nghiên cứu xác định hàm lượng một số chất hữu cơ trong dược phẩm và nước tiểu bằng phương pháp von-ampe

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN Trần Quang Hải NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG MỘT SỐ CHẤT HỮU CƠ TRONG DƯỢC PHẨM VÀ TRONG NƯỚC TIỂU BẰNG PHƯƠNG PHÁP VON - AMPE C

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

Trần Quang Hải

NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG MỘT SỐ CHẤT HỮU CƠ TRONG DƯỢC PHẨM

VÀ TRONG NƯỚC TIỂU BẰNG PHƯƠNG PHÁP VON - AMPE

Chuyên ngành: Hóa phân tích

Mã số: 62 44 29 01

LUẬN ÁN TIẾN SỸ HÓA HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:

1 GS.TS Từ Vọng Nghi

2 PGS.TS Dương Quang Phùng

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi Các số liệu, kết quả nêu trong luận án là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác

Hà Nội, ngày 16 tháng 5 năm 2014

TÁC GIẢ LUẬN ÁN

TRẦN QUANG HẢI

LỜI CẢM ƠN

Với lòng biết ơn chân thành, sâu sắc nhất, tôi xin trân trọng cảm ơn GS.TS Từ Vọng Nghi, cố PGS.TS Dương Quang Phùng đã tận tình hướng dẫn, khích lệ, động viên, giúp đỡ tôi trong suốt thời gian thực hiện luận án Tôi xin trân trọng cảm ơn PGS.TS Nguyễn Văn Ri, PGS.TS Tạ Thị Thảo

và các quý thầy cô thuộc Bộ môn Hóa Phân tích – Khoa Hóa học trường Đại học Khoa học Tự nhiên – ĐHQG HN đã tạo điều kiện, giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện luận án

Tôi xin trân trọng cảm ơn PGS TS ĐàoThị Phương Diệp, TS Trần Công Việt và các quý thầy cô thuộc Bộ môn Hóa Phân tích – Khoa Hóa học trường Đại học Sư Phạm Hà Nội đã tạo điều kiện, giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện luận án

Tôi xin trân trọng cảm ơn Ban Giám hiệu, Phòng Tổ chức – Hành chính, Khoa Công nghệ Hóa học - Trường Đại học Công nghiệp Hà Nội và các đồng nghiệp đã tạo mọi điều kiện, giúp đỡ, động viên tôi trong quá trình thực hiện luận án

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành sâu sắc với bố, mẹ, gia đình và các bạn gần xa đã động viên, giúp đỡ tôi hoàn thành luận án này

Hà Nội, ngày 16 tháng 5 năm 2014

TRẦN QUANG HẢI

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN i

LỜI CẢM ƠN ii

MỤC LỤC iii

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT vi

DANH MỤC CÁC BẢNG viii

DANH MỤC CÁC HÌNH xii

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 4

1.1 ĐẠI CƯƠNG VỀ OFLOXACIN, METRONIDAZOL, CLOPHENIRAMIN MALEAT VÀ CEFADROXIL 4

1.1.1 Ofloxacin 4

1.1.2 Metronidazol 5

1.1.3 Clorpheniramin maleat 7

1.1.4 Cefadroxil 9

1.2 CÁC PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH OFLOXACIN, METRONIDAZOL VÀ CLORPHENIRAMIN MALEAT VÀ CEFADROXIL 11

1.2.1 Các phương pháp xác định ofloxacin 11

1.2.2 Các phương pháp xác định metronidazol 13

1.2.3 Các phương pháp xác định clorpheniramin maleat 14

1.2.4 Các phương pháp xác định cefadroxil 15

1.3 PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH CỰC PHỔ VÀ VON-AMPE 16

1.3.1 Cực phổ xung vi phân (Diffrerential Pulse Polarography – DPP) 17

1.3.2 Phương pháp Von-ampe hòa tan hấp phụ (AdSV) 18

1.4 XỬ LÝ MẪU 21

1.4.1 Mẫu thuốc 21

1.4.2 Mẫu nước tiểu 21

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 24

2.1 THIẾT BỊ DỤNG CỤ VÀ HÓA CHẤT 24

2.1.1 Thiết bị, dụng cụ 24

2.1.2 Hóa chất 25

2.2 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 27

2.2.1 Phân tích hàm lượng hoạt chất trong chế phẩm thuốc 27

2.2.2 Phân tích hàm lượng các thuốc trong nước tiểu bệnh nhân 28

2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 28

2.3.1 Tiến hành thí nghiệm theo phương pháp von-ampe vòng (CV) 28

2.3.2 Tiến hành thí nghiệm theo phương pháp von-ampe xung vi phân (DP) 29 2.3.3 Tiến hành thí nghiệm theo phương pháp xung vi phân hòa tan – hấp phụ (DP – AdSV) 30

2.3.4 Tiến hành thí nghiệm theo kỹ thuật chiết pha rắn (SPE) 30

2.3.5 Phương pháp định lượng các hoạt chất trong thuốc 30

2.3.6 Các bước khảo sát 31

2.3.7 Xử lý mẫu 34

2.3.8 Xử lý số liệu 35

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 38

3.1 NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG QUI TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG OFLOXACIN 38

3.1.1 Khảo sát các điều kiện cơ bản xác định ofloxacin 38

3.1.2 Khảo sát khoảng tuyến tính và đánh giá phương pháp 45

3.1.3 Xây dựng qui trình định lượng ofloxacin trong mẫu thuốc 48

3.1.4 Áp dụng thực tế phân tích hàm lượng ofloxacin trong các mẫu thuốc 50

3.1.5 Nghiên cứu qui trình định lượng ofloxacin trong các mẫu nước tiểu 51 3.1.6 Áp dụng thực tế phân tích hàm lượng ofloxacin trong các mẫu nước tiểu 63

3.2 NGHIÊN CỨU QUI TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG METRONIDAZOL 65

3.2.1 Khảo sát các điều kiện thích hợp 65

3.2.2 Khảo sát khoảng tuyến tính và đánh giá phương pháp 71

3.2.3 Xây dựng qui trình định lượng metronidazol trong các mẫu thuốc 75 3.2.4 Áp dụng thực tế phân tích hàm lượng metronidazol trong các mẫu thuốc 75 3.2.5 Nghiên cứu định lượng metronidazol trong mẫu nước tiểu 77 3.3 NGHIÊN CỨU QUI TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG CLORPHENIRAMIN MALEAT 79 3.3.1 Khảo sát các điều kiện thích hợp 79 3.3.2 Khảo sát khoảng tuyến tính và đánh giá phương pháp 84 3.3.3 Xây dựng qui trình định lượng clorpheniramin maleat trong mẫu thuốc 88 3.3.4 Áp dụng thực tế phân tích trong các mẫu thuốc 89 3.4 NGHIÊN CỨU ĐỊNH LƯỢNG CEFADROXIL 92 3.4.1 Nghiên cứu định lượng cefadroxil bằng phương pháp von – ampe xung vi phân 92 3.4.2 Nghiên cứu định lượng cefadroxil bằng phương pháp von – ampe hòa tan hấp phụ 105 KẾT LUẬN 130 TÀI LIỆU THAM KHẢO 134 PHỤ LỤC

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

TT Viết tắt,

2 SPE Chiết pha rắn Solid Phase Extraction

3 Ip Cường độ dòng pic Peak current

6 HMDE Điện cực giọt thủy ngân treo Hanging Mercury Drop Electrode

7 RSD Độ lệch chuẩn tương đối Relative Standard Deviation

9 LOQ Giới hạn định lượng Limit of Quantification

10 LOD Giới hạn phá hiện Limit of Detection

11 HPLC Sắc kí lỏng hiệu năng cao High Performance Liqid

Chromatography

12 LLC Sắc kí lỏng – lỏng Liquid – Liquid Chromatography

13 LC – MS Sắc kí lỏng – khối phổ Liquid Chromatography-Mass

Spectrometry

15 Eacc Thế tích lũy Accumulation potential

16 Tacc Thời gian tích lũy Accumulation time

17 Tcb Thời gian cân bằng Equilibration time

19 ASV Von-ampe hòa tan anot Anodic Stripping Voltammetry

20 CSV Von-ampe hòa tan catot Cathodic Stripping Voltammetry

21 AdSV Von-ampe hòa tan hấp phụ Adsorptive Stripping Voltammetry

TT Viết tắt,

24 DPP Cực phổ xung vi phân Differential Pulse Polarography

25 GCE Điện cực than gương Glassy Carbon Electrode

26 CPE Điện cực than mềm Carbon Past Electrode

27 WE Điện cực làm việc Working Electrode

28 AE Điện cực phù trợ Auxiliary Electrode

29 RE Điện cực so sánh Reference Electrode

30 SMDE Điện cực giọt thủy ngân

Good Manufacturing Practices – World Health Oganization

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 2.1: Pha dung dịch đệm photphat theo Dược điển Việt Nam 26

Bảng 3.1: Sự phụ thuộc Ip và Ep của ofloxacin vào pH dung dịch nền 40

Bảng 3.2: Sự phụ thuộc Ip và Ep của ofloxacin vào biên độ xung 41

Bảng 3.3: Sự phụ thuộc Ip vào thời gian đặt xung 42

Bảng 3.4: Sự phụ thuộc Ip và Ep của ofloxacin vào tốc độ quét thế 43

Bảng 3.5: Các điều kiện ghi đo dòng DP với dung dịch ofloxacin 45

Bảng 3.6: Sự phụ thuộc tuyến tính cường độ dòng pic vào nồng độ ofloxacin 45

Bảng 3.7: Độ thu hồi của ofloxacin 47

Bảng 3.8: Độ lặp lại của ofloxacin 48

Bảng 3.9: Kết quả định lượng ofloxacin trong thuốc nhỏ mắt Ofloxacin 0,3% (15mg/5ml) sản xuất tại Công ty Cổ phần Dược phẩm Traphaco 50

Bảng 3.10: Kết quả định lượng ofloxacin trong viên nén Ofloxacin 200mg sản xuất tại Công ty Cổ phần Dược phẩm Imexpharm; 51

Bảng 3.11: Hiệu suất chiết của các hệ dung môi 55

Bảng 3.12: Sự phụ thuộc Ip vào thể tích dung môi 56

Bảng 3.13: Sự phụ thuộc hiệu suất chiết vào thể tích dung môi 56

Bảng 3.14: Sự phụ thuộc hiệu suất chiết vào tốc độ nạp mẫu 57

Bảng 3.15: Sự phụ thuộc hiệu suất chiết vào thể tích dung môi 59

Bảng 3.16: Sự phụ thuộc nồng độ ofloxacin trong mẫu nước tiểu vào Ip 61

Bảng 3.17: Kết quả xác định ofloxacin trong mẫu nước tiểu tự tạo 62

Bảng 3.18: Kết quả xác định hàm hàm lượng ofloxacin trong mẫu nước tiểu của bệnh nhân uống 2 viên thuốc hàm lượng 200mg 64

Bảng 3.19: Sự phụ thuộc Ip và Ep của metronidazol vào pH dung dịch nền 67

Bảng 3.20: Sự phụ thuộc Ip và Ep của metronidazol vào biên độ xung 67

Bảng 3.21: Sự phụ thuộc Ip vào thời gian đặt xung 68

Bảng 3.22: Sự phụ thuộc Ip và Ep của metronidazol vào tốc độ quét thế 69 Bảng 3.23: Các điều kiện ghi đo dòng DP với dung dịch metronidazol 71 Bảng 3.24: Sự phụ thuộc tuyến tính cường độ dòng pic vào nồng độ

metronidazol 71 Bảng 3.25: Độ thu hồi của metronidazol 73 Bảng 3.26: Độ lặp lại của metronidazol 74 Bảng 3.27: Kết quả định lượng metronidazol trong thuốc Flagyl 250mg

viên nén bao film sản xuất tại Công ty TNHH Sanofi – Avantis Việt Nam 76 Bảng 3.28: Kết quả định lượng metronidazol trong thuốc Metronidazole 250mg

viên nén sản xuất tại Công ty Cổ phần Dược phẩm Hà Tây 76 Bảng 3.29: Sự phụ thuộc Ip và Ep của clorpheniramin maleat vào biên

độ xung 80 Bảng 3.30: Sự phụ thuộc Ip vào thời gian đặt xung 81 Bảng 3.31: Sự phụ thuộc Ip và Ep của clorpheniramin maleat vào tốc độ

quét thế 82 Bảng 3.32: Sự phụ thuộc Ip vào thời gian sục khí nitơ 83 Bảng 3.33: Các điều kiện ghi đo dòng DP với dung dịch clorpheniramin maleat 84 Bảng 3.34: Sự phụ thuộc tuyến tính cường độ dòng pic vào nồng độ

clorpheniramin maleat 85 Bảng 3.35: Độ thu hồi của clorpheniramin maleat 86 Bảng 3.36: Độ lặp lại của clorpheniramin maleat 87 Bảng 3.37: Kết quả định lượng CPM trong viên nén Clorpheniramin 4

(4mg) sản xuất tại Công ty Cổ phần Dược phẩm Hậu Giang 89 Bảng 3.38: Kết quả định lượng CPM trong viên nang Pacemine (4mg

clorpheniramin maleat) sản xuất tại Công ty Cổ phần Dược phẩm Hà Tây 89 Bảng 3.39: Sự phụ thuộc Ip vào nồng độ dung dịch nền NaOH 94

Bảng 3.40: Sự phụ thuộc Ip (nA) vào thời gian thủy phân 94

Bảng 3.41: Sự phụ thuộc Ip (nA) vào nhiệt độ thủy phân 95

Bảng 3.42: Các điều kiện ghi đo dòng DP với dung dịch cefadroxil 99

Bảng 3.43: Sự phụ thuộc tuyến tính cường độ dòng pic vào nồng độ cefadroxil 99

Bảng 3.44: Độ thu hồi của cefadroxil 101

Bảng 3.45: Độ lặp lại của cefadroxil 102

Bảng 3.46: Kết quả định lượng cefadroxil trong viên nang cefadroxil (500 mg) sản xuất tại Công ty TNHH MTV Dược phẩm và sinh học y tế Mebiphar 104

Bảng 3.47: Kết quả định lượng cefadroxil trong viên nang cefadroxil (500 mg) sản xuất tại Công ty Cổ phần Dược phẩm TW- Vidapha 105

Bảng 3.48: Sự phụ thuộc Ip (nA) vào thế tích lũy 107

Bảng 3.49: Sự phụ thuộc Ip (nA) vào thời gian tích lũy (tacc) 108

Bảng 3.50: Các điều kiện ghi đo dòng AdSV với dung dịch cefadroxil 111

Bảng 3.51: Sự phụ thuộc tuyến tính cường độ dòng pic vào nồng độ cefadroxil 111

Bảng 3.52: Độ thu hồi cefadroxil theo phương pháp AdSV 113

Bảng 3.53: Độ lặp lại của cefadroxil (phương pháp AdSV) 114

Bảng 3.54: Kết quả định lượng cefadroxil trong viên nang Ocefacel (cefadroxil 500 mg) sản xuất tại Công ty Cổ phần Dược phẩm Hà Tây 116

Bảng 3.55: Kết quả định lượng cefadroxil trong thuốc bột Tytdroxil (cefadroxil 250mg) sản xuất tại Công ty Cổ phần Dược phẩm Glomed 117

Bảng 3.56: Hiệu suất chiết của các hệ dung môi 119

Bảng 3.57: Sự phụ thuộc Ip vào thể tích dung môi 120

Bảng 3.58: Sự phụ thuộc hiệu suất chiết vào pH của dung môi 121

Bảng 3.59: Sự phụ thuộc hiệu suất chiết vào tốc độ nạp mẫu 122 Bảng 3.60: Sự phụ thuộc hiệu suất chiết vào thể tích dung môi 123 Bảng 3.61: Sự phụ thuộc nồng độ cefadroxil trong mẫu nước tiểu vào Ip 124 Bảng 3.62: Kết quả xác định cefadroxil trong mẫu nước tiểu tự tạo 126 Bảng 3.63: Kết quả xác định hàm hàm lượng cefadroxil trong mẫu nước tiểu

của bệnh nhân uống 1 gói thuốc Tytdroxil hàm lượng 250mg 127 Bảng 3.64: Kết quả xác định hàm hàm lượng cefadroxil trong mẫu nước

tiểu của bệnh nhân uống 2 viên thuốc hàm lượng 500mg 128

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1: Công thức cấu tạo của ofloxacin 4

Hình 1.2: Công thức cấu tạo của metronidazol 5

Hình 1.3: Công thức cấu tạo của clorpheniramin maleat 7

Hình 1.4: Công thức cấu tạo của cefadroxil 9

Hình 1.5: Các bước trong kỹ thuật chiết pha rắn 22

Hình 1.6: Vật liệu hấp phụ trong pha tĩnh cột HLB 22

Hình 1.7 So sánh khả năng lưu giữ giữa cột C18 và cột Oasis® HLB 23

Hình 3.1: Đường CV của ofloxacin 0,04mg/ml trong nền đệm photphat pH = 6,5 39

Hình 3.2: Đường DP của ofloxacin 0,01mg/ml trong các nền đệm 39

Hình 3.3: Đường DP của ofloxacin 3,0 µg/ml trong nền đệm photphat ở các pH khác nhau 40

Hình 3.4: Sự phụ thuộc Ip vào pH 40

Hình 3.5: Đường DP của ofloxacin 3,0 µg/ml phụ thuộc vào biên độ xung 41

Hình 3.6: Sự phụ thuộc Ip vào biên độ xung 41

Hình 3.7: Đường DP của ofloxacin phụ thuộc vào thời gian 1 xung 42

Hình 3.8: Sự phụ thuộc Ip vào thời gian 1 xung 42

Hình 3.9: Đường DP của ofloxacin phụ thuộc vào tốc độ quét thế 43

Hình 3.10: Ảnh hưởng của tốc độ quét thế đến cường độ dòng pic 43

Hình 3.11: Đường DP của ofloxacin phụ thuộc vào thời gian sục khí nitơ 44

Hình 3.12: Sự phụ thuộc giữa Ip vào nồng độ ofloxacin 46

Hình 3.13: Đường DP của ofloxacin phụ thuộc vào nồng độ 46

Hình 3.14: Đường CV của 1,0 ml nước tiểu chứa ofloxacin 10 µg/ml 52

Hình 3.15: Đường DP của 1,0ml nước tiểu không chứa thuốc (1) và 1,0 ml nước tiểu chứa ofloxacin 4 µg/ml (2) 52

Hình 3.16: Sự phụ thuộc Ip thể tích dung môi 56

Hình 3.17: Sự phụ thuộc hiệu suất chiết vào pH của dung môi 56

Hình 3.18: Sự phụ thuộc hiệu suất chiết vào tốc độ nạp mẫu 57

Hình 3.19: Sự phụ thuộc hiệu suất chiết vào thể tích dung môi 59

Hình 3.20: Đường DP của dung dịch ofloxacin 4 µg/ml trong: 60

Hình 3.21: Sự phụ thuộc Ip và nồng độ ofloxacin trong mẫu nước tiểu 62

Hình 3.22: Đường AdSV của ofloxacin trong nước tiểu (mẫu tự tạo) 62

Hình 3.23: Sự phụ thuộc nồng độ ofloxacin trong nước tiểu bệnh nhân uống 2 viên ofloxacin 200mg theo thời gian 65

Hình 3.24: Đường CV của metronidazol trong nền đệm photphat 66

Hình 3.25: Đường DP của metronidazol trong nền đệm photphat: 66

Hình 3.26: Đường DP của metronidazol trong nền đệm photphat ở các pH từ 3,5 đến 6,0 66

Hình 3.27: Đồ thị Sự phụ thuộc Ip và Ep của metronidazol vào pH dung dịch nền 66

Hình 3.28: Sự phụ thuộc Ip vào biên độ xung 67

Hình 3.29: Đồ thị sự phụ thuộc Ip vào biên độ xung 67

Hình 3.30: Đường DP của metronidazol phụ thuộc vào thời gian 1 xung 68

Hình 3.31: Đồ thị sự phụ thuộc Ip vào thời gian đặt 1 xung 68

Hình 3.32: Đường DP của metronidazol phụ thuộc tốc độ quét thế 69

Hình 3.33: Sự phụ thuộc Ip vào tốc độ quét thế 69

Hình 3.34: Đường DP của metronidazol phụ thuộc vào thời gian sục khí nitơ 70

Hình 3.35: Ảnh hưởng của thời gian sục khi nitơ đến cường độ dòng pic 70

Hình 3.36: Sự phụ thuộc giữa Ip vào nồng độ metronidazol 72

Hình 3.37: Đường DP của metronidazol ở các nồng độ 72

Hình 3.38: Đường DP của các mẫu nước tiểu trước và sau khi uống thuốc 78

Hình 3.39: Đường CV của clorpheniramin maleat 0,05mg/ml trong nền đệm photphat pH = 4,60 79

Hình 3.40: Đường DP của clorpheniramin maleat nền đệm photphat ở các pH khác nhau 79

Hình 3.41: Đồ thị sự phụ thuộc Ip vào pH của dung dịch nền 80

Hình 3.42: Sự phụ thuộc Ip vào biên độ xung 81

Hình 3.43: Đồ thị sự phụ thuộc Ip vào biên độ xung 81

Hình 3.44: Đường DP của clorpheniramin maleat ở các thời gian đặt xung khác nhau 82

Hình 3.45: Đồ thị sự phụ thuộc Ip vào thời gian đặt 1 xung 82

Hình 3.46: Đường DP của clorpheniramin maleat ở các tốc độ quét thế khác nhau 83

Hình 3.47: Đồ thị sự phụ thuộc Ip vào tốc độ quét thế 83

Hình 3.48: Đường DP của clorpheniramin maleat đo sau các thời gian sục khí khác nhau 84

Hình 3.49: Đồ thị sự phụ thuộc Ip vào thời gian sục khí nitơ 84

Hình 3.50: Sự phụ thuộc giữa Ip vào nồng độ clorpheniramin maleat 85

Hình 3.51: Đường DP của clorpheniramin maleat phụ thuộc vào nồng độ 85

Hình 3.52: Đường DP của các mẫu nước tiểu trước và sau khi uống thuốc 91

Hình 3.53: Đường CV của cefadroxil trong nền đệm photphat và nền NaOH 92

Hình 3.54: Đường DP của cefadroxil trong nền đệm photphat và nền NaOH 92

Hình 3.55: Sự phụ thuộc Ip vào nồng độ dung dịch nền NaOH 94

Hình 3.56: Đường DP của cefadroxil thủy phân trong dung dịch NaOH 0,16M ở các thời gian khác nhau 94

Hình 3.57: Sự phụ thuộc Ip (nA) vào thời gian thủy phân 95

Hình 3.58: Đường DP của cefadro xil thủy phân ở các nhiệt độ từ 30 đến 100oC 95

Hình 3.59: Sự phụ thuộc Ip (nA) vào nhiệt độ thủy phân 96

Hình 3.60: Đường DP của cefadroxil phụ thuộc vào biên độ xung 97

Hình 3.61: Sự phụ thuộc Ip vào biên độ xung 97

Hình 3.62: Đường DP của cefadroxil phụ thuộc vào tốc độ quét thế 98

Hình 3.63: Ảnh hưởng của tốc độ quét thế đến cường độ dòng pic 98

Hình 3.64: Đồ thị sự phụ thuộc tuyến tính Ip vào nồng độ cefadroxil 100

Hình 3.65: Đường DP của cefadroxil ở các nồng độ 100

Hình 3.66: Phổ CV của thuốc cefadroxil ở các thời gian làm giàu: 0s; 30s; 60s; 90s; 150s; 180s 106

Hình 3.67: Phổ DP của thuốc cefadroxil ở các thời gian làm giàu: 0s; 30s; 60s; 90s; 180s 106

Hình 3.68: Đường DP-AdSV của cefadroxil phụ thuộc vào thế tích lũy (Eacc ) 107

Hình 3.69: Sự phụ thuộc Ip vào Eacc 107

Hình 3.70: Đường DP-AdSV của cefadroxil phụ thuộc vào thời gian tích lũy (tacc) 108

Hình 3.71: Ảnh hưởng của thời gian tích lũy đến cường độ dòng pic 108

Hình 3.72: Đường DP-AdSV của cefadroxil phụ thuộc vào tốc độ quét thế 109 Hình 3.73: Ảnh hưởng của tốc độ quét thế đến cường độ dòng pic 109

Hình 3.74: Sự phụ thuộc Ip vào nhiệt độ 110

Hình 3.75: Đồ thị sự phụ thuộc tuyến tính giữa cường độ dòng vào nồng độ cefadroxil 112

Hình 3.76: Đường CSV của cefadroxil ở các nồng độ khác nhau 112

Hình 3.77: Sự phụ thuộc Ip thể tích dung môi 120

Hình 3.78: Sự phụ thuộc hiệu suất chiết vào pH của dung môi 121

Hình 3.79: Sự phụ thuộc hiệu suất chiết vào tốc độ nạp mẫu 122

Hình 3.80: Sự phụ thuộc hiệu suất chiết vào thể tích dung môi 123

Hình 3.81: Sự phụ thuộc Ip và nồng độ cefadroxil trong mẫu nước tiểu 125

Hình 3.82: Đường AdSV của cefadroxil trong nước tiểu (mẫu tự tạo) 125

Hình 3.83: Sự phụ thuộc nồng độ cefadroxil trong nước tiểu bệnh nhân uống 2 viên cefadroxil 250mg theo thời gian 127

Hình 3.84: Sự phụ thuộc nồng độ cefadroxil trong nước tiểu bệnh nhân uống 2 viên cefadroxil 500mg theo thời gian 128

MỞ ĐẦU Hiện nay, có hơn mười nghìn hợp chất hữu cơ dùng làm thuốc chữa bệnh cho con người, trên thị trường Việt Nam cũng có hơn mười nghìn mặt hàng thuốc Theo sự phát triển của dịch vụ y tế, ngành Dược Việt Nam cũng đang trên đà lớn mạnh, tính đến tháng 7 năm 2009, cả nước có 171 doanh nghiệp sản xuất thuốc, trong đó có 93 doanh nghiệp sản xuất tân dược nhưng chỉ có 53 doanh nghiệp đạt chuẩn GMP-WHO [15] Sự phát triển các doanh nghiệp sản xuất thuốc đã đặt ra yêu cầu công tác kiểm nghiệm thuốc phải theo

kịp sự phát triển Đặc biệt, khi nhiều thuốc generic (thuốc tương đương trị liệu với thuốc gốc khi thuốc gốc hết thời hạn bản quyền) cùng loại xuất hiện

và được các công ty Dược sản xuất và các nhà điều trị sử dụng thì thấy có một

số thuốc phiên bản này không cho tác dụng điều trị và hiệu quả lâm sàng

giống như biệt dược gốc Một thuốc generic có thể tương đương bào chế (tức

là có cùng công thức, hàm lượng dược chất, cùng dạng bào chế, cùng cách dùng, liều lượng) với biệt dược gốc nhưng lại không đạt được hiệu quả điều trị như thuốc biệt dược gốc thể hiện Để đạt độ tin cậy cần thiết trong thị trường dược phẩm, một thuốc generic cần phải được chứng minh tính hiệu

quả và an toàn trong điều trị của nó bằng thử nghiệm chứng minh tương

đương sinh học (bioequivalence) với thuốc biệt dược gốc Để chứng minh

tương đương sinh học phải tiến hành nhiều phép phân tích định lượng thuốc trong các dịch sinh học của bệnh nhân để đánh giá mức độ, tốc độ hấp thu và đào thải thuốc Đây là các nghiên cứu tốn kém do phải định lượng nhiều mẫu nên chưa được thực hiện nhiều ở Việt Nam

Trong kiểm nghiệm dược phẩm và phân tích dược phẩm trong các mẫu sinh học từ trước đến nay, phương pháp sử dụng để định lượng các hoạt chất trong thuốc chủ yếu là nhóm các phương pháp sắc ký (HPLC, GC, GC-MS/MS, LC-MS/MS) và nhóm các phương pháp quang phổ (UV-VIS, IR…)

Dược điển Việt Nam sử dụng phương pháp HPLC là phương pháp thường qui

để định lượng hoạt chất trong thuốc [1], ngoài ra có sử dụng các phương pháp trắc quang, các phương pháp chuẩn độ… Phương pháp HPLC có ưu điểm có

độ nhạy, độ chọn lọc cao, khả năng tách tốt, nhưng khó áp dụng rộng rãi do thiết bị, hóa chất đắt tiền và không phân tích nhanh được Phương pháp trắc quang tương đối phổ biến nhưng phải qua nhiều giai đoạn chiết tách mất thời gian, tốn hóa chất làm mất chất phân tích và độ phân giải không cao Vì vậy, việc nghiên cứu lựa chọn phương pháp phân tích đảm bảo độ đúng, độ chọn lọc, đơn giản, giá thành thấp, tốc độ hoàn thành nhanh có thể áp dụng rộng rãi song hành với các phương pháp phân tích trong dược điển và đánh giá tương đương sinh học thuốc là rất cần thiết và có ý nghĩa thực tiễn

Nhóm các phương pháp điện hóa bao gồm cực phổ và von-ampe có thể đáp ứng các yêu cầu đặt ra Trên thế giới đã có một số công trình dùng phương pháp von-ampe để định lượng các chế phẩm thuốc, dịch sinh học và một số lĩnh vực khác Các nghiên cứu trên thế giới đã cho thấy có rất nhiều dược phẩm có hoạt tính điện hóa Máy phân tích điện hóa đa năng được ưa chuộng ở Việt Nam vì ít tiền hơn các máy phân tích quang phổ và sắc ký, chi phí phân tích cũng rẻ hơn Hiện nay, tại Viện Khoa học Công nghệ Việt Nam, phòng thí nghiệm của nhóm GS.TS Lê Quốc Hùng và các cộng sự đã chế tạo được máy phân tích điện hóa đa chức năng có độ chính xác không kém máy nhập ngoại mà giá thành rẻ hơn rất nhiều

Tuy nhiên, ở Việt Nam phương pháp von-ampe còn ít được nghiên cứu ứng dụng trong phân tích các hợp chất hữu cơ đặc biệt là trong lĩnh vực phân

tích dược phẩm Thực hiện đề tài "Nghiên cứu xác định hàm lượng một số

chất hữu cơ trong dược phẩm và nước tiểu bằng phương pháp von-ampe."

nhằm đánh giá khả năng áp dụng phương pháp von-ampe để phân tích hoạt chất

có tác dụng chữa bệnh trong các chế phẩm thuốc và dịch sinh học ở Việt Nam

Đề tài chọn các kháng sinh cefadroxil (họ cephalosporin), ofloxacin (họ quinolon), thuốc kháng virut metronidazol và thuốc kháng histamin clorpheniramin maleat là các thuốc đang được sử dụng rất phổ biến ở nước ta

Mục tiêu của đề tài đặt ra là: Xây dựng và đề xuất các qui trình phân tích

bằng Von-Ampe để xác định các thuốc kháng sinh và kháng histamin trong dược phẩm và nước tiểu Để đạt được mục tiêu đề ra, chúng tôi triển khai các

nội dung thực nghiệm sau:

1 Khảo sát xây dựng qui trình phân tích hàm lượng một số kháng sinh đang được sử dụng phổ biến trong điều trị bệnh bao gồm: Ofloxacin (kháng sinh nhóm quinolon); metronidazol (kháng virut); clorpheniramin maleat (kháng histamin); cefadroxil (kháng sinh nhóm cephalosporin)

2 Phân tích hàm lượng một số kháng sinh trong chế phẩm thuốc đang được bán trên thị trường Việt nam

3 Khảo sát xây dựng qui trình phân tích hàm lượng thuốc trong nước tiểu bệnh nhân

4 Phân tích hàm lượng thuốc trong nước tiểu một số bệnh nhân

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN

CLOPHENIRAMIN MALEAT VÀ CEFADROXIL

1.1.1 Ofloxacin

Ofloxacin là oxo-4-oxa-1-azatricyclo[7.3.1.05,13]trideca-5(13),6,8,11-tetraene-11-

(RS)-7-fluoro-2-methyl-6-(4-methylpiperazin-1-yl)-10-carboxylic acid Là kháng sinh nhóm quinonol thế hệ thứ hai [1, 2, 5, 53]

Hình 1.1: Công thức cấu tạo của ofloxacin Ofloxacin có dạng tinh thể hình kim không màu, ít tan trong nước và etanol [1, 5] Trong công thức cấu tạo ofloxacin có khung quinolon, nhân quinon, có tính axit yếu với pKa1 = 5,8; pKa2 = 7,8 [31] Hoạt tính điện hóa có thể gây ra bởi nhóm COOH hoặc các nguyên tử N Theo Gerong Zhou, trong môi trường axit yếu có thể xảy ra phản ứng điện hóa [95]:

Ofloxacin là thuốc kháng khuẩn nhóm fluoroquinolon giống như ciprofloxacin, nhưng ofloxacin khi uống có khả dụng sinh học cao hơn (trên 95%) Ofloxacin được dùng trong các bệnh [3]:

+ Viêm phế quản nặng do vi khuẩn, viêm phổi,

+ Nhiễm khuẩn Chlamydia tại cổ tử cung hoặc niệu đạo có hoặc không

kèm lậu, lậu không biến chứng, viêm tuyến tiền liệt, viêm đường tiết niệu

+ Nhiễm khuẩn da và mô mềm

+ Viêm đại tràng do nhiễm khuẩn

Ofloxacin được hấp thu nhanh và tốt qua đường tiêu hóa Khả dụng sinh học qua đường uống khoảng 100% và có nồng độ đỉnh huyết tương khoảng 3 - 4 µg/ml, trong 1 - 2 giờ sau khi uống 400 mg Hấp thu bị chậm lại khi có thức ăn nhưng tỷ lệ hấp thu không bị ảnh hưởng Nửa đời trong huyết tương là 5 - 8 giờ; trong trường hợp suy thận, có khi kéo dài 15 - 60 giờ tùy theo mức độ suy thận [2, 3]

Thận là nơi thải ofloxacin chính, thuốc được lọc qua cầu thận và bài tiết qua ống thận 75 - 80% thuốc được bài tiết qua nước tiểu dưới dạng không chuyển hóa trong 24 đến 48 giờ, làm nồng độ thuốc cao trong nước tiểu Dưới 5% thuốc được bài tiết dưới dạng chuyển hóa trong nước tiểu; 4 đến 8% thuốc bài tiết qua phân

N

N

CH2 - CH2 - OH

Metronidazol có tính chất của nhân imidazol và của nhóm nitro thơm Nhóm nitro trong phân tử metronidazole có tính chất tương tự như nitro trên vòng benzene, có tính chất điện hóa Hoạt tính điện hóa của metronidazol trên điện cực giọt thủy ngân được A.M Bret dự đoán xảy ra quá trình khử nhóm nitro [29]:

Metrodinazol là thuốc kháng viruschống lại vi khuẩn kị khí và kí sinh trùng theo cách ức chế chọn lọc một số chức nǎng tế bào ở vi khuẩn làm cho chúng bị chết

Metronidazol có phổ hoạt tính rộng trên động vật nguyên sinh như

amip, Giardia và trên vi khuẩn kị khí Cơ chế tác dụng của metronidazol còn

chưa thật rõ Nồng độ trung bình có hiệu quả của metronidazol là 8 µg/ml hoặc thấp hơn đối với hầu hết các động vật nguyên sinh và các vi khuẩn nhạy

cảm Nồng độ tối thiểu ức chế các chủng nhạy cảm khoảng 0,5 µg/ml

Metronidazol thường hấp thu nhanh và hoàn toàn sau khi uống, đạt nồng độ trong huyết tương khoảng 10 µg/ml khoảng 1 giờ sau khi uống 500

mg Nửa đời của metronidazol trong huyết tương khoảng 8 giờ Metronidazol chuyển hóa ở gan thành các chất chuyển hóa dạng hydroxy và axit, thải trừ qua nước tiểu một phần dưới dạng glucuronid

Nửa đời thải trừ trung bình trong huyết tương khoảng 7 giờ Nửa đời của chất chuyển hóa hydroxy là 9,5 - 19,2 giờ ở người bệnh có chức năng thận bình thường Trên 80% liều uống được thải trừ qua thận trong 24 giờ, chủ yếu là các chất chuyển hóa Dưới 10% thải trừ dưới dạng chất mẹ

Khoảng 14% liều dùng thải trừ qua phân Ở người bệnh bị suy thận, nửa đời của chất mẹ không thay đổi, nhưng nửa đời của chất chuyển hóa hydroxy kéo dài gấp 4 đến 17 lần Chuyển hóa metronidazol có thể bị ảnh hưởng nhiều khi

bị suy gan nặng Metronidazol có thể loại khỏi cơ thể có hiệu quả bằng thẩm tách máu [3]

1.1.3 Clorpheniramin maleat

Clorpheniramin maleat có tên theo IUPAC là 3 – (4 – clorophenyl) – N, N-dimety-3-pyridin-2-yl-propan-1-amin Công thức cấu tạo được biểu diễn trên hình 1.6 [1, 5, 53]:

Hình 1.3: Công thức cấu tạo của clorpheniramin maleat

Clorpheniramin maleat có dạng bột kết tinh trắng, không mùi, vị đắng,

dễ tan trong nước, tan được trong etanol, cloroform [1, 5, 53]

Trong thành phần của clorpheniramin maleat có hai hợp phần: clorpheniramin và axit maleic, có liên kết đôi C=C, nhóm này có thể có hoạt tính điện hóa E Jacobsen [46] đề nghị phản ứng điện cực như sau:

Clorpheniramin maleat là thuốc kháng histamin thế hệ 1 Clorpheniramin maleat được sử dụng với liều 2 hoặc 4 mg trong chế phẩm đơn thành phần hoặc phối hợp với các thành phần khác như paracetamol,

pseudoephedrin, phenylephrin, phenylpropalamin, dextromethorphan trong chế phẩm đa thành phần

Clorpheniramin là một kháng histamin có rất ít tác dụng an thần Như hầu hết các kháng histamin khác, clorpheniramin cũng có tác dụng phụ chống tiết acetylcholin, nhưng tác dụng này khác nhau nhiều giữa các cá thể

Tác dụng kháng histamin của clorpheniramin thông qua phong bế cạnh tranh các thụ thể H1 của các tế bào tác động

Clorpheniramin maleat được dùng để điều trị viêm mũi dị ứng mùa và quanh năm và những triệu chứng dị ứng khác như: mày đay, viêm mũi vận mạch do histamin, viêm kết mạc dị ứng, viêm da tiếp xúc, phù mạch, dị ứng thức ăn, phản ứng huyết thanh; côn trùng đốt; ngứa ở người bệnh bị sởi hoặc thủy đậu Hiện nay, clorpheniramin maleat thường được phối hợp trong một

số chế phẩm bán trên thị trường để điều trị triệu chứng ho và cảm lạnh Tuy nhiên, thuốc không có tác dụng trong điều trị triệu chứng nhiễm virus

Clorpheniramin maleat hấp thu tốt khi uống và xuất hiện trong huyết tương trong vòng 30 - 60 phút Nồng độ đỉnh huyết tương đạt được trong khoảng 2,5 đến 6 giờ sau khi uống Khoảng 70% thuốc trong tuần hoàn liên kết với protein Clorpheniramin maleat chuyển hóa nhanh và nhiều Các chất chuyển hóa gồm có desmethyl - didesmethyl- clorpheniramin và một số chất chưa được xác định, một hoặc nhiều chất trong số đó có hoạt tính Nồng độ clorpheniramin trong huyết thanh không tương quan đúng với tác dụng kháng histamin vì còn một chất chuyển hóa chưa xác định cũng có tác dụng

Thuốc được bài tiết chủ yếu qua nước tiểu dưới dạng không đổi hoặc chuyển hóa, sự bài tiết phụ thuộc vào pH và lưu lượng nước tiểu Chỉ một lượng nhỏ được thấy trong phân Thời gian bán thải là 12 - 15 giờ và ở người bệnh suy thận mạn, kéo dài tới 280 - 330 giờ Một số viên nén clorpheniramin được bào chế dưới dạng tác dụng kéo dài, dưới dạng viên nén 2 lớp Lớp

ngoài được hòa tan và hấp thu giống như viên nén thông thường Lớp trong chỉ được hấp thu sau 4 - 6 giờ Tác dụng của những viên nén kéo dài bằng tác dụng của hai viên nén thông thường, uống cách nhau khoảng 6 giờ [3]

1.1.4 Cefadroxil

Cefadroxil là methyl-8-oxo-5-thia-1-azabicyclo[4.2.0]oct-2-ene-2-carboxylic acid monohydrat Cefadroxil là cephalosporin nhóm ba thế hệ thứ nhất, là kháng sinh dùng theo đường uống có phổ kháng khuẩn tương tự cefalexin [1, 3, 5, 53]

(6R,7R)-7-{[(2R)-2-(4-hydroxyphenyl)acetyl]amino}-3-Hình 1.4: Công thức cấu tạo của cefadroxil Cefadroxil có cả tính chất axit gây ra bởi nhóm cacboxyl (pKa1 = 4,5)

và nhóm phenol (pKa2 = 10) và tính bazơ gây ra bởi nhóm amin, tùy pH của môi trường có thể tồn tại ở dạng phân tử hoặc ion [65]

Các cephalosporin có điểm chung về cấu trúc là gồm một vòng amit bốn cạnh azetidin-2- on (còn được gọi là vòng -lactam) gắn với một dị vòng sáu cạnh Với cấu trúc như vậy, các cephalosporin có đặc điểm chung là khá bền vững trong môi trường axit, không bền trong môi trường kiềm do mở vòng -lactam Vòng -lactam nhạy cảm với sự tấn công của tác nhân ái nhân (AN) tạo ra các dẫn xuất của axit cephalosporic không có hoạt tính kháng sinh

Trong môi trường kiềm cefadroxil bị thủy phân mở vòng lactam tạo ra các sản phẩm:

Sản phẩm thủy phân của cefadroxil trong môi trường kiềm có phản ứng như những chất khử cực Quá trình khử trên điện cực giọt thủy ngân có thể xảy ra ở các liên kết đôi C = C hoặc C = N, tuy nhiên dễ xảy ra ở lên kết C = N hơn

*Ghi chú: R1 là (HO-C6H5-); R2 là (CH3-)

Cefadroxil có tác dụng diệt khuẩn, ngăn cản sự phát triển và phân chia của vi khuẩn bằng cách ức chế tổng hợp vách tế bào vi khuẩn Cefadroxil có tác dụng diệt nhiều loại vi khuẩn Gram dương và Gram âm

SH + 2 HO- + 2e + 2 H 2 O

Cefadroxil được chỉ định trong điều trị các nhiễm khuẩn thể nhẹ và trung bình do các vi khuẩn nhạy cảm [2, 3]:

+ Nhiễm khuẩn đường tiết niệu

+ Nhiễm khuẩn đường hô hấp

+ Nhiễm khuẩn da và mô mềm

+ Các nhiễm khuẩn khác: Viêm xương tủy, viêm khớp nhiễm khuẩn Cefadroxil bền vững trong axit và được hấp thụ rất tốt ở đường tiêu hóa Với liều uống 500 mg hoặc 1000mg, nồng độ đỉnh trong huyết tương tương ứng với khoảng 16 và 30 µg/ml, đạt được sau 1 giờ 30 phút đến 2 giờ Thức ăn không làm thay đổi sự hấp thụ thuốc Nửa đời của thuốc trong huyết tương là khoảng 1 giờ 30 phút ở người chức năng thận bình thường; thời gian này kéo dài trong khoảng từ 14 đến 20 giờ ở người suy thận

Thuốc không bị chuyển hóa Hơn 90% liều sử dụng thải trừ trong nước tiểu ở dạng không đổi trong vòng 24 giờ qua lọc cầu thận và bài tiết ở ống thận Do đó, với liều uống 500 mg, nồng độ đỉnh của cefadroxil trong nước tiểu lớn hơn 1 mg/ml Sau khi dùng liều 1000mg, nồng độ kháng sinh trong nước tiểu giữ được 20 - 22 giờ trên mức nồng độ ức chế tối thiểu cho những

vi khuẩn gây bệnh đường niệu nhạy cảm

VÀ CLORPHENIRAMIN MALEAT VÀ CEFADROXIL

Ofloxacin, metrodinazol, clorpheniramin maleat và cefadroxil có thể được xác định bằng nhiều phương pháp khác nhau như phương pháp trắc quang, phương pháp sắc ký, phương pháp điện hóa, phương pháp chuẩn độ oxi hóa khử Mỗi phương pháp đều có những ưu điểm riêng

1.2.1 Các phương pháp xác định ofloxacin

Theo Dược điển Việt Nam 4, xác định ofloxacin bằng phương pháp HPLC với thành phần pha động: Hỗn hợp dung dịch natri lauryl sulfat 0,24%, -

acetonitril - acid acetic băng (580 : 400 : 20). Cột thép không gỉ (25 cm x 4,6 mm) được nhồi pha tĩnh C -18 (5 m), nhiệt độ cột: duy trì ở 35 oC, detector quang phổ tử ngoại đặt ở bước sóng 294 nm Tốc độ dòng: 1,5 ml/phút Thể tích tiêm: 20 l [1]

Dược điển Anh định lượng ofloxacin theo phương pháp chuẩn độ điện thế bằng axit pecloric 0,1M, 1,0 ml dung dịch axit pecloric tương đương 36,14 mg ofloxacin [30]

Tamer Ayla đã xác định ofloxacin theo phương pháp von-ampe hòa tan với điện cực làm việc là HMDE trong nền đệm Britton- Robinson pH 6,00, khoảng tuyến tính từ 0,079 đến 197,5 µg/ml [78]

Chan Kwok Ping đã xác định đồng thời ofloxacin và moxifloxacin và

sự xâm nhập của chúng vào trong thủy dịch và thủy tinh thể bằng phương pháp HPLC với detecter huỳnh quang, khoảng tuyến tính từ 10 ng/ml đến 100 µg/ml, giới hạn phát hiện là 10 ng/ml [33]

Rao Yi đã sử dụng phương pháp FIA xác định ofloxacin trong dược phẩm với khoảng tuyến tính từ 0,04 đến 4 µg/ml, giới hạn phát hiện 0,016 µg/ml [66]

Ambrosi Adriano và các cộng sự đã xác định ofloxacin bằng phương pháp von-ampe xung vi phân trong nền NaClO4 0,2M, điện cực giọt thủy ngân tĩnh, giới hạn phát hiện 5,2µM [23]

Zhou Gerong đã xác định ofloxacin bằng phương pháp cực phổ xung thường điện cực thủy ngân tĩnh trong nền đệm Britton-Robinson pH = 4,0, khoảng tuyến tính 8.10-4 M đến 2.10-5 M, giới hạn phát hiện 4.10-6 M [95]

Nhìn chung các nghiên cứu định lượng ofloxacin và kháng sinh nhóm floquinolon trong dược phẩm và các đối tượng khác thường theo phương pháp HPLC [20, 34, 54, 56, 61, 73, 85, 89, 93…]

1.2.2 Các phương pháp xác định metronidazol

Theo Dược điển Việt Nam, xác định metronidazol bằng phương pháp trắc quang, bước sóng hấp thụ cực đại 277 nm, cuvet dày 1 cm, dùng dung dịch acid hydrocloric 0,1 M (TT) làm mẫu trắng [1]

Dược điển Anh định lượng metronidazol theo phương pháp chuẩn độ điện thế bằng axit pecloric 0,1M, 1,0 ml dung dịch axit pecloric tương đương 17,12 mg metronidazol [30]

Gholivand Mohammad Bagher đã xây dựng phương pháp xác định metronidazol bằng phương pháp von-ampe hòa tan catot trên điện cực cacbon nhão phủ màng polime, nền đệm Britton-Robinson pH = 7,0 Giới phát hiện của phương pháp là 3,59.10-5 mg/l [40]

Bollo đã nghiên cứu tính chất điện hóa của metronidazol bằng phương pháp von-ampe vòng trong dung dịch hỗn hợp (dimetylfomandehit + amonixitrat 60 : 40, KCl 0,3M) cho thấy với điện cực HMDE và GCE có sóng khử tại -1,090 V và -1,082 V [28]

Brett đã nghiên cứu xác định metronidazol bằng phương pháp von-ampe xung vi phân với điện cực GC biến tính trong đệm axetat pH = 4,5, giới hạn phát hiện là 3,44 µM [29]

Nhóm tác giả Trương Thị Nguyệt, Nguyễn Thị Thanh Thảo, Nguyễn Kim Xuân đã định lượng đồng thời metronidazol, cloramphenicol và dexamesanthon acetat bằng phương pháp HPLC [12]

Ngoài ra, trên thế giới đã có khá nhiều nghiên cứu tính chất điện hóa và định lượng metronidazol và các dẫn chất của 5-nitroimidazole bằng phương pháp điện hóa [26, 40, 41, 47, 49, 55, 59, 62, 67, 81, 88…]

Các nghiên cứu trong nước về định lượng metronidazol ít và chỉ tập trung theo phương pháp HPLC [1, 12]

1.2.3 Các phương pháp xác định clorpheniramin maleat

Theo Dược điển Việt Nam 4, xác định clorpheniramin maleat bằng phương pháp quang phổ hấp thụ vùng tử ngoại, bước sóng 265 nm, cuvet dày

1 cm, dùng dung dịch H2SO4 0,25 M làm mẫu trắng [1]

Dược điển Anh định lượng clorpheniramin maleat bằng phương pháp chuẩn độ điện thế bằng dung dịch HClO4 0,1M 0,1 ml dung dịch HClO40,1M tương đương 19,54 mg C16H19ClN2.C4H4O4 [30]

Einar Jacobsen và Knut Hbgberg đã nghiên cứu định lượng clorpheniramin maleat trong chế phẩm bằng phương pháp cực phổ trong nền

H2SO4 0,25M cho sóng cực phổ tại -0,7V [45]

Leena Suntornsuk và các cộng sự đã nghiên cứu định lượng clorpheniramin maleat và paracetamol bằng phương pháp HPLC, giới hạn định lượng là 4 µg/ml [76]

Abdolraouf Samadi – Maybodi đã nghiên cứu xác định clorpheniramin maleat bằng phương pháp huỳnh quang, giới hạn phát hiện 0,18µg/ml [69]

Một số tác giả khác: Indrayanto Gunawan [45], García A [39], Nevin Erk [37] tiến hành nghiên cứu định lượng clorpheniramin bằng phương pháp HPLC trong một số chế phẩm thuốc đạt giới hạn định lượng

1.2.4 Các phương pháp xác định cefadroxil

Theo Dược điển Việt Nam 4, hàm lượng cefadroxil được xác định bằng phương pháp HPLC với thành phần pha động là hỗn hợp acetonitril: đệm photphat pH 5,0 (4 : 96) Cột thép không gỉ (25 cm x 4 mm) được nhồi pha tĩnh C-18 (5 m hoặc 10 m), detector quang phổ tử ngoại đặt ở bước sóng

230 nm Tốc độ dòng: 1,5 ml/phút Thể tích tiêm: 10 l [1]

Theo dược điển Anh 2007, hàm lượng cefadroxil xác định bằng phương pháp HPLC với thành phần pha động: Hỗn hợp acetonitril : dung dịch dihidrophotphat 2,72 g/l (4:96) Cột thép không gỉ (25cm x 4,6mm) nhồi pha tĩnh C-18 (5 m), detector quang phổ tử ngoại đặt ở bước sóng 254 nm Tốc

độ dòng: 1,0 ml/phút Thể tích tiêm: 20 l [30]

Papadoyannis đã xác định bốn kháng sinh họ cephalosporin trong dược phẩm và dịch sinh học bằng phương pháp HPLC detector quang phổ tử ngoại đặt ở bước sóng 265 nm Giới hạn phát hiện đối với cefadroxil và cefaclor là 0,01 µg/ml và 0,005 µg/ml

Ch Aswani Kumar và các cộng sự đã xác định cefadroxil theo phương pháp trắc quang dựa vào phản ứng của cefadroxil với 1, 2-naphthoquinone-4-sulphonate trong môi trường NaOH tạo thành phức chất màu vàng hấp thụ cực đại tại 475 nm, giới hạn phát hiện là 10 µg/ml [25]

M Hefnawy và các cộng sự đã xác định cefadroxil và cefaclor trong dược phẩm và dịch sinh học bằng phương pháp huỳnh quang, giới hạn phát hiện là 5ng/ml [42]

Mrestania Yahya đã xác định 9 kháng sinh họ cephalosporin trong nước tiểu bằng phương pháp điện di mao quản vùng với đệm xitrat pH = 6,0, giới hạn phát hiện cefadroxil 5,0 µg/ml; cefaclor 4,0 µg/ml [60]

Trên thế giới đã có nghiên cứu định lượng cefadroxil và các kháng sinh

họ cephalosporin bằng phương pháp điện hóa [21, 38, 45, 68, 71, 92], nhưng

chủ yếu là các nghiên cứu định lượng bằng các phương pháp HPLC, FIA, điện di mao quản… [22, 25, 36, 50, 51, 52, 62, 65, 70, 76, 79, 82, 83…]

Trong nước, có nhóm các tác giả Phùng Thế Đồng, Trần tử An đã có các nghiên cứu định lượng cephalexin - một chất trong họ cephalosporin bằng

kỹ thuật sóng vuông quét nhanh [6] Trong một nghiên cứu mới được công

bố, nhóm nghiên cứu của PGS.TS Trần Chương Huyến và Nguyễn Thị Kim Thường ở Trường Đại học Khoa học tự nhiên – ĐHQGHN đã định lượng cephalexin- bằng phương pháp von-ampe hòa tan hấp phụ xung vi phân, giới hạn phát hiện 4,8.10-9M [8]

Nhóm các phương pháp phân tích cực phổ và von-ampe là những phương pháp quan trọng nhất trong số các phương pháp phân tích điện hóa Các phương pháp này đều dựa trên lý thuyết về quá trình điện cực, khảo sát

sự phụ thuộc của cường độ dòng điện vào điện thế đặt lên điện cực làm việc trong quá trình điện phân dung dịch phân tích Phương pháp cực phổ (Polarography) được nhà Hóa học người Sec Jaroslav Hevrovský phát minh ra năm 1922 Với phát minh này năm 1959 ông đã được tặng giải thưởng Nobel

về hóa học Hạn chế của phương pháp cực phổ (cổ điển) chính là sự xuất hiện dòng tụ điện sinh ra trên điện cực giọt thủy ngân, dòng này có cường độ tương ứng dòng điện gây ra bởi chất điện hoạt với nồng độ khoảng 10-5M nên giới hạn định lượng của cực phổ cổ điển là 10-5M Hevrovský, Ilkovic và các nhà Điện hóa đã phát minh ra các phương pháp cực phổ hiện đại như: cực phổ sóng vuông; cực phổ xung Các phương pháp này đã đạt giới hạn định lượng

cỡ 10-7 – n.10-8M [9, 10, 13] Đối với các hợp chất hữu cơ, thường có đặc tính điện hóa bất thuận nghịch Trên thế giới và Việt Nam đã có một số nghiên cứu về định lượng các hợp chất hữu cơ bằng phương pháp điện hóa và có nhiều thành công [68, 71, 75, 84]

Vì vậy, trong luận án chúng tôi chọn phương pháp cực phổ xung vi phân và von-ampe hòa tan hấp phụ để tiến hành định lượng các dược phẩm 1.3.1 Cực phổ xung vi phân (Diffrerential Pulse Polarography – DPP)

Trong phương pháp xung vi phân, điện cực được phân cực bằng điện

áp một chiều biến thiên tuyến tính với tốc độ chậm Ở cuối mỗi chu kỳ giọt, trên khung điện áp biến đổi người ta đặt thêm một xung vuông góc với biên

độ thay đổi từ 10 – 100mV, độ dài xung từ 40 – 100ms Ghi dòng tại hai thời điểm, thường là 17ms trước khi nạp xung và 17ms trước khi ngắt xung, tại thời điểm này được xem là dòng tụ điện nhỏ nhất, hai giá trị này được gửi vào

bộ so sánh và kết quả ra bộ ghi là hiệu số của hai giá trị đó Dạng đường cực phổ có dạng một cực đại Phương pháp DPP có độ nhạy khoảng 10-7 – 10-8M

Sự phụ thuộc dòng cực đại trong cực phổ xung vi phân vào các thông

số của quá trình đo cực phổ được tính toán lý thuyết cho hệ thức sau:

I = K.C (1.1) Trong đó:

Với: n : số e trao đổi trong phản ứng điện cực

1.3.2 Phương pháp Von-ampe hòa tan hấp phụ (AdSV)

1.3.2.1 Nguyên tắc

Nguyên tắc phương pháp Von-ampe hòa tan hấp phụ giống như phương pháp von-ampe hòa tan Quá trình phân tích theo phương pháp von-ampe hòa tan hấp phụ cũng gồm ba giai đoạn: Giai đoạn làm giàu, giai đoạn dừng và giai đoạn hòa tan Điểm khác biệt căn bản của phương pháp von am-pe hòa tan hấp phụ với phương pháp von-ampe hòa tan là quá trình làm giàu Chất phân tích được hấp phụ lên bề mặt điện cực làm việc (WE)

và được làm giàu Trong giai đoạn này, thế trên WE được giữ không đổi và dung dịch phân tích được khuấy trộn đều Kết thúc giai đoạn này, ngừng khuấy để dung dịch yên tĩnh trong khoảng 15 – 30 s Trong giai đoạn hòa tan, tiến hành quét thế catot để khử các tiểu phân điện hoạt trên bề mặt WE

và đồng thời ghi tín hiệu hòa tan Iht (dòng hòa tan) và Eht (thế hòa tan) Trong đó, Iht = f(E), E là thế trên WE Khi ghi tín hiệu hòa tan có thể sử dụng một kỹ thuật von – ampe hòa tan nào đó, chẳng hạn von – ampe xung

vi phân, von – ampe sóng vuông,

Thông thường AdSV có thể thực hiện được trên hết các loại điện cực: HMDE, SMDE, Pt, than nhão (CPE), than thủy tinh (GC), điện cực graphit ngâm tẩm, các điện cực có biến tính hóa học Tuy nhiên hầu hết các nghiên cứu sử dụng điện cực HMDE vì điện cực này có nhiều ưu điểm: bề mặt dễ làm sạch, độ lặp lại cao, dễ tự động hóa [7, 9, 10]

1.3.2.2 Giai đoạn làm giàu

Chất phân tích được tích lũy bằng cách hấp phụ lên ranh giới tiếp xúc dung dịch – điện cực làm việc Có ba kiểu hấp phụ đặc trưng đó là hấp phụ theo kiểu điện hóa, hấp phụ do ái lực hóa học và hấp phụ đẳng nhiệt

Một số hợp chất hữu cơ có nhóm chức có khả năng hấp phụ lên bề mặt điện cực tại thế xác định (hấp phụ do ái lực hóa học) Đây là một trong những đối tượng nghiên cứu mới của phương pháp von-ampe hòa tan hấp phụ được

áp dụng để phân tích các chất hữu cơ có hoạt tính sinh học trong dược phẩm

1.3.2.3 Giai đoạn dừng

Sau giai đoạn làm giàu ngừng khuấy để dung dịch yên tĩnh trong khoảng 10 – 30 s để chất phân tích phân bố đều trên bề mặt điện cực và chuyển dung dịch từ trạng thái động sang trạng thái tĩnh cho kết quả ghi dòng

ổn định hơn

1.3.2.4 Giai đoạn hòa tan

Giai đoạn này hoàn toàn giống với giai đoạn hòa tan trong phương pháp von-ampe hòa tan thông thường, tức là quét thế tuyến tính theo thời gian theo chiều catot, tức là quét thế âm dần để khử chất hấp phụ trên bề mặt điện cực làm việc và đồng thời ghi tín hiệu hòa tan bằng kỹ thuật von-ampe hòa tan, khi đó phương pháp sẽ được gọi là von-ampe hòa tan catot

Ngược lại, nếu quét thế theo chiều anot, tức là theo chiều thế dương dần để oxi hóa chất hấp phụ trên bề mặt điện cực làm việc và ghi tín hiệu hòa tan bằng kỹ thuật von-ampe Khi đó phương pháp sẽ được gọi là von-ampe hòa tan anot

Trong phương pháp AdSV, tín hiệu thu được có dạng pic Tín hiệu von-ampe hòa tan tỉ lệ thuận với nồng độ của chất hấp phụ trên bề mặt điện cực làm việc theo phương trình:

Q = n.F.S.C0 Trong đó, Q (C) là điện lượng cần thiết để khử chất điện hoạt đã được hấp phụ, n là số electron trao đổi trong phản ứng điện cực tổng cộng, F là hằng số Faraday, S (cm2) là diện tích bề mặt điện cực, C0(mol/cm2) là nồng độ của chất hấp phụ trên bề mặt điện cực [9]

Với tốc độ quét thế xác định, dòng pic hoà tan (Ip) tỉ lệ thuận với Q, với

S và C0 Khi các điều kiện hấp phụ được lặp lại, C0 tỉ lệ thuận với nồng độ chất phân tích trong dung dịch (C), nên Ip tỉ lệ thuận với S và C Vì vậy, với một chất nghiên cứu, một loại điện cực, diện tích điện cực, đặc tính bề mặt điện cực lặp lại thì cường độ dòng Ip = K.C, trong đó K là hệ số thực nghiệm,

phụ thuộc vào các điều kiện thực nghiệm: điều kiện tích lũy, điều kiện hòa tan

và bản chất của dung dịch chất nghiên cứu

Thế đỉnh pic hòa tan (Ep) và cường độ dòng đỉnh hòa tan (Ip) phụ thuộc vào các yếu tố như: thành phần nền, pH, thế tích lũy, thời gian tích lũy, bản chất của điện cực làm việc, kỹ thuật ghi dòng hòa tan Trong các điều kiện xác định Ep đặc trưng cho bản chất điện hóa của chất phân tích nên dùng trong phân tích định tính, Ip tỉ lệ thuận với nồng độ của chất phân tích nên dùng trong phân tích định lượng

Ngoài những ưu điểm giống như phương pháp ASV, phương pháp AdSV còn có những ưu điểm sau:

- Cho phép xác định đồng thời nhiều ion kim loại ở những nồng độ vết hoặc siêu vết

- Đạt được độ chọn lọc cao vì có thể lựa chọn phối tử tạo phức bền và chọn lọc với ion kim loại cần phân tích Phương pháp AdSV đạt được giới hạn phát hiện rất nhỏ, khoảng 10–9  10–11M, hoặc 10-12 M

- Phương pháp AdSV có qui trình phân tích đơn giản: không có giai đoạn chiết, tách hoặc trao đổi ion và do đó, tránh được sự nhiễm bẩn mẫu hoặc mất chất phân tích, giảm thiểu được sai số Mặt khác, có thể loại trừ được ảnh hưởng của các yếu tố cản trở bằng cách chọn các điều kiện thí nghiệm thích hợp như: thành phần nền, pH, thế điện phân làm giàu, ảnh hưởng của các chất khác

- Xác định được gần 60 ion kim loại và hơn 200 hợp chất hữu cơ

- Phương pháp AdSV đặc biệt có ưu điểm trong phân tích các chất hữu

cơ, dược phẩm bao gồm những chất có hoạt tính điện hóa, có khả năng hấp phụ trên bề mặt điện cực giọt thủy ngân và các chất không có hoạt tính điện hóa trực tiếp trên điện cực giọt cũng có thể xác định bằng cách gắn với các nhóm như nitro, nitroso… hoặc thủy phân tạo thành chất mới có hoạt tính điện hóa

- Dựa vào các đặc tính hấp phụ ta có thể giải quyết được các bài toán liên quan đến quá trình điện cực, cơ chế của phản ứng xảy ra trên điện cực

1.4.1 Mẫu thuốc

Các mẫu thuốc chuẩn và các chế phẩm thuốc được rung siêu âm hòa tan trong nước cất với các nồng độ thích hợp để khảo sát các điều kiện và định lượng

1.4.2 Mẫu nước tiểu

Mẫu nước tiểu có thành phần phức tạp, gồm 95 - 96% là nước và một ít chất khô Trong nước tiểu có chứa nhiều chất hóa học như urê, axit uric, creatinin, natri, kali, lưu huỳnh, photphat, sulfat, NaCl, Flo, Chì, và một số hoocmon…., khá nhiều thuốc sau khi đi vào cơ thể được thanh thải dưới dạng không chuyển hóa hoặc dạng chuyển hóa qua cầu thận vào nước tiểu Người bình thường không mắc chứng suy thận, một ngày đêm thải ra khoảng 1 – 1,5 lít nước tiểu Các chất trong nước tiểu có thể gây kìm hãm phản ứng điện cực, vì vậy cần phải tách, xử lý mẫu trước khi phân tích

Trong phân tích các mẫu sinh học thông thường có 3 phương pháp xử

lý mẫu là phương pháp tạo kết tủa, phương pháp chiết lỏng – lỏng và phương pháp chiết lỏng – rắn (chiết pha rắn) [19, 52]

* Chiết pha rắn (solid phase extraction - SPE)

Chiết pha rắn (SPE) là một phương pháp chuẩn bị mẫu để làm giàu và làm sạch chất phân tích từ dung dịch bằng cách hấp phụ lên một cột chiết pha rắn, sau đó chất phân tích được rửa giải (giải hấp) bằng một dung môi thích hợp Ưu điểm của phương pháp SPE là hiệu suất thu hồi cao, khả năng làm sạch chất phân tích lớn, dễ tự động hóa, lượng dung môi sử dụng ít [19]

Quá trình chiết pha rắn gồm 4 bước chính như sau:

Hình 1.5: Các bước trong kỹ thuật chiết pha rắn Hiện nay, kỹ thuật chiết pha rắn (SPE) được sử dụng khá nhiều để tách

và làm giàu chất phân tích Chiết pha rắn phù hợp để xử lý các mẫu môi trường, mẫu thuốc, mẫu lâm sàng [14, 80] Vật liệu hấp thu trong chiết pha rắn hiện nay được cải thiện rất nhiều trong cột chiết Oasis HLB Vật liệu hấp thu được trùng hợp từ hai monome có tỷ lệ bằng nhau là N-vinylpyrolidon có tính ưa nước và divinylbenzen có tính kỵ nước

Hình 1.6: Vật liệu hấp phụ trong pha tĩnh cột HLB

Mẫu phân tích

Bơm mẫu qua cột

Rửa các chất ảnh hưởng

Rửa giải chất phân tích

Các chất ảnh hưởng

R

Hoạt hóa cột

Chất hấp phụ Oasis có cấu trúc không gian lớn (thể tích lỗ rỗng là 1,3cm2/g), có diện tích bề mặt trên một đơn vị khối lượng pha tĩnh cao (810m2/g) Các nhóm chức phân cực của monome N-vinylpyrolidon đã tạo ra các hốc phân cực nên pha tĩnh Oasis có hệ số lưu giữ đối với các chất phân tích phân cực cao hơn 3 lần so với cột C18 truyền thống đồng thời có khả năng làm việc trong khoảng pH rộng

Hình 1.7 So sánh khả năng lưu giữ giữa cột C18 và cột Oasis® HLB Qua tham khảo các tài liệu, hiện nay chưa có tài liệu nào công bố qui trình xử lý mẫu nước tiểu để xác định cefadroxil, và ofloxacin theo phương pháp von-ampe xung vi phân và von –ampe hòa tan hấp phụ Theo Dược điển Việt Nam, cefadroxil được định lượng bằng phương pháp HPLC, cột C-18, thành phần pha động là hỗn hợp acetonitril: đệm photphat pH 5,0 (4 : 96) Ofloxacin được xác định bằng phương pháp HPLC với cột C-18, thành phần pha động là dung dịch natri lauryl sulfat 0,24%, - acetonitril - acid acetic băng (580 : 400 : 20) [1]. Đây là các căn cứ quan trọng để khảo sát các điều kiện xử lý mẫu theo phương pháp chiết pha rắn với cột chiết HLB

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 THIẾT BỊ DỤNG CỤ VÀ HÓA CHẤT

2.1.1 Thiết bị, dụng cụ

1 Máy cực phổ đa năng:

Các phép đo đều được làm việc trên máy cực phổ đa năng 757 và 797VA Computrace do hãng Metrohm (Thụy Sĩ) sản xuất gồm:

- Các điện cực:

+ Điện cực làm việc (WE): Điện cực giọt thuỷ ngân treo (HMDE) + Điện cực so sánh (RE): Ag|AgCl||Cl-; điện cực luôn được bảo quản trong dung dịch KCl bão hòa

+ Điện cực phù trợ (AE): Điện cực Pt

- Bình điện phân: Bình điện phân có dung tích 50ml, được chế tạo từ thuỷ tinh thạch anh Nắp bình có cấu tạo thích hợp để dẫn khí trơ (N2) đuổi oxi hoà tan trong dung dịch đo và có một môtơ nhỏ gắn với que khuấy để khuấy trộn đều dung dịch đo

2 Máy đo pH – Meter HM 16S của Nhật Bản

3 Cân phân tích Scientech SA 210 – Mỹ, độ chính xác ± 0,0001 gam

4 Máy cất nước hai lần WSC/4D của hãng Haminton – Anh

5 Bể điều nhiệt Memmert của Đức

6 Các dụng cụ thủy tinh: Các loại pipet, micropipet, bình định mức, cốc đong, ống đong đều của Đức sản xuất (Các dụng cụ đều được rửa sạch bằng dung dịch HNO3 và hỗn hợp rửa K2Cr2O7 và H2SO4 đặc sau đó tráng lại nhiều lần bằng nước cất hai lần)

7 Các micropipet cho phép lấy dung dịch từ 10µl đến 5000µl

8 Thiết bị chiết pha rắn và cột chiết pha rắn Oasis HLB Extraction Cartridge do hãng Water – Mỹ sản xuất, với các thông số: