NGHIÊN cứu xác ĐỊNH dư LƯỢNG một số KHÁNG SINH QUINOLON TRONG nước THẢI CÔNG NGHIỆP dược BẰNG LC MSMS

WWW.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUYNHON BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGUYỄN THỊ HẠNH NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH DƯ LƯỢNG MỘT SỐ KHÁNG SINH QUINOLON TRONG NƯỚC THẢI CÔNG NGHIỆP DƯỢC BẰNG LC- MS/MS LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC HÀ NỘI 2015 Đóng góp PDF GV Nguyễn Thanh Tú WWW.BOIDUONGHOAHOCQUYNHON.BLOGSPOT.COM WWW.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUYNHON BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGUYỄN THỊ HẠNH NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH DƯ LƯỢNG MỘT SỐ KHÁNG SINH QUINOLON TRONG NƯỚC THẢI CÔNG NGHIỆP DƯỢC BẰNG LC- MS/MS LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC CHUYÊN NGÀNH: KIỂM NGHIỆM THUỐC- ĐỘC CHẤT MÃ SỐ : 60720410 Người hướng dẫn khoa học: PGS TS Nguyễn Thị Kiều Anh HÀ NỘI 2015 Đóng góp PDF GV Nguyễn Thanh Tú WWW.BOIDUONGHOAHOCQUYNHON.BLOGSPOT.COM WWW.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUYNHON LỜI CẢM ƠN Em xin bày tỏ lịng kính trọng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS Nguyễn Thị Kiều Anh, người tận tình bảo, đóng góp ý kiến quý báu cho em suốt trình thực hoàn thành luận văn Em xin gửi lời cảm ơn chân thành tới thầy cô, anh chị kỹ thuật viên Bộ mơn Hóa phân tích Độc chất – Trường Đại học Dược Hà Nội, Viện Công nghệ Dược phẩm Quốc gia tạo điều kiện, giúp đỡ em thời gian thực đề tài Em xin cảm ơn quỹ Nafosted tài trợ phần kinh phí để em thực đề tài Cuối cùng, em xin gửi lời cảm ơn tới gia đình bạn bè ln chia sẻ, động viên em hồn thành luận văn Trong q trình thực hiện, nỗ lực cố gắng khơng trách khỏi thiếu sót, em kính mong ý kiến bảo, phê bình q thầy Em xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, tháng năm 2015 Học viên Nguyễn Thị Hạnh Đóng góp PDF GV Nguyễn Thanh Tú WWW.BOIDUONGHOAHOCQUYNHON.BLOGSPOT.COM WWW.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUYNHON MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH ĐẶT VẤN ĐỀ CHƯƠNG TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan kháng sinh nhóm quinolon 1.1.1 Vài nét kháng sinh nhóm quinolon 1.1.2 Đặc tính kháng sinh nghiên cứu 1.2 Kỹ thuật sắc ký lỏng hiệu cao ghép khối phổ 1.2.1 Sắc ký lỏng 1.2.2 Khối phổ 1.2.3 Một số kỹ thuật ghi phổ 11 1.2.4 Ứng dụng sắc ký lỏng lần khối phổ 12 1.2.5 Kỹ thuật chuẩn bị mẫu cho phân tích sắc ký 12 1.3 Một số nghiên cứu xác định hàm lượng Quinolon nước thải 13 CHƯƠNG ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 15 2.1 Đối tượng nghiên cứu 15 2.2 Phương tiện nghiên cứu 15 2.2.1 Hóa chất - thuốc thử - chất chuẩn 15 2.2.2 Thiết bị - dụng cụ 16 2.3 Phương pháp nghiên cứu 16 2.3.1 Phương pháp thu thập xử lý sơ mẫu thử 16 2.3.2 Khảo sát, lựa chọn điều kiện sắc ký 17 2.3.3 Khảo sát phương pháp xử lý mẫu 18 Đóng góp PDF GV Nguyễn Thanh Tú WWW.BOIDUONGHOAHOCQUYNHON.BLOGSPOT.COM WWW.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUYNHON 2.3.4 Thẩm định phương pháp 18 2.3.5 Ứng dụng phân tích mẫu thực 20 2.3.6 Phương pháp xử lý số liệu 20 CHƯƠNG KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 21 3.1 Xây dựng quy trình phân tích 21 3.1.1 Khảo sát điều kiện đo khối phổ 21 3.1.2 Khảo sát điều kiện sắc ký 23 3.1.3 Xây dựng quy trình xử lý mẫu 29 3.1.4 Quy trình phân tích 33 3.2 Đánh giá phương pháp 35 3.2.1 Độ thích hợp hệ thống 35 3.2.2 Tính đặc hiệu phương pháp 36 3.2.3 Độ tuyến tính 39 3.2.4 Độ độ lặp lại phương pháp 40 3.2.5 Giới hạn phát giới hạn đ ịnh lượng 43 3.3 Ứng dụng quy trình, xác định dư lượng kháng sinh có nước thải cơng nghiệp dược 46 CHƯƠNG BÀN LUẬN 48 4.1 Về phương pháp xử lý mẫu 48 4.2 Về phương pháp phân tích 48 4.3 Về thẩm định phương pháp 50 4.4 Về ứng dụng phương pháp 51 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 53 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC Đóng góp PDF GV Nguyễn Thanh Tú WWW.BOIDUONGHOAHOCQUYNHON.BLOGSPOT.COM WWW.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUYNHON DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT ACN Acetonitril MeOH MOXI OFLO CIP NOR HPLC tR Methanol Moxifloxacin Ofloxacin Ciprofloxacin Norfloxacin Sắc kí lỏng hiệu cao (High performance liquid chromatography) Sắc kí lỏng khối phổ (High performance liquid chromatography –Mas Spectrometry) Thời gian lưu S Diện tích pic TB Trung bình RSD Độ lệch chuẩn tương đối IS Chuẩn nội (Internal Standard) LOD Giới hạn phát (Limit of detection) LOQ Giới hạn định lượng (Limit of quantitation) AOAC Association of Official Agricultủal Chemists PA Tinh khiết phân tích (Pure analysis) API Ion hóa áp suất khí (Atmospheric Pressure Ionization) ESI Ion hóa tia điện (Electrospray Ionizaton) APCI Ion hoá hoá học áp suất khí (Atmospheric Pressure Chemical Ionization) APPI Ion hóa photon áp suất khí (Atmospheric Pressure Photoionization) Dược điển Mỹ 38 (The United States Pharmacopoeia) (bản online) HPLC-MS USP 38 Đóng góp PDF GV Nguyễn Thanh Tú WWW.BOIDUONGHOAHOCQUYNHON.BLOGSPOT.COM WWW.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUYNHON DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1: Phân loại phổ tác dụng kháng sinh nhóm Quinolon 48 Bảng 1.2: Cấu trúc hóa học tính chất kháng sinh nghiên cứu ……5 Bảng 2.1 : Các hóa chất, thuốc thử, chất chuẩn sử dụng nghiên cứu 15 Bảng 3.1: Điều kiện phân mảnh kháng sinh IS 23 Bảng 3.2 : Hiệu suất chiết kháng sinh thể tích chiết 31 Bảng 3.3: Hiệu suất chiết kháng sinh dùng dung môi rửa giải khác 32 Bảng 3.4 : Kết xác định độ thích hợp hệ thống 36 Bảng 3.5 : Kết khảo sát độ tuyến tính phương pháp 39 Bảng 3.6.a : Kết khảo sát độ phương pháp (mức LQC) 41 Bảng 3.6.b : Kết khảo sát độ phương pháp (mức MQC) 42 Bảng 3.6.c : Kết khảo sát độ phương pháp (mức HQC) 43 Bảng 3.7 : Kết giá trị LOD, LOQ phương pháp 45 Bảng 3.8 : Kết phân tích mẫu nước thải số sở sản xuất 46 Đóng góp PDF GV Nguyễn Thanh Tú WWW.BOIDUONGHOAHOCQUYNHON.BLOGSPOT.COM WWW.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUYNHON DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1: Sơ đồ hệ thống LC- MS Hình 1.2: Sơ đồ tạo ion dương nguồn ESI Hình 1.3: Sơ đồ cấu tạo thiết bị phổ kế tứ cực kiểu chập ba 10 Hình 3.1: Phổ đồ chất phân tích 22 Hình 3.2: Sắc ký đồ phân tích kháng sinh quinolon cột SB- C18 với thể tích tiêm mẫu 1, 5, 10 µl 24 Hình 3.3: Sắc ký đồ phân tích kháng sinh quinolon cột Eclipse- C18 với thể tích tiêm mẫu 5, 10, 20 µl 25 Hình 3.4: Sắc ký đồ kháng sinh quinolon khảo sát tốc độ dòng 0,3; 0,5; 0,6 ml/phút 27 Hình 3.5: Sắc ký đồ kháng sinh quinolon khảo sát pha động 29 Hình 3.6: Sắc ký đồ kháng sinh quinolon khảo sát thể tích chiết 31 Hình 3.7: Biểu đồ hiệu suất chiết dung mơi rửa giải 33 Hình 3.8: Sắc ký đồ xác định độ đặc hiệu 38 Hình 3.9: Sắc ký đồ xác định giá trị LOD, LOQ phương pháp 44 Đóng góp PDF GV Nguyễn Thanh Tú WWW.BOIDUONGHOAHOCQUYNHON.BLOGSPOT.COM WWW.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUYNHON ĐẶT VẤN ĐỀ Thực trạng kháng kháng sinh ngày gia tăng toàn cầu, đặc biệt nước phát triển Việt Nam với gánh nặng bệnh nhiễm khuẩn chi phí bắt buộc cho việc thay đổi kháng sinh cũ kháng sinh Trong kháng sinh đời ngày ít, việc kháng kháng sinh phổ rộng, tác dụng mạnh quinolon, cephalosporin hệ ngày phổ biến đe dọa sức khỏe người Nguyên nhân trình độ dân trí cịn hạn chế, lạm dụng kháng sinh liều cao, kháng sinh mạnh, sử dụng kháng sinh mà khơng có định bác sĩ làm gia tăng tỷ lệ kháng kháng sinh Ngoài ra, lượng kháng sinh tồn dư nước thải sinh hoạt, bệnh viện hay từ công ty sản xuất dược phẩm nguyên nhân quan trọng dẫn tới đề kháng kháng sinh vi khuẩn [7] Theo kết nghiên cứu 19 bệnh viện Hà Nội, thành phố Hồ Chí Minh Hải Phịng (2009- 2010) tình trạng kháng thuốc kháng sinh, tỷ lệ kháng thuốc nhóm cephalosporin hệ 3,4 66-83%, fluoroquinolon 60%, imipenem 35% [9] Theo qui định cục Quản lý Dược nay, cơng ty sản xuất thuốc nói chung cơng ty sản xuất kháng sinh nói riêng muốn sản xuất kháng sinh phải đạt tiêu chuẩn GMP với hệ thống xử lý nước thải Tính từ năm 2009 đến tháng 7/2014, theo số liệu Cục quản lý Dược Việt Nam, số kháng sinh sản xuất nước nhóm quinolon cấp số đăng ký chiếm tỷ lệ tương đối so với kháng sinh nhóm khác Nếu kháng sinh Ciprofloxacin có 49 lượt, Ofloxacin có 31 lượt cấp phép đăng kí sản xuất Cefadroxil có 27 lượt, Metronidazol 37 lượt cấp số đăng kí Tuy vậy, theo quy định hành quy chuẩn kỹ thuật quốc gia môi trường Bộ Tài nguyên Mơi trường năm 2011, lại chưa có quy định giới hạn mức hàm lượng cụ thể kháng sinh nước thải [3] Trong đó, lượng nhỏ tồn dư kháng sinh mơi trường tích tụ lâu ngày làm biến Đóng góp PDF GV Nguyễn Thanh Tú WWW.BOIDUONGHOAHOCQUYNHON.BLOGSPOT.COM WWW.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUYNHON đổi gen vi sinh vật Nguyên nhân góp phần làm gia tăng tỷ lệ kháng kháng sinh nước ta Vì vậy, vấn đề cấp thiết đặt phải có phương pháp xác định dư lượng kháng sinh nước thải công ty sản xuất nhằm hạn chế phát tán kháng sinh môi trường Ở Việt Nam, có vài nghiên cứu xây dựng phương pháp xác định dư lượng kháng sinh nước thải sinh hoạt, bệnh viện hay công ty dược Các nghiên cứu tập trung phân tích, định lượng hàm lượng kháng sinh cụ thể hỗn hợp nhiều kháng sinh Tuy nhiên, chưa có đề tài xác định hàm lượng nhóm kháng sinh quinolon nước thải từ sở sản xuất dược phẩm nhóm kháng sinh sử dụng sản xuất rộng rãi nước ta Vì vậy, cần thiết phải xây dựng phương pháp xác định giúp phát có mặt, với dư lượng kháng sinh hàm lượng thấp nước thải cơng nghiệp dược góp phần giảm thiểu nguy phát tán kháng sinh ngồi mơi trường, từ đó, làm giảm khả kháng kháng sinh Xuất phát từ lý trên, tiến hành đề tài: “Nghiên cứu xác định dư lượng số kháng sinh Quinolon nước thải công nghiệp Dược LC- MS/MS” với mục tiêu sau: Xây dựng phương pháp xác định dư lượng số kháng sinh nhóm quinolon (Moxifloxacin, Ofloxacin, Ciprofloxacin Norfloxacin) có nước thải từ sở sản xuất Dược LC- MS/MS nồng độ ppb Ứng dụng phương pháp xây dựng để xác định dư lượng số kháng sinh quinolon có nước thải từ sở sản xuất Dược nước Đóng góp PDF GV Nguyễn Thanh Tú WWW.BOIDUONGHOAHOCQUYNHON.BLOGSPOT.COM WWW.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUYNHON Nhận xét: Phân tích với mẫu có nồng độ 0,2 ppb Ofloxacin cho đáp ứng S/N = 19,7 nên xác định LOQ Ofloxacin khoảng 0,1ppb Dung dịch Moxifloxacin Ciprofloxacin 0,5ppb cho đáp ứng S/N = 13,2 13,6; xấp xỉ 10 nên xác định LOQ Moxifloxacin Ciprofloxacin khoảng 0,5ppb Với mẫu có nồng độ 0,2 ppb Norfloxacin cho đáp ứng S/N = 3,1 nên LOD kháng sinh khoảng 0,2 ppb LOD LOQ tính theo cơng thức: LOD = LOQ/3,3 Kết giá trị LOD, LOQ kháng sinh là: Bảng 3.7 : Kết giá trị LOD, LOQ phương pháp Kháng sinh LOD (ppb) LOQ (ppb) Moxifloxacin 0,15 0,5 Ofloxacin 0,03 0,1 Ciprofloxacin 0,15 0,5 Norfloxacin 0,2 0,66 Như vậy, xây dựng phương pháp xác định dư lượng kháng sinh Moxifloxacin, Ofloxacin, Ciprofloxacin Norfloxacin phương pháp LC- MS/MS với sử dụng cột Agilent Eclipse XDB- C18 (3,5µm; 3,0 x 150mm), với chương trình gradient hỗn hợp dung môi ACN + 0,1% HCOOC H2O + 0,1 % HCOOH Phương pháp có độ đúng, độ xác từ 72,08% - 114,78%, giới hạn phát từ 0,03 – 0,2 ppb giới hạn định lượng từ 0,1 – 0,66 ppb 45 Đóng góp PDF GV Nguyễn Thanh Tú WWW.BOIDUONGHOAHOCQUYNHON.BLOGSPOT.COM WWW.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUYNHON 3.3 ỨNG DỤNG QUY TRÌNH XÂY DỰNG ĐƯỢC ĐỂ XÁC ĐỊNH DƯ LƯỢNG KHÁNG SINH CĨ TRONG NƯỚC THẢI CƠNG NGHIỆP DƯỢC Trong giai đoạn nghiên cứu, tiến hành lấy mẫu nước thải sở sản xuất dược phẩm vào thời điểm Mẫu lấy bể xử lý nước thải cuối nhà máy, trước đổ môi trường Xử lý mẫu, lọc loại tạp chiết qua cột theo quy trình khảo sát tiến hành sắc ký Thu kết bảng sau: Bảng 3.8 Kết phân tích mẫu nước thải số cơng ty dược phẩm Kháng sinh Moxifloxacin Ofloxacin Tỷ lệ Mẫu SKS/SIS phân tích Ciprofloxacin Norfloxacin Hàm Tỷ lệ Hàm Tỷ lệ Hàm lượng SKS/SIS lượng SKS/SIS lượng (ppb) (ppb) (ppb) 03.08.1.S.01a - - - - - - - 05.08.2.T.02a - - - - - - - 06.08.3.S.03a - - - - - - - 06.08.4.C.04a - - - - - - - 07.08.5.T.05b - 1,01 1,34 0,26 0,73 - - 10.08.5.T.02b - 1,76 2,33 0,48 1,35 - - 10.08.5.C.03b - 0,81 1,07 0,15 0,42 - - 13.08.5.S.04b - 0,39 0,52 - - - - 13.08.5.C.05b - 0,33 0,44 - - - - 14.08.6.S.01b - 0,48 0,64 0,52 1,46 0,18 0,22 17.08.6S.02b - 0,42 0,56 0,72 2,02 - - Chú thích: - : không phát giới hạn phát 46 Đóng góp PDF GV Nguyễn Thanh Tú WWW.BOIDUONGHOAHOCQUYNHON.BLOGSPOT.COM WWW.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUYNHON Các mẫu mã hóa theo định dạng dd.mm.C.t.T với dd: ngày lấy mẫu mm: tháng lấy mẫu C: công ty t: thời gian lấy mẫu ngày với S: lấy mẫu buổi sáng, T: lấy mẫu buổi trưa, C: lấy mẫu buổi chiều T: thứ tự mẫu lấy a: mẫu làm giàu b: mẫu không làm giàu Nhận xét: Sau lấy mẫu nước thải công ty sản xuất dược phẩm, xử lý, lọc loại tạp chiết qua cột để làm mẫu tiến hành sắc ký Kết cho thấy, có mẫu xuất kháng sinh Với mẫu cịn lại, khơng thấy có mặt kháng sinh; tiến hành chiết làm giàu mẫu theo quy trình xử lý mẫu khảo sát; sắc ký mẫu không thấy xuất kháng sinh Trong số mẫu nước thải này, hàm lượng kháng sinh Moxifloxacin nồng độ phát phương pháp Đã phát kháng sinh Ofloxacin mẫu với khoảng nồng độ phát 0,44 – 2,33 ppb Ciprofloxacin xuất mẫu nước thải với khoảng nồng độ phát 0,42 – 2,02 ppb Norfloxacin phát mẫu với nồng độ 0,22 ppb Như vậy, phương pháp xây dựng có tính khả thi, ứng dụng để phân tích kháng sinh Moxifloxacin, Ofloxacin, Ciprofloxacin Norfloxacin nước thải cơng nghiệp dược 47 Đóng góp PDF GV Nguyễn Thanh Tú WWW.BOIDUONGHOAHOCQUYNHON.BLOGSPOT.COM WWW.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUYNHON CHƯƠNG BÀN LUẬN 4.1 VỀ PHƯƠNG PHÁP XỬ LÝ MẪU Trong số nhiều phương pháp xử lý mẫu, lựa chọn phương pháp chiết pha rắn để xử lý mẫu Đây phương pháp xử lý loại bỏ nhiều tạp chất làm giàu mẫu mẫu nước thải phức tạp với hàm lượng chất phân tích thấp hiệu suất thu hồi kháng sinh cao (77,75 – 114,93%) Việc khảo sát chiết pha rắn cho mẫu nước thải cơng nghiệp dược khó khăn mẫu có nhiều chất có cấu trúc tương tự nhau, dễ bị hấp phụ cạnh tranh lên cột chiết pha rắn nên dễ giảm hiệu suất chiết Ở Việt Nam, với nghiên cứu xác định dư lượng kháng sinh nước thải cơng nghiệp, lại chưa có nghiên cứu sử dụng phương pháp Nếu nghiên cứu Trần Thị Huế, năm 2013, xác định dư lượng cefixim nước thải công nghiệp dược sử dụng phương pháp chiết lỏng – lỏng để xử lý mẫu, đến nghiên cứu Nguyễn Văn Thuận năm 2014 bắt đầu sử dụng cột chiết pha rắn Tuy nhiên, hiệu suất chiết thấp, từ 40- 80% [15] Trên giới, nghiên cứu sử dụng phương pháp chiết pha rắn để xử lý nhiều N Dorival- Garcia cộng (2013) sử dụng cột Oasis HLB với thể tích mẫu chiết 100ml, rửa giải 8ml MeOH, độ thu hồi từ 98,5 – 103,9 % [29] Jay E Renew cộng (2004) chiết 1000ml dung dịch mẫu chiết qua cột HLB (Waters, Taunton, MA), rửa giải 10ml 95%MeOH/ 5% 4,38mM H3PO4 Độ thu hồi trung bình kháng sinh quinolon 90% [24] Như vậy, phương pháp chiết pha rắn nghiên cứu đáp ứng yêu cầu xử lý mẫu thu hiệu suất chiết cao 4.2 VỀ PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH Trên giới, nghiên cứu sử dụng hệ thống sắc ký lỏng ghép khối phổ để phân tích dư lượng kháng sinh nước thải Jay E Renew cộng (2004) sử dụng cột Zorbax SB- C18 (5µm; 2,1 x 150 mm), tốc độ 48 Đóng góp PDF GV Nguyễn Thanh Tú WWW.BOIDUONGHOAHOCQUYNHON.BLOGSPOT.COM WWW.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUYNHON dòng 0,25 ml/phút, gradient pha động kênh A: 1mM amonia acetat, 0,007% (tt/tt) acid acetic băng 10%ACN, kênh B: 100%ACN; detector mảng diod detector khối phổ [24] Urszula Hubicka cộng (2013) sử dụng cột Acquity UPLC BEH C18 (1,7µm; 2,1 x 100 mm); gradient pha động 0,1% acid formic nước 0,1% acid formic ACN; detector PDA [30] Trong đó, nghiên cứu nước xác định dư lượng kháng sinh quinolon nước thải dừng lại sắc ký lỏng hiệu cao, detector huỳnh quang, nghiên cứu Dương Hồng Anh cộng (2007) với bước sóng kích thích 278 nm, bước sóng phát xạ 445nm [2] Các nghiên cứu nước đa số dừng lại phương pháp đo quang hay HPLC nên giới hạn phát phương pháp hạn chế so với phương pháp phân tích khối phổ có độ xác giới hạn phát dư lượng kháng sinh nước thải thấp Ngoài ra, nghiên cứu trước sử dụng chất nhóm nghiên cứu để làm chuẩn nội nghiên cứu này, chúng tơi sử dụng đồng vị kháng sinh Ciprofloxacin 13C3 làm chất chuẩn nội Đây điểm đổi so với nghiên cứu trước Khi sử dụng chất đồng vị làm chuẩn nội, phương pháp có độ xác cao đồng vị chất khơng có tự nhiên nên không bị nhiễm vào mẫu nghiên cứu LC-MS/MS trang thiết bị phân tích có độ đặc hiệu độ nhạy cao Xây dựng phương pháp LC-MS/MS đảm bảo tốt độ đặc hiệu hạn chế thiết bị đắt tiền, chưa trang bị rộng rãi trung tâm kiểm nghiệm Ngoài ra, điều kiện tiến hành phân tích địi hỏi u cầu ngặt nghèo điều kiện mơi trường, hóa chất dụng cụ dễ bị nhiễm chéo Vì vậy, việc triển khai ứng dụng phương pháp phân tích LC-MS/MS ngành Y, Dược cịn hạn chế 49 Đóng góp PDF GV Nguyễn Thanh Tú WWW.BOIDUONGHOAHOCQUYNHON.BLOGSPOT.COM WWW.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUYNHON 4.3 VỀ THẨM ĐỊNH PHƯƠNG PHÁP Sau tiến hành khảo sát tối ưu điều kiện khác thể tích tiêm mẫu, chương trình gradient pha động cho thấy: có mối tương quan tuyến tính chặt chẽ tỉ số diện tích pic kháng sinh so với chuẩn nội nồng độ khoảng khảo sát 0,5 - 50 ppb với r > 0,995, phương pháp có độ cao (Phần trăm tìm lại nằm khoảng 77,75 - 114,93 %), hệ thống có tính thích hợp tốt (RSD thời gian lưu < 2%; diện tích pic kháng sinh chuẩn nội nhỏ < 5%) hồn tồn thích hợp ứng dụng xác định dư lượng kháng sinh Moxifloxacin, Ofloxacin, Ciprofloxacin Norfloxacin nước thải Phương pháp có độ nhạy cao, giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng đến nồng độ ppb (từ 0,66 ng/ml- 0,5 ng/ml) nước Một nghiên cứu khác Dương Hồng Anh cộng (2007) sử dụng quy trình chiết pha rắn HPLC với detector huỳnh quang để xác định dư lượng số kháng sinh thuộc họ quinolon bệnh viện thu giới hạn phát ppb (0,5 – 1,0 ppb) Tuy nhiên, khơng thể phủ nhận LC-MS/MS có khả phân tích chất có nồng độ vết ppb thích hợp để định lượng tồn dư kháng sinh nước Trong khuôn khổ đề tài, tiến hành thẩm định phương pháp xây dựng cho kết tốt Chúng chứng minh phương pháp có tính chọn lọc cao với độ độ xác tốt (so với tiêu chuẩn AOAC) Ngồi ra, khoảng tuyến tính chúng tơi xây dựng nồng độ thấp (từ 0,5 đến 50ppb) thích hợp để xác định dư lượng kháng sinh nước thải nồng độ kháng sinh khảo sát thường nhỏ 50 Đóng góp PDF GV Nguyễn Thanh Tú WWW.BOIDUONGHOAHOCQUYNHON.BLOGSPOT.COM WWW.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUYNHON 4.4 VỀ ỨNG DỤNG PHƯƠNG PHÁP Ở Việt Nam, chưa có nghiên cứu xác định dư lượng kháng sinh Quinolon nước thải công nghiệp dược So với nghiên cứu trước xác định hàm lượng kháng sinh huyết hay xác định dư lượng kháng sinh thực phẩm hay nước thải bệnh viện hướng nghiên cứu Phương pháp xây dựng có khả định lượng số kháng sinh quinolon mẫu nước thải Trong đó, dư lượng kháng sinh Ofloxacin khoảng 0,44 – 2,33 ppb Ciprofloxacin khoảng 0,42 – 2,02 ppb, phát dư lượng Norfloxacin mẫu với nồng độ 0,22 ppb mặt Moxifloxacin Do phương pháp áp dụng cho mẫu nước thải nhiều nhà máy khác Ảnh hưởng thuốc nói chung kháng sinh nói riêng có mặt nguồn nước tự nhiên vấn đề quan trọng Tuy tồn lượng nhỏ kháng sinh nguồn nước tự nhiên, vi khuẩn phát triển gen gây kháng kháng sinh, mối đe doạ lớn toàn cộng đồng Với chi phí cao nghiên cứu, phát triển kháng sinh thời gian dài, vậy, vấn đề đặt giảm nhiều tình trạng kháng kháng sinh tốt Tuy nhiên, vấn đề dư lượng kháng sinh nước thải chưa quan tâm mức Dư lượng kháng sinh nước thải chưa quy định cụ thể Trong đó, với ngành cơng nghiệp dược phát triển mạnh mẽ nhiều nhà máy sản xuất kháng sinh đời Nếu nhà máy xả nước thải chưa xử lý vào môi trường với dư lượng kháng sinh cao dẫn đến tồn chúng nước bề mặt, nước ngầm cuối nước uống Từ đó, làm cho vi sinh vật thích ứng nhiều nhiều chủng kháng thuốc phát triển vùng nước tự nhiên Mặc dù vậy, Việt Nam lại chưa có nghiên cứu 51 Đóng góp PDF GV Nguyễn Thanh Tú WWW.BOIDUONGHOAHOCQUYNHON.BLOGSPOT.COM WWW.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUYNHON đưa mức nồng độ cụ thể kháng sinh nước thải gây kháng thuốc vi khuẩn Nghiên cứu xây dựng phương pháp xác định dư lượng kháng sinh với độ xác cao, góp cơng cụ để đánh giá hàm lượng kháng sinh nước thải Từ đó, nâng cao ý thức xử lý nước thải có chứa kháng sinh công ty dược phẩm 52 Đóng góp PDF GV Nguyễn Thanh Tú WWW.BOIDUONGHOAHOCQUYNHON.BLOGSPOT.COM WWW.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUYNHON KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ KẾT LUẬN Từ kết thực nghiệm thu được, chúng tơi hồn thành mục tiêu đề xây dựng phương pháp xác định Moxifloxacin, Ofloxacin, Ciprofloxacin Norfloxacin nước thải sắc ký lỏng khối phổ Cụ thể là: * Đã xây dựng phương pháp định lượng kháng sinh quinolon (Moxifloxacin, Ofloxacin, Ciprofloxacin Norfloxacin) nước thải sở sản xuất dược Cụ thể là: Quy trình xử lý mẫu Lọc 100 ml nước thải qua giấy lọc màng lọc 0,45µm; Acid hóa dịch lọc đến pH = 2; Thêm 5ml dung dịch Na2EDTA 5% để loại tạp Chiết mẫu qua cột SPE, tốc độ 0,5- ml/phút Rửa cột 10 ml H2O làm khô cột 10 phút Rửa giải 10ml MeOH Đối với mẫu có nồng độ kháng sinh cao, lọc loại tạp, xử lý, chiết qua cột để làm mẫu tiến hành sắc ký Điều kiện sắc ký: Sử dụng cột Agilent Eclipse XDB- C18 (3,5 µm; 3,0mm x 150 mm), thể tích tiêm mẫu 10 µl, tốc độ dịng 0,5 ml/phút, chương trình gradient pha động có kênh kênh A: H2O (0,1 % HCOOH), kênh B: ACN (0.1% HCOOH) Điều kiện khối phổ: Chế độ phát MRM Lựa chọn ion mẹ, lượng bắn phá ion mẹ để thu ion con, lựa chọn ion phù hợp cho q trình phân tích định tính, định lượng phù hợp với tiêu chuẩn Châu Âu 2002/657/EC Trong đó, mảnh có cường độ lớn dùng để định lượng, mảnh có cường độ thấp dùng để định tính 53 Đóng góp PDF GV Nguyễn Thanh Tú WWW.BOIDUONGHOAHOCQUYNHON.BLOGSPOT.COM WWW.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM STT WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUYNHON Chất Ion mẹ Ion phân tích (m/z) (m/z) Moxifloxacin Ofloxacin Ciprofloxacin Norfloxacin IS Colission Energy Thế đầu vào (V) (V) 402,1 384 364 25 130 362 318 261 20 140 332,1 314 288 19 110 320 302 276 18 110 336,1 318 291 20 110 * Thẩm định quy trình định lượng kháng sinh nước thải sản xuất dược Đã thẩm định phương pháp có tính đặc hiệu, phân tích đồng thời kháng sinh nước thải Đã xây dựng khoảng tuyến tính từ khoảng 0,5 ppb – 50 ppb ppb – 50 ppb tùy kháng sinh với hệ số tương quan chặt chẽ r > 0,995 tất chất Phương pháp có độ nhạy cao, giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng đến nồng độ ppb (từ 0,66 0,5 ppb), chứng tỏ phương pháp khả thi để ứng dụng phát dư lượng kháng sinh môi trường Độ phương pháp cao nằm khoảng qui định AOAC, FDA Như xây dựng phương pháp xác định đồng thời dư lượng kháng sinh Moxifloxacin, Ofloxacin, Cipofloxacin Nofloxacin nước * Đã áp dụng phương pháp phân tích xây dựng đươc 11 mẫu thực 06 sở sản xuất: Đã áp dụng quy trình xây dựng vào phân tích mẫu nước thải 06 sở sản xuất dược phẩm không thấy xuất Moxifloxacin, phát Norfloxacin mẫu với nồng độ 0,22 ppb; dư lượng kháng sinh Ofloxacin phát mẫu với nồng độ 0,44 – 2,33ppb 54 Đóng góp PDF GV Nguyễn Thanh Tú WWW.BOIDUONGHOAHOCQUYNHON.BLOGSPOT.COM WWW.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUYNHON Ciprofloxacin phát 05 mẫu với khoảng nồng độ 0,42 – 2,02 ppb Quy trình xây dựng có tính khả thi để xác định dư lượng Moxifloxacin, Ofloxacin, Ciprofloxacin Norfloxacin nước thải công nghiệp dược KIẾN NGHỊ Do thời gian nghiên cứu ngắn nên chúng tơi phân tích dư lượng kháng sinh quinolon với số mẫu thực (11 mẫu) Vì vậy, thời gian tới, chúng tơi mong muốn phát triển phương pháp để định lượng đồng thời nhiều kháng sinh thẩm định nhiều mẫu thực tế Đồng thời so sánh với phương pháp khác phương pháp vi sinh vật để đánh giá toàn diện liên quan dư lượng kháng sinh đề kháng, biến đổi vi sinh vật nước thải Từ đó, góp phần kiểm sốt dư lượng kháng sinh nước thải hạn chế tình trạng kháng kháng sinh 55 Đóng góp PDF GV Nguyễn Thanh Tú WWW.BOIDUONGHOAHOCQUYNHON.BLOGSPOT.COM WWW.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUYNHON 56 Đóng góp PDF GV Nguyễn Thanh Tú WWW.BOIDUONGHOAHOCQUYNHON.BLOGSPOT.COM WWW.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUYNHON TÀI LIỆU THAM KHẢO TIẾNG VIỆT Trần Tử An (2007), Kiểm nghiệm dược phẩm, tr 84- 110, Nhà xuất y học, Hà Nội Dương Hồng Anh cộng (2007), Phát triển phương pháp phân tích lượng vết kháng sinh họ Floquinolon nước thải bệnh viện kỹ thuật chiết pha rắn sử dụng cột silicagel tự chế tạo phát sắc ký lỏng hiệu cao với detectơ huỳnh quang, Tạp chí Phân tích Hóa, Lý Sinh học 12 (1), 3-7 Bộ Tài nguyên môi trường (2011), Thông tư quy định quy chuẩn kỹ thuật quốc gia môi trường Bộ môn dược lâm sàng, trường Đại học Dược Hà Nội (2001), Dược lâm sàng điều trị, Nhà xuất y học Hà Nội BộY tế (2009), Dược điển Việt Nam IV, nhà xuất Y học BộY tế (2009), Dược thư quốc gia Việt Nam, nhà xuất Y học Cục khám chữa bệnh Việt Nam, Khảo sát tình trạng sử dụng kháng sinh kháng kháng sinh Việt Nam Trần Đức Hậu (2006), Hóa dược, tập 2, tr 78- 84, trường Đại học Dược Hà Nội Nguyễn Văn Kính nhóm nghiên cứu quốc gia GARP- Việt Nam (2010), Phân tích thực trạng: Sử dụng kháng sinh kháng kháng sinh Việt Nam 10 Bùi Thị Luyến (2014), Xây dựng quy trình xác định dư lượng số chất nhóm quinolon thực phẩm kỹ thuật LC- MS/MS, Luận văn thạc sỹ dược học, Trường Đại học Dược Hà Nội, Hà Nội 11 Nguyễn Hải Nam (2011), Liên quan cấu trúc tác dụng sinh học, tr 132, Bộ Y tế 12 Hồ Viết Quý (2007), Các phương pháp phân tích cơng cụ hóa học đại, trang 397, 542, Nhà xuất đại học sư phạm 13 Trần Cao Sơn (2010), Thẩm định phương pháp phân tích hóa học vi sinh vật, Nhà xuất khoa học kỹ thuật Đóng góp PDF GV Nguyễn Thanh Tú WWW.BOIDUONGHOAHOCQUYNHON.BLOGSPOT.COM WWW.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUYNHON 14 Vũ Thị Trâm (2007), Dược lý học, tập 2, Nhà xuất y học, Hà Nội 15 Nguyễn Văn Thuận (2014), Nghiên cứu xác định dư lượng số kháng sinh Cephalosporin nước thải nhà máy dược phẩm LC- MS/MS, Luận văn thạc sỹ dược học, Trường Đại học Dược Hà Nội, Hà Nội TIẾNG ANH 16 AOAC International (2007), Validation and Qualification in Analytical Laboratories, Second Edition 17 Ashutosh Kar (2005), Pharmaceutical Drug Analysis 2nd ed New Age International (P) Ltd Publishers; New Delhi 18 Beesley T.E, Buglio B., Scott R.P.W (2001) Quantitative Chromatographic Analysis, Marcel Dekker, Inc., New York 19 Connor K.A (1982), A textbook of Pharmaceutical Analysis, 3th Edition, Wiley Interscience Publication 20 E Braunwald et al (2001), Harison’s priciples of internal medicine, 15th ed.; McGraw-Hill, Medical Publishing Division, New York 21 Harry G Brittain (2009), Profile of Drug substances, excipients, and Related Mothodology, Volume 34, Burlington: Academic Press, pp 265 22 Heigher D (2000), High Performance capillary electrophoreris, an introduction, Agilent Technologies 23 Imma Ferrer, E Michael Thurman, Jerry Zweigenbaum (2008), EPA 1694: Pharmaceuticals and Personal Care Products in Water Soil, Sediment, and Biosolids by HPLC/MS/MS, Application Technologies publication 59899665EN 24 Jay E.Renew, Ching Hua Huang (2004), Simultaneous determination of fluoroquinolon, sulfonamide, and trimethoprim antibiotics in wastewater using tandem solid phase extrction and liquid chromatography- electrospray mass spectrometry, Journal of Chromatography A, 1042 (2004) 113- 121 25 Jaewon Choi (2008), Development of multi- residual analytical methods for pharmaceuticals, perfluorinated compounds, nitrosamines, hormones and POPs in water, Reports on the International Collaborative research, volume 1, pp 1- 30, 47- 66 Đóng góp PDF GV Nguyễn Thanh Tú WWW.BOIDUONGHOAHOCQUYNHON.BLOGSPOT.COM WWW.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUYNHON 26 J G Hardman et al.(1996): Goodman and Gilman’s the pharmacological Basic of therapeutic 9th Ed; McGraw- Hill; New York 27 N Dorival- Garcia, A Zafra- Gomez (2013), Analysis of quinolone antibiotic derivatives in sewage sludge samples by liquid chromatographytandem mass spectrometry: Comparison of the efficiency of three extraction techniques, Talanta 106 28 M.T.Meyer (2007), Evaluation of offline Tandem and online solid phase extraction with liquid chromatography/ electrospray ionization- mass spectrometry for analysis of antibiotics in ambient water and comparison to an independent method, Scientific Investigations Report 2007- 5021 29 N Dorival- Garcia, A Zafra- Gomez (2013), Simultaneuos determination of 13 quinolone antibiotic derivatives in wastewater samples using solidphase extraction and ultra performance liquid chromatography- tandem mass spectrometry, Microchemical journal 106 30 Urszula Hubicka, Pawel Zmudzki et al (2013), Photodegradation assessment of ciprofloxacin, moxifloxacin, norfloxacin and ofloxacin in the presence of excipients from tablets by UPLC- MS/MS and DSC, Chemistry Central Journal 31 Vishal Diwan et al (2010), Antibiotics and antibiotic-resistant bacteria in waters associated with a hospital in Ujjain, India, BMC Public Health, 10.1186/1471-2458-10-414 32 Xiao, Y., Chang, H., Jia, A., Hu, J.Y., (2008), Trace analysis of quinolone and fluoroquinolone antibiotics from wastewaters by liquid chromatographyelectrospray tandem mass spectrometry, J Chromatogr A 1214, 100e108 33 Ye, Z.Q., Weinberg, H.S., Meyer, M.T., (2007), Trace analysis of trimethoprim and sulfonamide, macrolide, quinolone, and tetracycline antibiotics in chlorinated drinking water using liquid chromatography electrospray tandem mass spectrometry Anal Chem 79, 1135e1144 Đóng góp PDF GV Nguyễn Thanh Tú WWW.BOIDUONGHOAHOCQUYNHON.BLOGSPOT.COM ... BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGUYỄN THỊ HẠNH NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH DƯ LƯỢNG MỘT SỐ KHÁNG SINH QUINOLON TRONG NƯỚC THẢI CÔNG NGHIỆP DƯỢC BẰNG LC- MS/MS LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC CHUYÊN NGÀNH:... mẫu nước thải giới nghiên cứu, chưa áp dụng với nước thải công nghiệp dư? ??c Việt Nam Một số nghiên cứu xác định dư lượng số kháng sinh quinolon sau: - Dư? ?ng Hồng Anh cộng (2007) phân tích lượng. .. khả kháng kháng sinh Xuất phát từ lý trên, tiến hành đề tài: ? ?Nghiên cứu xác định dư lượng số kháng sinh Quinolon nước thải công nghiệp Dư? ??c LC- MS/MS” với mục tiêu sau: Xây dựng phương pháp xác