Nhóm các phương pháp phân tích cực phổ và von-ampe là những phương pháp quan trọng nhất trong số các phương pháp phân tích điện hóa. Các phương pháp này đều dựa trên lý thuyết về quá trình điện cực, khảo sát sự phụ thuộc của cường độ dòng điện vào điện thế đặt lên điện cực làm việc trong quá trình điện phân dung dịch phân tích. Phương pháp cực phổ (Polarography) được nhà Hóa học người Sec Jaroslav Hevrovský phát minh ra năm 1922. Với phát minh này năm 1959 ông đã được tặng giải thưởng Nobel về hóa học. Hạn chế của phương pháp cực phổ (cổ điển) chính là sự xuất hiện dòng tụ điện sinh ra trên điện cực giọt thủy ngân, dòng này có cường độ tương ứng dòng điện gây ra bởi chất điện hoạt với nồng độ khoảng 10-5M nên giới hạn định lượng của cực phổ cổ điển là 10-5M. Hevrovský, Ilkovic và các nhà Điện hóa đã phát minh ra các phương pháp cực phổ hiện đại như: cực phổ sóng vuông; cực phổ xung. Các phương pháp này đã đạt giới hạn định lượng cỡ 10-7 – n.10-8M [9, 10, 13]. Đối với các hợp chất hữu cơ, thường có đặc tính điện hóa bất thuận nghịch. Trên thế giới và Việt Nam đã có một số nghiên cứu về định lượng các hợp chất hữu cơ bằng phương pháp điện hóa và có nhiều thành công [68, 71, 75, 84].
Vì vậy, trong luận án chúng tôi chọn phương pháp cực phổ xung vi phân và von-ampe hòa tan hấp phụ để tiến hành định lượng các dược phẩm. 1.3.1. Cực phổ xung vi phân (Diffrerential Pulse Polarography – DPP)
Trong phương pháp xung vi phân, điện cực được phân cực bằng điện áp một chiều biến thiên tuyến tính với tốc độ chậm. Ở cuối mỗi chu kỳ giọt, trên khung điện áp biến đổi người ta đặt thêm một xung vuông góc với biên độ thay đổi từ 10 – 100mV, độ dài xung từ 40 – 100ms. Ghi dòng tại hai thời điểm, thường là 17ms trước khi nạp xung và 17ms trước khi ngắt xung, tại thời điểm này được xem là dòng tụ điện nhỏ nhất, hai giá trị này được gửi vào bộ so sánh và kết quả ra bộ ghi là hiệu số của hai giá trị đó. Dạng đường cực phổ có dạng một cực đại. Phương pháp DPP có độ nhạy khoảng 10-7 – 10-8M.
Sự phụ thuộc dòng cực đại trong cực phổ xung vi phân vào các thông số của quá trình đo cực phổ được tính toán lý thuyết cho hệ thức sau:
I = K.C (1.1) Trong đó:
Với: n : số e trao đổi trong phản ứng điện cực F : hằng số Faraday
S : là diện tích bề mặt điện cực D : hệ số khuếch tán
tx : thời gian một xung
(1.2) (1.3) DE : biên độ xung
1.3.2. Phương pháp Von-ampe hòa tan hấp phụ (AdSV)
1.3.2.1. Nguyên tắc
Nguyên tắc phương pháp Von-ampe hòa tan hấp phụ giống như phương pháp von-ampe hòa tan. Quá trình phân tích theo phương pháp von-ampe hòa tan hấp phụ cũng gồm ba giai đoạn: Giai đoạn làm giàu, giai đoạn dừng và giai đoạn hòa tan. Điểm khác biệt căn bản của phương pháp von am-pe hòa tan hấp phụ với phương pháp von-ampe hòa tan là quá trình làm giàu. Chất phân tích được hấp phụ lên bề mặt điện cực làm việc (WE) và được làm giàu. Trong giai đoạn này, thế trên WE được giữ không đổi và dung dịch phân tích được khuấy trộn đều. Kết thúc giai đoạn này, ngừng khuấy để dung dịch yên tĩnh trong khoảng 15 – 30 s. Trong giai đoạn hòa tan, tiến hành quét thế catot để khử các tiểu phân điện hoạt trên bề mặt WE và đồng thời ghi tín hiệu hòa tan Iht (dòng hòa tan) và Eht (thế hòa tan). Trong đó, Iht = f(E), E là thế trên WE. Khi ghi tín hiệu hòa tan có thể sử dụng một kỹ thuật von – ampe hòa tan nào đó, chẳng hạn von – ampe xung vi phân, von – ampe sóng vuông,...
Thông thường AdSV có thể thực hiện được trên hết các loại điện cực: HMDE, SMDE, Pt, than nhão (CPE), than thủy tinh (GC), điện cực graphit ngâm tẩm, các điện cực có biến tính hóa học. Tuy nhiên hầu hết các nghiên cứu sử dụng điện cực HMDE vì điện cực này có nhiều ưu điểm: bề mặt dễ làm sạch, độ lặp lại cao, dễ tự động hóa [7, 9, 10].
1.3.2.2. Giai đoạn làm giàu
Chất phân tích được tích lũy bằng cách hấp phụ lên ranh giới tiếp xúc dung dịch – điện cực làm việc. Có ba kiểu hấp phụ đặc trưng đó là hấp phụ theo kiểu điện hóa, hấp phụ do ái lực hóa học và hấp phụ đẳng nhiệt.
Một số hợp chất hữu cơ có nhóm chức có khả năng hấp phụ lên bề mặt điện cực tại thế xác định (hấp phụ do ái lực hóa học). Đây là một trong những đối tượng nghiên cứu mới của phương pháp von-ampe hòa tan hấp phụ được áp dụng để phân tích các chất hữu cơ có hoạt tính sinh học trong dược phẩm.
1.3.2.3. Giai đoạn dừng
Sau giai đoạn làm giàu ngừng khuấy để dung dịch yên tĩnh trong khoảng 10 – 30 s để chất phân tích phân bố đều trên bề mặt điện cực và chuyển dung dịch từ trạng thái động sang trạng thái tĩnh cho kết quả ghi dòng ổn định hơn.
1.3.2.4. Giai đoạn hòa tan
Giai đoạn này hoàn toàn giống với giai đoạn hòa tan trong phương pháp von-ampe hòa tan thông thường, tức là quét thế tuyến tính theo thời gian theo chiều catot, tức là quét thế âm dần để khử chất hấp phụ trên bề mặt điện cực làm việc và đồng thời ghi tín hiệu hòa tan bằng kỹ thuật von-ampe hòa tan, khi đó phương pháp sẽ được gọi là von-ampe hòa tan catot.
Ngược lại, nếu quét thế theo chiều anot, tức là theo chiều thế dương dần để oxi hóa chất hấp phụ trên bề mặt điện cực làm việc và ghi tín hiệu hòa tan bằng kỹ thuật von-ampe. Khi đó phương pháp sẽ được gọi là von-ampe hòa tan anot.
Trong phương pháp AdSV, tín hiệu thu được có dạng pic. Tín hiệu von-ampe hòa tan tỉ lệ thuận với nồng độ của chất hấp phụ trên bề mặt điện cực làm việc theo phương trình:
Q = n.F.S.C0
Trong đó, Q (C) là điện lượng cần thiết để khử chất điện hoạt đã được hấp phụ, n là số electron trao đổi trong phản ứng điện cực tổng cộng, F là hằng số Faraday, S (cm2) là diện tích bề mặt điện cực, C0
(mol/cm2) là nồng độ của chất hấp phụ trên bề mặt điện cực [9].
Với tốc độ quét thế xác định, dòng pic hoà tan (Ip) tỉ lệ thuận với Q, với S và C0. Khi các điều kiện hấp phụ được lặp lại, C0 tỉ lệ thuận với nồng độ chất phân tích trong dung dịch (C), nên Ip tỉ lệ thuận với S và C. Vì vậy, với một chất nghiên cứu, một loại điện cực, diện tích điện cực, đặc tính bề mặt điện cực lặp lại thì cường độ dòng Ip = K.C, trong đó K là hệ số thực nghiệm,
phụ thuộc vào các điều kiện thực nghiệm: điều kiện tích lũy, điều kiện hòa tan và bản chất của dung dịch chất nghiên cứu.
Thế đỉnh pic hòa tan (Ep) và cường độ dòng đỉnh hòa tan (Ip) phụ thuộc vào các yếu tố như: thành phần nền, pH, thế tích lũy, thời gian tích lũy, bản chất của điện cực làm việc, kỹ thuật ghi dòng hòa tan. Trong các điều kiện xác định Ep đặc trưng cho bản chất điện hóa của chất phân tích nên dùng trong phân tích định tính, Ip tỉ lệ thuận với nồng độ của chất phân tích nên dùng trong phân tích định lượng.
Ngoài những ưu điểm giống như phương pháp ASV, phương pháp AdSV còn có những ưu điểm sau:
- Cho phép xác định đồng thời nhiều ion kim loại ở những nồng độ vết hoặc siêu vết. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
- Đạt được độ chọn lọc cao vì có thể lựa chọn phối tử tạo phức bền và chọn lọc với ion kim loại cần phân tích. Phương pháp AdSV đạt được giới hạn phát hiện rất nhỏ, khoảng 10–9 10–11M, hoặc 10-12 M.
- Phương pháp AdSV có qui trình phân tích đơn giản: không có giai đoạn chiết, tách hoặc trao đổi ion và do đó, tránh được sự nhiễm bẩn mẫu hoặc mất chất phân tích, giảm thiểu được sai số. Mặt khác, có thể loại trừ được ảnh hưởng của các yếu tố cản trở bằng cách chọn các điều kiện thí nghiệm thích hợp như: thành phần nền, pH, thế điện phân làm giàu, ảnh hưởng của các chất khác...
- Xác định được gần 60 ion kim loại và hơn 200 hợp chất hữu cơ.
- Phương pháp AdSV đặc biệt có ưu điểm trong phân tích các chất hữu cơ, dược phẩm bao gồm những chất có hoạt tính điện hóa, có khả năng hấp phụ trên bề mặt điện cực giọt thủy ngân và các chất không có hoạt tính điện hóa trực tiếp trên điện cực giọt cũng có thể xác định bằng cách gắn với các nhóm như nitro, nitroso… hoặc thủy phân tạo thành chất mới có hoạt tính điện hóa.
- Dựa vào các đặc tính hấp phụ ta có thể giải quyết được các bài toán liên quan đến quá trình điện cực, cơ chế của phản ứng xảy ra trên điện cực.
1.4. XỬ LÝ MẪU
1.4.1. Mẫu thuốc
Các mẫu thuốc chuẩn và các chế phẩm thuốc được rung siêu âm hòa tan trong nước cất với các nồng độ thích hợp để khảo sát các điều kiện và định lượng.
1.4.2. Mẫu nước tiểu
Mẫu nước tiểu có thành phần phức tạp, gồm 95 - 96% là nước và một ít chất khô. Trong nước tiểu có chứa nhiều chất hóa học như urê, axit uric, creatinin, natri, kali, lưu huỳnh, photphat, sulfat, NaCl, Flo, Chì, và một số hoocmon…., khá nhiều thuốc sau khi đi vào cơ thể được thanh thải dưới dạng không chuyển hóa hoặc dạng chuyển hóa qua cầu thận vào nước tiểu. Người bình thường không mắc chứng suy thận, một ngày đêm thải ra khoảng 1 – 1,5 lít nước tiểu. Các chất trong nước tiểu có thể gây kìm hãm phản ứng điện cực, vì vậy cần phải tách, xử lý mẫu trước khi phân tích.
Trong phân tích các mẫu sinh học thông thường có 3 phương pháp xử lý mẫu là phương pháp tạo kết tủa, phương pháp chiết lỏng – lỏng và phương pháp chiết lỏng – rắn (chiết pha rắn) [19, 52].
* Chiết pha rắn (solid phase extraction - SPE)
Chiết pha rắn (SPE) là một phương pháp chuẩn bị mẫu để làm giàu và làm sạch chất phân tích từ dung dịch bằng cách hấp phụ lên một cột chiết pha rắn, sau đó chất phân tích được rửa giải (giải hấp) bằng một dung môi thích hợp. Ưu điểm của phương pháp SPE là hiệu suất thu hồi cao, khả năng làm sạch chất phân tích lớn, dễ tự động hóa, lượng dung môi sử dụng ít. [19].
Hình 1.5: Các bước trong kỹ thuật chiết pha rắn
Hiện nay, kỹ thuật chiết pha rắn (SPE) được sử dụng khá nhiều để tách và làm giàu chất phân tích. Chiết pha rắn phù hợp để xử lý các mẫu môi trường, mẫu thuốc, mẫu lâm sàng [14, 80]. Vật liệu hấp thu trong chiết pha rắn hiện nay được cải thiện rất nhiều trong cột chiết Oasis HLB. Vật liệu hấp thu được trùng hợp từ hai monome có tỷ lệ bằng nhau là N-vinylpyrolidon có tính ưa nước và divinylbenzen có tính kỵ nước.
Hình 1.6: Vật liệu hấp phụ trong pha tĩnh cột HLB Mẫu phân tích Bơm mẫu qua cột Rửa các chất ảnh hưởng Rửa giải chất phân tích Các chất ảnh hưởng R Hoạt hóa cột
Chất hấp phụ Oasis có cấu trúc không gian lớn (thể tích lỗ rỗng là 1,3cm2/g), có diện tích bề mặt trên một đơn vị khối lượng pha tĩnh cao (810m2/g). Các nhóm chức phân cực của monome N-vinylpyrolidon đã tạo ra các hốc phân cực nên pha tĩnh Oasis có hệ số lưu giữ đối với các chất phân tích phân cực cao hơn 3 lần so với cột C18 truyền thống đồng thời có khả năng làm việc trong khoảng pH rộng.
Hình 1.7. So sánh khả năng lưu giữ giữa cột C18 và cột Oasis® HLB Qua tham khảo các tài liệu, hiện nay chưa có tài liệu nào công bố qui trình xử lý mẫu nước tiểu để xác định cefadroxil, và ofloxacin theo phương pháp von-ampe xung vi phân và von –ampe hòa tan hấp phụ. Theo Dược điển Việt Nam, cefadroxil được định lượng bằng phương pháp HPLC, cột C-18, thành phần pha động là hỗn hợp acetonitril: đệm photphat pH 5,0 (4 : 96). Ofloxacin được xác định bằng phương pháp HPLC với cột C-18, thành phần pha động là dung dịch natri lauryl sulfat 0,24%, - acetonitril - acid acetic băng (580 : 400 : 20) [1]. Đây là các căn cứ quan trọng để khảo sát các điều kiện xử lý mẫu theo phương pháp chiết pha rắn với cột chiết HLB.
CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. THIẾT BỊ DỤNG CỤ VÀ HÓA CHẤT
2.1.1. Thiết bị, dụng cụ
1. Máy cực phổ đa năng:
Các phép đo đều được làm việc trên máy cực phổ đa năng 757 và 797VA Computrace do hãng Metrohm (Thụy Sĩ) sản xuất gồm:
- Các điện cực:
+ Điện cực làm việc (WE): Điện cực giọt thuỷ ngân treo (HMDE) + Điện cực so sánh (RE): Ag|AgCl||Cl-; điện cực luôn được bảo quản trong dung dịch KCl bão hòa.
+ Điện cực phù trợ (AE): Điện cực Pt
- Bình điện phân: Bình điện phân có dung tích 50ml, được chế tạo từ thuỷ tinh thạch anh. Nắp bình có cấu tạo thích hợp để dẫn khí trơ (N2) đuổi oxi hoà tan trong dung dịch đo và có một môtơ nhỏ gắn với que khuấy để khuấy trộn đều dung dịch đo.
2. Máy đo pH – Meter HM 16S của Nhật Bản
3. Cân phân tích Scientech SA 210 – Mỹ, độ chính xác ± 0,0001 gam 4. Máy cất nước hai lần WSC/4D của hãng Haminton – Anh
5. Bể điều nhiệt Memmert của Đức
6. Các dụng cụ thủy tinh: Các loại pipet, micropipet, bình định mức, cốc đong, ống đong... đều của Đức sản xuất. (Các dụng cụ đều được rửa sạch bằng dung dịch HNO3 và hỗn hợp rửa K2Cr2O7 và H2SO4 đặc sau đó tráng lại nhiều lần bằng nước cất hai lần). (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
7. Các micropipet cho phép lấy dung dịch từ 10µl đến 5000µl.
8. Thiết bị chiết pha rắn và cột chiết pha rắn Oasis HLB Extraction Cartridge do hãng Water – Mỹ sản xuất, với các thông số:
Diện tích bề mặt 804 (m2/g) Đường kính mao quản trung bình 83 (Å) Tổng dung lượng mao quản 1,31 (cm3/g) Kích thước hạt trung bình 29,3 µm
Dung tích cột 6ml
Khối lượng chất nhồi cột 200mg 2.1.2. Hóa chất
- Nước cất được sử dụng là nước cất hai lần trên máy Halminton
- Tất cả các hoá chất sử dụng trong nghiên cứu đều đạt độ tinh khiết phân tích (PA)
- Các chất chuẩn metronidazol; cefadroxil; ofloxacin; clorpheniramin maleat là chất chuẩn tinh khiết do Viện kiểm nghiệm - Bộ Y tế cung cấp.
Dung dịch gốc chuẩn ofloxacin: Cân chính xác 50,0mg chất chuẩn
ofloxacin, hòa tan bằng nước cất, định mức đến 100ml, siêu âm 15 phút.
Dung dịch gốc chuẩn clopheniramin maleat: Cân chính xác 50,0mg
chất chuẩn clopheniramin maleat, hòa tan bằng nước cất rồi đến 1000ml, siêu âm 15 phút.
Dung dịch gốc chuẩn cefadroxil: Cân chính xác 50,0mg chất chuẩn
cefadroxil, hòa tan bằng nước cất rồi định mức bằng nước cất đến 1000ml, siêu âm 15 phút.
- Các dung dịch phân tích được pha hàng ngày từ dung dịch chuẩn gốc. - Các dung dịch đệm pha theo Dược điển Việt Nam 4 [1]:
Dung dịch đệm Britton-Robinson (BR) pH từ 2 đến 12 [1]
- Pha dung dịch H3PO4 0,1M: Lấy 2,8 ml H3PO4 đậm đặc pha loãng và định mức bằng nước cất đến 500ml.
- Pha dung dịch CH3COOH 0,1M: Lấy 3,0 ml CH3COOH băng pha loãng và định mức bằng nước cất đến 500ml.
- Pha H3BO3 0,1M: Lấy 3,1 gam H3BO3 khan hòa tan và định mức bằng nước cất đến 500ml.
- Trộn H3PO4 0,1M, CH3COOH 0,1M, H3BO3 0,1M (1:1:1) được hỗn hợp đệm Britton-Robinson (BR). Dùng CH3COOH đặc và NaOH 50% để điều chỉnh pH. Kiểm tra bằng máy đo pH.
Dung dịch đệm photphat:[1]
- Pha dung dịch kalidihidrophotphat 0,1M: Cân 13,61 gam KH2PO4 hòa tan rồi định mức bằng nước cất đến 1000ml.
- Pha dung dịch NaOH 0,1M: Cân 4,00 gam NaOH khan hòa tan, pha loãng bằng nước cất thành 1000ml.
Các đệm photphat chuẩn pH từ 5,8 đến 8,0 được pha bằng cách trộn 50
ml dung dịch kali dihydrophosphat 0,1 M với lượng dung dịch natri hydroxyd
0,1 M như chỉ dẫn trong bảng 2.1 [1] và thêm nước vừa đủ 100 ml.
Bảng 2.1: Pha dung dịch đệm photphat theo Dược điển Việt Nam