Thực nghiệm thấy rằng, khi đo mẫu nước tiểu không chứa thuốc cùng điều kiện đo ofloxacin không thấy xuất hiện pic lạ nhưng đường nền bị lệch; tiến hành đo mẫu nước tiểu chứa thuốc có xuất hiện pic đặc trưng của ofloxacin nhưng không cân đối (hình 3.14 và 3.15).
Khi pha loãng nước tiểu rồi thêm thuốc vào đo thấy pic xuất hiện cân đối hơn. Như vậy các thành phần tạp chất trong nước tiểu có ảnh hưởng đến việc ghi đo dòng xung vi phân của ofloxacin nhưng không nhiều (chỉ gây hiệu ứng lệch chân pic mà không làm chuyển dịch thế đỉnh pic và không xuất hiện pic lạ gây nhiễu). Có thể thấy nếu nồng độ ofloxacin trong nước tiểu lớn có thể định lượng trực tiếp, đây có lẽ là ưu điểm rất lớn của phương pháp von- ampe khi định lượng ofloxacin trong nước tiểu so với các phương pháp khác đòi hỏi xử lý mẫu rất phức tạp. Để định lượng được các mẫu nước tiểu có nồng độ ofloxacin thấp (không pha loãng hoặc pha loãng rất ít) vẫn đảm bảo độ chính xác, chúng tôi lựa chọn được phương pháp xử lý mẫu nước tiểu theo phương pháp chiết pha rắn với cột chiết HLB.
-1.00 -1.10 -1.20 -1.30 -1.40 -1.50 -1.60 U (V) -800n -600n -400n -200n 0 I (A ) Hình 3.14: Đường CV của 1,0 ml nước tiểu chứa ofloxacin 10 µg/ml.
-1.10 -1.20 -1.30 -1.40 U (V) -150n -100n -50.0n 0 I (A )
Hình 3.15: Đường DP của 1,0ml nước tiểu không chứa thuốc (1) và 1,0 ml nước tiểu chứa ofloxacin 4 µg/ml (2). Cột chiết Oasis® HLB (hydrophilic-lipophilic balance) với chất hấp phụ kết hợp cơ chế tương tác pha đảo và tương tác ưa nước. Pha tĩnh này được trùng hợp từ hai monome có tỷ lệ bằng nhau là N-vinylpyrolidon có tính ưa nước và divinylbenzen có tính kỵ nước. Các nhóm chức phân cực của monome N-vinylpyrolidon đã tạo ra các hốc phân cực nên pha tĩnh Oasis có hệ số lưu giữ đối với các chất phân tích phân cực
1
cao hơn 3 lần so với cột C18 truyền thống đồng thời có khả năng làm việc trong khoảng pH rộng.
Pha tĩnh Oasis HLB có khả năng lưu giữ tốt các thành phần phân cực, các hợp chất acid, bazơ và cả trung tính, rất thích hợp để chiết và làm giàu các đối tượng thuốc trong mẫu máu và mẫu nước tiểu như kháng sinh β-lactam, các sulfonamids, các quinolones….
Có thể thấy, cột chiết Oasis HLB có nhiều ưu điểm hơn cột C18 về khả năng lưu giữ, tách chiết và khoảng pH làm việc, đặc biệt trong lĩnh vực phân tích dược phẩm nên chúng tôi lựa chọn cột HLB để xử lý mẫu nước tiểu.
Khảo sát thành phần dung dịch rửa giải:
Theo khuyến cáo của nhà sản xuất, với cột chiết Oasis HLB Extraction Cartridge có thể sử dụng dung môi rửa giải là dung dịch CH3OH để tách hiệu quả các dược phẩm. Theo Dược điển Việt nam Hỗn hợp dung dịch natri lauryl sulfat 0,24%, - acetonitril - acid acetic băng (580 : 400 : 20) để phân tích ofloxacin bằng phương pháp HPLC tác giả Chan K. P. và các đồng nghiệp đã dung hệ dung môi acetonitrile – methanol 0,05M - TBA·Cl - TFA (37,5 : 12,5 : 949 : 1) phân tích ofloxacin trong dịch sinh học [33]. Vì vậy chúng tôi tiến hành khảo sát trên một số hỗn hợp dung môi của metanol và acetonnitrin.
Với phương pháp chiết pha rắn (SPE), với các mẫu nước, việc lựa chọn chất hấp phụ và dung môi rửa giải dựa vào đặc tính phân cực và đặc tính ion của chất phân tích. Nếu chất phân tích là ion và phân tử phân cực thì nên sử dụng chất hấp phụ có tính trao đổi ion. Trong trường hợp chất phân tích phân cực mà không có tính ion thì tốt nhất nên sử dụng chất hấp phụ theo nguyên tắc pha đảo. Ofloxacin có tính phân cực, có tính axit yếu với cá giá trị pKa1 = 5,8; pKa2= 8,0 [31]; mẫu nước tiểu có pH khoảng 5 đến 6, vì
vậy chúng tôi lựa chọn pH của dung môi trong khoảng 4 đến 5, ở điều kiện này ofloxacin tồn tại ở dạng phân tử không phân ly, quá trình chiết sẽ theo nguyên tắc pha đảo.
Các hệ dung môi được pha chế từ metanol; acetonnitrin; dung dịch đệm photphat pH 4,0 và 5,0; đệm axetat pH 4,0 theo tỉ lệ thể tích. Thành phần của các hệ dung môi khảo sát được thể hiện trong bảng 3.11.
Để đánh giá hiệu quả chiết của các hệ dung môi chúng tôi tiến hành như sau:
Bước 1: Lấy mẫu nước tiểu người không uống thuốc. Thêm ofloxacin vào mẫu với nồng độ 0,5mg/ml. Lấy 2,5ml nước tiểu đã thêm thuốc cho chảy qua cột HLB. Rửa tạp chất bằng đệm photphat. Rửa giải thu hồi mẫu bằng dung môi khảo sát. Chuyển toàn bộ dịch chiết vào bình định mức 25ml, định mức bằng nước cất đến vạch (dung dịch A). Dùng pipet lấy chính xác 2,5ml dung dịch A chuyển vào bình định mức 25ml, thêm 8ml đệm photphat pH = 6,5, định mức đến vạch rồi chuyển vào bình điện phân và tiến hành đo theo điều kiện xác định ofloxacin đã chọn.
Bước 2: Tiến hành giống như bước 1 nhưng thuốc ofloxacin được thêm vào dịch chiết thu hồi được sau khi qua cột với một lượng tương đương.
Hiệu quả tách của dung môi được đánh giá thông qua hiệu suất chiết, tính theo công thức: t c I H (%) I
trong đó: It: cường độ dòng pic của mẫu giả xử lý theo qui trình (bước 1) Ic: cường độ dòng pic của mẫu chuẩn thêm vào dịch chiết mẫu trắng (bước 2).
Bảng 3.11: Hiệu suất chiết của các hệ dung môi
TT Hệ dung môi (tỉ lệ thể tích) Hiệu suất chiết
1 Acetonnitrin: đệm photphat pH 5,0 (96:4) 66,8
2 Metanol: đệm axetat pH 4,0 (90:10) 77,5
3 Metanol: đệm photphat pH 4,0 (90:10) 79,7
4 Metanol: nước (80:20) 81,3
5 Acetonnitrin: metanol: đệm photphat pH 4,0 (5:85:10) 86,6 6 Acetonnitrin: metanol: nước (10:80:10) 75,3
(ĐKTN: Thể tích dung môi = 3ml, tốc độ chảy 0,5 ml/phút)
Với hỗn hợp dung môi Acetonnitrin: metanol: đệm photphat pH 4,0 (5:85:10) cho hiệu suất chiết cao, pic gọn không có tín hiệu nhiễu. Vậy, chọn thành phần dung môi chiết là hỗn hợp Acetonnitrin: metanol: đệm photphat (5:85:10)
Sự ảnh hưởng của dung môi đến cường độ dòng pic
Dung môi chiết tốt phải không ảnh hưởng đến pic của chất phân tích, chúng tôi khảo sát sự ảnh hưởng của dung môi đến cường độ dòng pic của chất ofloxacin. Lấy 0,30 ml dung dịch ofloxacin 0,025mg/ml, thêm 8ml đệm photphat, Vml hỗn hợp dung môi, định mức thành 25ml được dung dịch ofloxacin 3,0 µg/ml. Tiến hành ghi đo đường DP trong các điều kiện như trong bảng 3.4. Kết quả thể hiện trong bảng 3.12 và biểu diễn trong hình 3.16.
Kết quả khảo sát cho thấy, với thể tích dung môi trong khoảng 1ml đến 4,0ml không có sự ảnh hưởng đáng kể đến cường độ dòng pic và thế đỉnh pic, khi thể tích dung môi lớn hơn 4,0ml có sự giảm cường độ dòng pic, chân pic lệch, vì vậy không nên dùng thể tích dung môi lớn hơn 4,0 ml. Như vậy hỗn hợp dung môi Acetonnitrin: metanol: đệm photphat (5:85:10) phù hợp dùng để tách chiết, phân tích các kháng sinh ofloxacin trong nước tiểu theo phương pháp von-ampe xung vi phân.
Bảng 3.12: Sự phụ thuộc Ip
vào thể tích dung môi V dung môi (ml) Ip 1,0 76,6 1,5 76,6 2,0 76,5 2,5 76,5 3,0 76,3 3 5 75, 4,0 74,6 5,0 69,8 6,0 66,5 50 55 60 65 70 75 80 0 2 4 6 8 V dung môi (ml) Ip (nA)
Hình 3.16: Sự phụ thuộc Ip thể tích dung môi Khảo sát pH chiết
Tiến hành khảo sát hiệu suất chiết của hệ dung môi acetonnitrin: metanol: đệm photphat (5:85:10) trong khoảng 2 đến 9, điều chỉnh pH bằng dung dịch NaOH 0,1M và H3PO4 0,1M. Kết quả trình bày trong bảng 3.13 và hình 3.17.
Bảng 3.13: Sự phụ thuộc hiệu suất chiết vào thể tích dung môi
pH Hiệu suất chi t 2 78,6 3 86,5 4 86,6 5 85,2 6 82,1 7 68,1 9 56,6 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 0 2 4 6 8 10 pH H (%)
Hình 3.17: Sự phụ thuộc hiệu suất chiết vào pH của dung môi
Ofloxacin có pKa1 = 5,8; pKa2= 8,0 [31], pH của nước tiểu khoảng 5,5, trong môi trường pH < pKa1 ofloxacin tồn tại dạng phân tử không phân ly, không có tính ion, mặt khác phân tử ofloxacin khá phân cực do đó lựa chọn thực hiện chiết theo cơ chế pha đảo là hoàn toàn phù hợp. Kết quả thí nghiệm cho thấy với pH dung môi chiết từ 3 đến 4 cho hiệu suất chiết tốt là phù hợp về khoa học. Vì vậy, chúng tôi chọn điều kiện pha hệ dung môi chiết pH = 4. Khảo sát tốc độ nạp mẫu và rửa giải
Tốc độ nạp mẫu ảnh hưởng đến sự hấp thu của chất phân tích vào pha tĩnh. Tốc độ nạp mẫu chậm thì chất hấp thu nhiều, nạp mẫu quá nhanh chất phân tích không đủ thời gian hấp thu trên cột dẫn tới hiệu suất chiết thấp. Ngoài ra cần căn cứ vào thể tích và nồng độ chất phân tích trong mẫu nạp vào cột để lựa chọn tốc độ nạp mẫu phù hợp. Theo tài liệu tham khảo [1] đối với phương pháp HPLC, cột C18 tốc độ bơm mẫu là 1,5ml/phút. Với các mẫu nước tiểu chứa ofloxacin nồng độ không quá nhỏ, thể tích mẫu nhỏ (khoảng 2,0ml), chúng tôi tiến hành khảo sát tốc độ nạp mẫu với cột chiết pha rắn HLB từ 0,5 đến 3,0ml/phút. Kết quả trình bày trong bảng 3.14 và hình 3.18.
Bảng 3.14: Sự phụ thuộc hiệu suất chiết vào tốc độ nạp mẫu
Tốc độ nạp mẫu (ml/phút) Hiệu suất chiết 0,5 86,6 1,0 86,5 1,5 85,3 2,0 81,2 2,5 76,4 3,0 65,7 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 0 1 2 3 tốc độ nạp mẫu (ml/phút) Hi ệ u suất chiết (%)
Hình 3.18: Sự phụ thuộc hiệu suất chiết vào tốc độ nạp mẫu
Kết quả phân tích cho thấy với tốc độ nạp mẫu từ 0,5 đến 1,5 ml/phút hiệu suất chiết cao (trên 85%). Khi tốc độ nạp mẫu tăng lên đến 3,0 ml/phút hiệu suất chiết chỉ còn 65,7%. Chúng tôi chọn điều kiện nạp mẫu vào cột với tốc độ 1,0 ml/phút (thực tế trong khoảng 0,8 – 1,0 ml/phút).
Tốc độ rửa giải ảnh hưởng đến hiệu suất chiết, tốc độ rửa giải nhanh thì không giải chiết hết, rửa giải chậm gây tốn thời gian phân tích. Trong điều kiện nghiên cứu, thể tích dung môi rửa giải không lớn (do có sự ảnh hưởng của dung môi khi đo mẫu) cần rửa giải với tốc độ chậm để giải chiết hết mà không bị ảnh hưởng bởi dung môi khi đo mẫu. Tiến hành khảo sát sự phụ thuộc hiệu suất chiết vào tốc độ rửa giải với 3,0ml hỗn hợp dung môi với tốc độ từ 0,5 đến 3,0ml/phút. Kết quả cho thấy với tốc độ rửa giải từ 0,5 đến 2,0 ml/phút cho hiệu suất chiết tốt (85,5%), vì vậy chúng tôi chọn điều kiện tốc độ rửa giải 1,0ml/phút (tương đương tốc độ nạp mẫu).
Khảo sát thể tích dung môi rửa giải
Nghiên cứu thể tích dung môi rửa giải thích hợp là rất cần thiết, nếu thể tích dung môi nhỏ sẽ giảm hiệu suất chiết, thể tích dung môi quá lớn gây lãng phí và có thể ảnh hưởng đến tín hiệu đo. Chúng tôi tiến hành khảo sát sự phụ thuộc hiệu suất chiết vào thể tích dung môi là hỗn hợp acetonnitrin: metanol: đệm photphat pH 4,0 (5:85:10). Kết quả trình bày trên bảng 3.15 và hình 3.19.
Bảng 3.15: Sự phụ thuộc hiệu suất chiết vào thể tích
dung môi V dung môi (ml) Hiệu suất chiết 1,0 76,2 1,5 81,9 2,0 86,4 2,5 86,4 3,0 86,5 3,5 86,3 4,0 84,5 60 65 70 75 80 85 90 0 1 2 3 4 5 V dung môi (ml) H(%)
Hình 3.19: Sự phụ thuộc hiệu suất chiết vào thể tích dung môi
Kết quả phân tích cho thấy, hiệu suất chiết tăng khá nhanh khi tăng thể tích dung môi từ 1,0 ml đến 2,0 ml, với thể tích dung môi từ 2,5 ml đến 3,5 ml hiệu suất chiết hầu như không tăng thêm. Vì vậy chúng tôi chọn thể tích dung môi chiết là 2,5ml đảm bảo hiệu suất chiết tốt và ổn định.
Kết luận về điều kiện chiết ofloxacin trong mẫu nước tiểu và xây dựng qui trình xử lý mẫu nước tiểu bằng phương pháp chiết pha rắn:
Sau khi tiến hành khảo sát một số điều kiện thích hợp cho quá trình xử lý mẫu bằng phương pháp chiết pha rắn sử dụng cột chiết HLB Oasis, rút ra kết luận về một số điều kiện chiết như sau:
Dung môi: acetonnitrin: metanol: đệm photphat (5:85:10) Thể tích dung môi: 2,5ml
pH 4,0
Tốc độ chảy 1,0 ml/phút
Từ các kết luận trên, chúng tôi xây dựng qui trình xử lý mẫu nước tiểu bằng phương pháp chiết pha rắn (SPE) như sau:
Qui trình: Hoạt hóa cột chiết bằng 2ml CH3OH, rửa cột bằng 5ml nước cất 2 lần. Lấy chính xác 2,50 ml nước tiểu cho đi qua cột chiết HLB với tốc độ chảy 1,0 ml/phút, rửa tạp bằng 5ml đệm photphat pH 4,0, rửa giải thu hồi ofloxacin bằng 2,5 ml hỗn hợp acetonnitrin-metanol- đệm photphat pH 4,0 (5:85:10). Lấy phần dịch chiết. Chuyển toàn bộ dịch chiết vào bình định mức 25 ml, định mức bằng nước cất đến vạch (dung dịch A). Dung dịch này có thể dùng để định lượng ofloxacin bằng qui trình đã xây dựng ở mục 3.1.3.
Hình 3.20 cho thấy đường DP của ofloxacin trong mẫu nước tiểu sau xử lý theo qui trình đã xây dựng được ở trên đẹp và cân đối hơn rất nhiều so với trước khi xử lý. Điều này cho thấy: có thể áp dụng qui trình xử lý mẫu đã xây dựng được bằng phương pháp chiết pha rắn để phân tích hàm lượng ofloxacin trong nước tiểu bệnh nhân.
-1.10 -1.20 -1.30 -1.40 U (V) -150n -100n -50.0n 0 I (A )
Hình 3.20: Đường DP của dung dịch ofloxacin 4 µg/ml trong: 1) Nước tiểu trước khi xử lý; 2) Nước tiểu sau khi xử lý qua cột HLB Đánh giá phương pháp
Để đánh giá độ tin cậy của phương pháp chúng tôi tiến hành phân tích ofloxacin trong mẫu tự tạo. Mẫu tự tạo là mẫu nước tiểu của người bình thường được thêm ofloxacin ở các nồng độ khác nhau, đem xử lý và định lượng theo qui trình:
2 1
Hoạt hóa cột chiết bằng 2ml CH3OH, rửa cột bằng 5ml nước cất 2 lần. Lấy chính xác 2,50 ml nước tiểu cho đi qua cột chiết HLB với tốc độ chảy 1,0 ml/phút, rửa tạp bằng 5ml đệm photphat pH 4,0, rửa giải thu hồi ofloxacin bằng 2,5 ml hỗn hợp acetonnitrin-metanol- đệm photphat pH 4,0 (5:85:10). Lấy phần dịch chiết. Chuyển toàn bộ dịch chiết vào bình định mức 25 ml, định mức bằng nước cất đến vạch (dung dịch A). Dùng pipet lấy chính xác 2,50 ml dung dịch A chuyển vào bình định mức 25,00 ml, thêm 8 ml đệm photphat pH = 6,50, định mức đến vạch rồi chuyển vào bình điện phân và tiến hành đo theo điều kiện đã chọn.
Kết quả được trình bày trong bảng 3.16, hình 3.21 và hình 3.22. Bảng 3.16: Sự phụ thuộc nồng độ ofloxacin trong mẫu nước tiểu vào Ip.
TT CNT (mg/ml) Cđo (µg/ml) Ip (nA) 1 0,2 2,0 -51,5 2 0,3 3,0 -76,0 3 0,4 4,0 -95,4 4 0,5 5,0 -117 5 0,6 6,0 -145 6 0,7 7,0 -164 7 0,8 8,0 -187
Kết quả phân tích cho thấy có sự phụ thuộc tuyến tính giữa Ip vào nồng độ ofloxacin.
y = 22.575x + 6.5393 R² = 0.9986 0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 0 2 4 6 8 10 Ip (nA) C (m icrogam /ml)
Đường chuẩn ofloxacin trong NT
Hình 3.21: Sự phụ thuộc Ip và nồng độ
ofloxacin trong mẫu nước tiểu.
-1.10 -1.20 -1.30 -1.40 U (V) -200n -150n -100n -50.0n 0 I (A ) Hình 3.22: Đường AdSV của ofloxacin trong nước
tiểu (mẫu tự tạo)
Đánh giá độ đúng của phương pháp thông qua độ thu hồi. Tiến hành phân tích xác định độ thu hồi ofloxacin trong mẫu nước tiểu tự tạo có sẵn nồng độ ofloxacin bằng 0,3 mg/ml bằng phương pháp thêm chuẩn. Ofloxacin được thêm vào mẫu nước tiểu ở các nồng độ 0,24 mg/ml; 0,3 mg/ml; 0,36 mg/ml (tương ứng tỉ lệ thêm vào là 80%, 100% và 120%) rồi xử lý theo qui trình trên và tiến hành định lượng. Nồng độ ofloxacin trong mẫu nước tiểu được tính theo công thức: CNT = 0,10.CX (mg/ml), (trong đó: CNT là nồng độ ofloxacin trong mẫu nước tiểu tự tạo; CX là nồng độ ofloxacin trong mẫu đo sau khi xử lý (µg/ml). Kết quả được trình bày trong bảng 3.17.
Bảng 3.17: Kết quả xác định ofloxacin trong mẫu nước tiểu tự tạo
STT