg/kg [12]

Chương 2

KỸ THUẬT THỰC NGHIỆM2.1 DỤNG CỤ, THIẾT BỊ, HÓA CHẤT

2.1.1 Thiết bị và dụng cụ

- Hệ thống sắc ký khí ghép khối phổ GCMS-QP2010plus của Shimadzu: Bộ tiêm mẫu tự động (Autosampler), cột sắc ký mao quản SBP 5-ms: 30m × 0,25mm x 0,25m, nguồn ion hóa EI

- Bộ chiết pha rắn SPE

- Cân phân tích (model: CPA224S, hãng sản xuất Sartorius, chính xác đến 0,0001g)

- Máy bơm chân không, máy lắc,

- Các dụng cụ khác như các loại bình định mức, bucher, các loại pipet, micro pipet,

chất nội chuẩn trifluralin được cung cấp từ hãng Merck

- Các dung môi acetone, n-hexan, etylacetate, methanol, dicloromethan, toluen thuộc loại sạch cho sắc ký (chromatography grade)