1. Máy cực phổ đa năng:
Các phép đo đều được làm việc trên máy cực phổ đa năng 757 và 797VA Computrace do hãng Metrohm (Thụy Sĩ) sản xuất gồm:
- Các điện cực:
+ Điện cực làm việc (WE): Điện cực giọt thuỷ ngân treo (HMDE) + Điện cực so sánh (RE): Ag|AgCl||Cl-; điện cực luôn được bảo quản trong dung dịch KCl bão hòa.
+ Điện cực phù trợ (AE): Điện cực Pt
- Bình điện phân: Bình điện phân có dung tích 50ml, được chế tạo từ thuỷ tinh thạch anh. Nắp bình có cấu tạo thích hợp để dẫn khí trơ (N2) đuổi oxi hoà tan trong dung dịch đo và có một môtơ nhỏ gắn với que khuấy để khuấy trộn đều dung dịch đo.
2. Máy đo pH – Meter HM 16S của Nhật Bản
3. Cân phân tích Scientech SA 210 – Mỹ, độ chính xác ± 0,0001 gam 4. Máy cất nước hai lần WSC/4D của hãng Haminton – Anh
5. Bể điều nhiệt Memmert của Đức
6. Các dụng cụ thủy tinh: Các loại pipet, micropipet, bình định mức, cốc đong, ống đong... đều của Đức sản xuất. (Các dụng cụ đều được rửa sạch bằng dung dịch HNO3 và hỗn hợp rửa K2Cr2O7 và H2SO4 đặc sau đó tráng lại nhiều lần bằng nước cất hai lần).
7. Các micropipet cho phép lấy dung dịch từ 10µl đến 5000µl.
8. Thiết bị chiết pha rắn và cột chiết pha rắn Oasis HLB Extraction Cartridge do hãng Water – Mỹ sản xuất, với các thông số:
Diện tích bề mặt 804 (m2/g) Đường kính mao quản trung bình 83 (Å) Tổng dung lượng mao quản 1,31 (cm3/g) Kích thước hạt trung bình 29,3 µm
Dung tích cột 6ml
Khối lượng chất nhồi cột 200mg 2.1.2. Hóa chất
- Nước cất được sử dụng là nước cất hai lần trên máy Halminton
- Tất cả các hoá chất sử dụng trong nghiên cứu đều đạt độ tinh khiết phân tích (PA)
- Các chất chuẩn metronidazol; cefadroxil; ofloxacin; clorpheniramin maleat là chất chuẩn tinh khiết do Viện kiểm nghiệm - Bộ Y tế cung cấp.
Dung dịch gốc chuẩn ofloxacin: Cân chính xác 50,0mg chất chuẩn
ofloxacin, hòa tan bằng nước cất, định mức đến 100ml, siêu âm 15 phút.
Dung dịch gốc chuẩn clopheniramin maleat: Cân chính xác 50,0mg
chất chuẩn clopheniramin maleat, hòa tan bằng nước cất rồi đến 1000ml, siêu âm 15 phút.
Dung dịch gốc chuẩn cefadroxil: Cân chính xác 50,0mg chất chuẩn
cefadroxil, hòa tan bằng nước cất rồi định mức bằng nước cất đến 1000ml, siêu âm 15 phút.
- Các dung dịch phân tích được pha hàng ngày từ dung dịch chuẩn gốc. - Các dung dịch đệm pha theo Dược điển Việt Nam 4 [1]:
Dung dịch đệm Britton-Robinson (BR) pH từ 2 đến 12 [1]
- Pha dung dịch H3PO4 0,1M: Lấy 2,8 ml H3PO4 đậm đặc pha loãng và định mức bằng nước cất đến 500ml.
- Pha dung dịch CH3COOH 0,1M: Lấy 3,0 ml CH3COOH băng pha loãng và định mức bằng nước cất đến 500ml.
- Pha H3BO3 0,1M: Lấy 3,1 gam H3BO3 khan hòa tan và định mức bằng nước cất đến 500ml.
- Trộn H3PO4 0,1M, CH3COOH 0,1M, H3BO3 0,1M (1:1:1) được hỗn hợp đệm Britton-Robinson (BR). Dùng CH3COOH đặc và NaOH 50% để điều chỉnh pH. Kiểm tra bằng máy đo pH.
Dung dịch đệm photphat:[1]
- Pha dung dịch kalidihidrophotphat 0,1M: Cân 13,61 gam KH2PO4 hòa tan rồi định mức bằng nước cất đến 1000ml.
- Pha dung dịch NaOH 0,1M: Cân 4,00 gam NaOH khan hòa tan, pha loãng bằng nước cất thành 1000ml.
Các đệm photphat chuẩn pH từ 5,8 đến 8,0 được pha bằng cách trộn 50
ml dung dịch kali dihydrophosphat 0,1 M với lượng dung dịch natri hydroxyd
0,1 M như chỉ dẫn trong bảng 2.1 [1] và thêm nước vừa đủ 100 ml.
Bảng 2.1: Pha dung dịch đệm photphat theo Dược điển Việt Nam pH Số ml dung dịch NaOH 0,1 N pH Số ml dung dịch NaOH 0,1 N 5,8 3,72 7,0 29,63 6,0 5,70 7,2 35,00 6,2 8,60 7,4 39,50 6,4 12,60 7,6 42,80 6,6 17,80 7,8 45,20 6,8 23,65 8,0 46,80
Dung dịch đệm axetat:
Dung dịch đệm acetat pH 4,4: Hoà tan 136 g natri acetat (TT) và 77 g
amoni acetat (TT) trong nước, thêm nước vừa đủ 1000 ml. Thêm 250 ml acid acetic băng (TT), trộn đều.
Dung dịch đệm acetat pH 4,6: Hoà tan 5,4 g natri acetat (TT) trong 50 ml nước, thêm 2,4 g acid acetic băng (TT) và thêm nước vừa đủ 100 ml. Điều
chỉnh pH nếu cần.
Dung dịch đệm acetat pH 5,0: Hoà tan 13,6 g natri acetat (TT) và 6 ml
acid acetic băng (TT) trong nước và thêm nước vừa đủ 1000 ml.
Dung dịch đệm acetat pH 6,0: Hoà tan 100 g amoni acetat (TT) trong 300 ml nước, thêm 4,1 ml acid acetic băng (TT). Nếu cần, điều chỉnh pH bằng dung dịch amoniac 10 M (TT) hay dung dịch acid acetic 5 M (TT), thêm
nước vừa đủ 500 ml.
2.2. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU
2.2.1. Phân tích hàm lượng hoạt chất trong chế phẩm thuốc
Gồm các chế phẩm thuốc chứa các hoạt chất kháng sinh, kháng virut hiện đang lưu thông trên thị trường Việt Nam:
2.2.1.1. Thuốc chứa ofloxacin
1. Thuốc viên nén Ofloxacin 200mg sản xuất tại Công ty Cổ phần Dược phẩm Imexpharm; (Số lô SX: 020512).
2. Thuốc nhỏ mắt Ofloxacin 0,3% (15mg/5ml) sản xuất tại Công ty Cổ phần Traphaco (Số lô SX: 290811).
2.2.1.2. Thuốc chứa metronidazol
1. Thuốc viên nén bao film Flagyl 250mg sản xuất tại Công ty TNHH Sanofi – Avantis Việt Nam. Số lô SX: 230911.
2. Thuốc viên nén Metrodinazole 250mg sản xuất tại Công ty Cổ phần Dược phẩm Hà Tây. Số lô SX: 290412.
2.2.1.3. Thuốc chứa clorpheniramin maleat
1. Thuốc Pacemin viên nang (paracetamol 325mg; clorpheniramin maleat 4mg) sản xuất tại Công ty Cổ phần Dược phẩm Hà Tây. Số lô SX: 121110.
2. Thuốc Clorpheniramin 4mg viên nén sản xuất tại Công ty Cổ phần Dược phẩm Hậu Giang. Số lô SX: 021210.
2.2.1.4. Các thuốc chứa cefadroxil:
1. Thuốc viên nang Ocefacel (cefadroxil 500mg) sản xuất tại Công ty Cổ phần Dược Hà Tây.
2. Thuốc viên nang cefadroxil (500 mg) sản xuất tại Công ty TNHH MTV Dược phẩm và sinh học y tế Mebiphar
3. Thuốc viên nang cefadroxil (500 mg) sản xuất tại Công ty Cổ phần Dược phẩm TW- Vidapha.
4. Thuốc bột Tytdroxil (cefadroxil 250mg) sản xuất tại Công ty Cổ phần Dược phẩm Glomed.
2.2.2. Phân tích hàm lượng các thuốc trong nước tiểu bệnh nhân
Nước tiểu của các bệnh nhân điều trị tại Bệnh viện 354, Bệnh viện Thanh Nhàn - Hà Nội và phòng khám tư nhân tại huyện Hoài Đức – Hà Nội. Các bệnh nhân đều không mắc chứng suy thận.
2.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.3.1. Tiến hành thí nghiệm theo phương pháp von-ampe vòng (CV)
Các thí nghiệm đo đường von-ampe vòng được ghi trong một khoảng thế rộng, xác định giá trị Ip và Ep của tín hiệu thu được.
- Ghi đường CV trực tiếp: Cho dung dịch cần nghiên cứu vào bình điện phân, loại khí oxi bằng khí nitơ trong thời gian 300s, ghi đường hòa
tan một vòng trong khoảng thế xác định, quan sát sự xuất hiện pic trên đường phân cực catot và đường phân cực anot, xác định các thông số đặc trưng của đường CV.
- Ghi đường CV hòa tan hấp phụ:
Bước 1: Tích lũy chất trên bề mặt điện cực tại một thế tích lũy trong một khoảng thời gian nhất định. Trong giai đoạn này dung dịch được khấy với tốc độ không đổi, chất nghiên cứu đến bề mặt điện cực, hấp phụ trên bề mặt điện cực đó.
Bước 2: Cân bằng: ngừng khuấy dung dịch trong 10s để chất phân bố đều trên bề mặt điện cực.
Bước 3: Hòa tan: ghi đường hòa tan một vòng hoặc đa vòng trong một khoảng thế nhất định. Quan sát sự xuất hiện pic trên đường phân cực catot và đường phân cực anot. Xác định các giá trị đặc trưng như thế đỉnh pic, cường độ dòng pic.
Đường CV của mẫu trắng (nền) là mẫu có thành phần tương tự như dung dịch nghiên cứu nhưng không chứa chất nghiên cứu được ghi trong cùng điều kiện với đường CV của các mẫu phân tích và được ghi trước bất kỳ nghiên cứu nào.
2.3.2. Tiến hành thí nghiệm theo phương pháp von-ampe xung vi phân (DP) Bước 1: Loại bỏ khí oxi, sục khí nitơ vào dung dịch trong bình điện hóa Bước 1: Loại bỏ khí oxi, sục khí nitơ vào dung dịch trong bình điện hóa để đuổi khí oxi trong khoảng thời gian nhất định (từ 60s – 180s) trong thời gian này dung dịch được khuấy đều bởi que khuấy.
Bước 2: Cân bằng, dung dịch sau khi loại bỏ khí oxi, ngừng khuấy dung dịch trong 10s để ổn định dung dịch và bề mặt điện cực.
Bước 3: Ghi đo dòng xung vi phân trong một khoảng thế nhất định, quan sát và ghi các giá trị thế đỉnh pic, cường độ dòng pic.
2.3.3. Tiến hành thí nghiệm theo phương pháp xung vi phân hòa tan – hấp phụ (DP – AdSV)
Bước 1: Loại bỏ khí oxi và tích lũy chất trên bề mặt điện cực: sục khí nitơ vào dung dịch trong bình điện hóa để đuổi khí oxi tại thế tích lũy và thời gian tích lũy thích hợp (đã được khảo sát trước để lựa chọn) trong thời gian này dung dịch được khuấy đều bởi que khuấy.
Bước 2: Cân bằng, dung dịch sau khi loại bỏ khí oxi, ngừng khuấy dung dịch trong 10s để ổn định dung dịch và bề mặt điện cực.
Bước 3: Ghi đo dòng xung vi phân trong một khoảng thế nhất định, quan sát và ghi các giá trị thế đỉnh pic, cường độ dòng pic.
2.3.4. Tiến hành thí nghiệm theo kỹ thuật chiết pha rắn (SPE)
Kỹ thuật chiết pha rắn (SPE) thường được sử dụng cho chất phân tích trong các đối tượng mẫu sinh học [75]. Cột chiết pha rắn HLB với pha tĩnh kết hợp giữa cơ chế chiết pha đảo và tương tác ưa nước (hydrophilic- lypophilic water-wettable revered phase) đã được áp dụng rất hiệu quả trong phân tích các đối tượng mẫu sinh học nói chung và mẫu nước tiểu nói riêng.
Cột chiết được sử dụng trong luận án là cột chiết HLB Oasis loại 6ml, chứa 200mg chất hấp thu là sản phẩm trùng hợp từ hai monome có tỷ lệ bằng nhau là N-vinylpyrolidon và divinylbenzen. Trước khi tiến hành chiết hoạt hóa cột bằng 4 ml metanol khoảng 30 phút sau đó rửa cột bằng nước cất hai lần. 2.3.5. Phương pháp định lượng các hoạt chất trong thuốc
Sử dụng phương pháp thêm chuẩn. Sử dụng phần mềm Excel và Origin 8.0 để vẽ đồ thị, thiết lập phương trình đường thêm chuẩn theo phương pháp
hồi qui tuyến tính dạng y = a + bx.
Từ đó tính Cx theo công thức: Cx =
b a
Với: Cx - nồng độ hoạt chất có trong dung dịch đo a, b - hệ số phương trình hồi quy.
Tính khối lượng hoạt chất có trong a (mg) mẫu cân ban đầu: m = V Cx F 10-3 (mg)
Trong đó:
m - khối lượng chất phân tích có trong g (mg) mẫu V - thể tích dung dịch được pha từ g (mg)
F - hệ số pha loãng
Cx - nồng độ của hoạt chất xác định từ phương trình hồi quy Sự khai khác về hàm lượng so với kết quả ghi trên nhãn:
C% = 100 m m m n n i
Trong đó: mi là khối lượng xác định theo phương pháp phân tích mn là khối lượng thuốc ghi trên nhãn thuốc
2.3.6. Các bước khảo sát
2.3.6.1. Khảo sát thành phần và pH dung dịch nền
Khảo sát thành phần và pH của dung dịch nền rất quan trọng quyết định đến kết quả phân tích. Trong dung dịch điện phân để giảm sự điện di và sự ảnh hưởng của dòng tụ điện người ta cần cho thêm lượng dư chất điện li trơ vào dung dịch. Chất điện li thường dùng là: KCl; KNO3; NH4Cl; NaOH; HCl. pH của dung dịch cũng ảnh hưởng đến thế đỉnh và cường độ dòng khuếch tán giới hạn. Khi thay đổi pH của dung dịch đo, thế đỉnh pic có thể dịch chuyển về phía âm hơn hoặc dương hơn tùy vào phản ứng điện cực. Trong luận án chúng tôi đã lựa chọn khảo sát các dung dịch nền NaOH; đệm photphat; đệm axetat; đệm Britton-Robinson ở các pH từ 2 đến 13 cho các thuốc.
Lấy chính xác một thể tích thuốc chuẩn có nồng độ nhất định cho vào bình định mức 25 ml, thêm nước cất đến thể tích khoảng 5ml, thêm 8 – 10 ml dung dịch đệm, định mức đến vạch. Chuyển toàn bộ dung dịch vào bình điện phân. Tiến hành ghi đo dòng khuếch tán bằng phương pháp von-ampe xung vi phân và von-ampe xung vi phân hòa tan hấp phụ.
2.3.6.2. Khảo sát điều kiện thủy phân cefadroxil
* Khảo sát nồng độ NaOH: Lấy 0,25ml dung dịch cefadroxil có nồng độ 0,05mg/ml cho vào cốc thủy tinh chịu nhiệt, thêm nước cất đến thể tích khoảng 5ml, thêm V ml dung dịch NaOH 1,0M (V = 1,0; 2,0; 3,0; 4,0; 5,0; 6,0 ml), đun cách thủy 60 phút ở nhiệt độ 100oC, lấy ra chuyển vào bình định mức 25 ml, định mức bằng nước cất hai lần đến vạch rồi cho toàn bộ dung dịch vào bình điện hóa. Tiến hành ghi đo bằng phương pháp von-ampe xung vi phân và von-ampe hòa tan hấp phụ.
* Khảo thời gian thủy phân: Lấy 0,25ml dung dịch cefadroxil có nồng độ 0,05mg/ml cho vào cốc thủy tinh chịu nhiệt, thêm nước cất đến thể tích khoảng 5 ml, thêm V ml dung dịch NaOH 1,0M (V là giá trị tốt nhất đã tìm được từ thí nghiệm trên), đun cách thủy ở nhiệt độ 100oC trong thời gian t (từ 5 đến 60 phút), lấy ra chuyển vào bình định mức 25,00ml, định mức bằng nước cất hai lần đến vạch rồi cho toàn bộ dung dịch vào bình điện hóa. Tiến hành ghi đo bằng phương pháp von-ampe xung vi phân và von-ampe hòa tan hấp phụ.
* Khảo sát nhiệt độ thuỷ phân: Lấy 0,25ml dung dịch cefadroxil có nồng độ 0,05mg/ml cho vào cốc thủy tinh chịu nhiệt, thêm nước cất đến thể tích khoảng 5ml, thêm V ml dung dịch NaOH 1,0M, đun cách thủy ở các nhiệt độ từ 30 đến 100oC, chuyển dung dịch vào bình định mức 25ml, định mức bằng nước cất hai lần đến vạch rồi cho toàn bộ dung dịch vào bình điện hóa. Tiến hành ghi đo bằng phương pháp von-ampe xung vi phân và von- ampe hòa tan hấp phụ.
2.3.6.3. Nghiên cứu cơ bản
Các thông số khảo sát:
- Khoảng quét thế: Khảng quét thế có thể xác định dựa vào phổ CV của chất điện hoạt. Khoảng quét thế không ảnh hưởng nhiều đến thế đỉnh
pic và cường độ dòng pic nhưng cần quét thể trong khoảng thế phù hợp sao cho lấy hết chân pic, không cần quá dài làm mất thời gian ghi đo không cần thiết.
- Tốc độ quét thế: Tốc độ quét thế phụ thuộc vào bước nhảy thế, trong phương pháp von-ampe xung vi phân tốc độ quét thế thường từ 5 đến 20 mV/s, tương ứng với bước nhảy thế từ 2 đến 8 mV. Tốc độ quét càng cao thì ghi dòng càng nhanh nhưng cũng ảnh hưởng đến cường độ dòng hòa tan và độ nhạy của phép đo.
- Biên độ xung: Thường từ 10 đến 80 mV, biên độ xung càng cao chiều cao pic càng lớn nhưng lại làm chân pic rộng, giảm độ phân giải.
- Thời gian đuổi khi oxi: Oxi hòa tan trong nước ảnh hưởng đến quá trình phân tích các chất hữu cơ trong nước do ảnh hưởng đến chất lượng đường khuếch tán thậm chí có thể phản ứng với chất phân tích làm giảm nồng độ của chất phân tích. Vì vậy trước khi đo cần thiết phải đuổi oxi khỏi nền. Trong phương pháp von-ampe loại bỏ oxi hòa tan trong nước bằng cách sục khí nito vào dung dịch, thời gian sục khí được chọn khi không có sự ảnh hưởng đến dòng pic.
- Thế tích lũy Eacc: Trong phương pháp von-ampe hòa tan hấp phụ thế tích lũy (làm giàu) là thông số quan trọng. Cần tìm được thế tích lũy phù hợp để chất hấp phụ lên điện cực lớn nhất trong cùng một khoảng thời gian, khi đó dòng hòa tan sẽ có giá trị lớn nhất, tăng độ nhạy của phép phân tích. Với các hợp chất hữu cơ một số tác giả thường chọn thế khoảng – 0,4V.
- Thời gian tích lũy tacc: Thời gian tích lũy càng nhiều thì chất hấp phụ lên điện cực càng lớn làm cường độ dòng hòa tan tăng, nhưng đến một giá trị nhất định cường độ dòng hòa tan sẽ bão hòa. Tùy thuộc nồng độ chất phân tích và yêu cầu phân tích mà có thể chọn thời gian tích lũy phù hợp.
2.3.7. Xử lý mẫu
Đối với chế phẩm ofloxacin:
Dung dịch gốc thử:
+ Đối với thuốc viên: Cân 20 viên thuốc, xác định khối lượng trung bình của 1 viên, nghiền mịn, trộn đều. Cân chính xác lượng thuốc chứa