Kỹ thuật chiết pha rắn (SPE) thường được sử dụng cho chất phân tích trong các đối tượng mẫu sinh học [75]. Cột chiết pha rắn HLB với pha tĩnh kết hợp giữa cơ chế chiết pha đảo và tương tác ưa nước (hydrophilic- lypophilic water-wettable revered phase) đã được áp dụng rất hiệu quả trong phân tích các đối tượng mẫu sinh học nói chung và mẫu nước tiểu nói riêng.
Cột chiết được sử dụng trong luận án là cột chiết HLB Oasis loại 6ml, chứa 200mg chất hấp thu là sản phẩm trùng hợp từ hai monome có tỷ lệ bằng nhau là N-vinylpyrolidon và divinylbenzen. Trước khi tiến hành chiết hoạt hóa cột bằng 4 ml metanol khoảng 30 phút sau đó rửa cột bằng nước cất hai lần. 2.3.5. Phương pháp định lượng các hoạt chất trong thuốc
Sử dụng phương pháp thêm chuẩn. Sử dụng phần mềm Excel và Origin 8.0 để vẽ đồ thị, thiết lập phương trình đường thêm chuẩn theo phương pháp
hồi qui tuyến tính dạng y = a + bx.
Từ đó tính Cx theo công thức: Cx =
b a
Với: Cx - nồng độ hoạt chất có trong dung dịch đo a, b - hệ số phương trình hồi quy.
Tính khối lượng hoạt chất có trong a (mg) mẫu cân ban đầu: m = V Cx F 10-3 (mg)
Trong đó:
m - khối lượng chất phân tích có trong g (mg) mẫu V - thể tích dung dịch được pha từ g (mg)
F - hệ số pha loãng
Cx - nồng độ của hoạt chất xác định từ phương trình hồi quy Sự khai khác về hàm lượng so với kết quả ghi trên nhãn:
C% = 100 m m m n n i
Trong đó: mi là khối lượng xác định theo phương pháp phân tích mn là khối lượng thuốc ghi trên nhãn thuốc
2.3.6. Các bước khảo sát
2.3.6.1. Khảo sát thành phần và pH dung dịch nền
Khảo sát thành phần và pH của dung dịch nền rất quan trọng quyết định đến kết quả phân tích. Trong dung dịch điện phân để giảm sự điện di và sự ảnh hưởng của dòng tụ điện người ta cần cho thêm lượng dư chất điện li trơ vào dung dịch. Chất điện li thường dùng là: KCl; KNO3; NH4Cl; NaOH; HCl. pH của dung dịch cũng ảnh hưởng đến thế đỉnh và cường độ dòng khuếch tán giới hạn. Khi thay đổi pH của dung dịch đo, thế đỉnh pic có thể dịch chuyển về phía âm hơn hoặc dương hơn tùy vào phản ứng điện cực. Trong luận án chúng tôi đã lựa chọn khảo sát các dung dịch nền NaOH; đệm photphat; đệm axetat; đệm Britton-Robinson ở các pH từ 2 đến 13 cho các thuốc.
Lấy chính xác một thể tích thuốc chuẩn có nồng độ nhất định cho vào bình định mức 25 ml, thêm nước cất đến thể tích khoảng 5ml, thêm 8 – 10 ml dung dịch đệm, định mức đến vạch. Chuyển toàn bộ dung dịch vào bình điện phân. Tiến hành ghi đo dòng khuếch tán bằng phương pháp von-ampe xung vi phân và von-ampe xung vi phân hòa tan hấp phụ.
2.3.6.2. Khảo sát điều kiện thủy phân cefadroxil
* Khảo sát nồng độ NaOH: Lấy 0,25ml dung dịch cefadroxil có nồng độ 0,05mg/ml cho vào cốc thủy tinh chịu nhiệt, thêm nước cất đến thể tích khoảng 5ml, thêm V ml dung dịch NaOH 1,0M (V = 1,0; 2,0; 3,0; 4,0; 5,0; 6,0 ml), đun cách thủy 60 phút ở nhiệt độ 100oC, lấy ra chuyển vào bình định mức 25 ml, định mức bằng nước cất hai lần đến vạch rồi cho toàn bộ dung dịch vào bình điện hóa. Tiến hành ghi đo bằng phương pháp von-ampe xung vi phân và von-ampe hòa tan hấp phụ.
* Khảo thời gian thủy phân: Lấy 0,25ml dung dịch cefadroxil có nồng độ 0,05mg/ml cho vào cốc thủy tinh chịu nhiệt, thêm nước cất đến thể tích khoảng 5 ml, thêm V ml dung dịch NaOH 1,0M (V là giá trị tốt nhất đã tìm được từ thí nghiệm trên), đun cách thủy ở nhiệt độ 100oC trong thời gian t (từ 5 đến 60 phút), lấy ra chuyển vào bình định mức 25,00ml, định mức bằng nước cất hai lần đến vạch rồi cho toàn bộ dung dịch vào bình điện hóa. Tiến hành ghi đo bằng phương pháp von-ampe xung vi phân và von-ampe hòa tan hấp phụ.
* Khảo sát nhiệt độ thuỷ phân: Lấy 0,25ml dung dịch cefadroxil có nồng độ 0,05mg/ml cho vào cốc thủy tinh chịu nhiệt, thêm nước cất đến thể tích khoảng 5ml, thêm V ml dung dịch NaOH 1,0M, đun cách thủy ở các nhiệt độ từ 30 đến 100oC, chuyển dung dịch vào bình định mức 25ml, định mức bằng nước cất hai lần đến vạch rồi cho toàn bộ dung dịch vào bình điện hóa. Tiến hành ghi đo bằng phương pháp von-ampe xung vi phân và von- ampe hòa tan hấp phụ.
2.3.6.3. Nghiên cứu cơ bản
Các thông số khảo sát:
- Khoảng quét thế: Khảng quét thế có thể xác định dựa vào phổ CV của chất điện hoạt. Khoảng quét thế không ảnh hưởng nhiều đến thế đỉnh
pic và cường độ dòng pic nhưng cần quét thể trong khoảng thế phù hợp sao cho lấy hết chân pic, không cần quá dài làm mất thời gian ghi đo không cần thiết.
- Tốc độ quét thế: Tốc độ quét thế phụ thuộc vào bước nhảy thế, trong phương pháp von-ampe xung vi phân tốc độ quét thế thường từ 5 đến 20 mV/s, tương ứng với bước nhảy thế từ 2 đến 8 mV. Tốc độ quét càng cao thì ghi dòng càng nhanh nhưng cũng ảnh hưởng đến cường độ dòng hòa tan và độ nhạy của phép đo.
- Biên độ xung: Thường từ 10 đến 80 mV, biên độ xung càng cao chiều cao pic càng lớn nhưng lại làm chân pic rộng, giảm độ phân giải.
- Thời gian đuổi khi oxi: Oxi hòa tan trong nước ảnh hưởng đến quá trình phân tích các chất hữu cơ trong nước do ảnh hưởng đến chất lượng đường khuếch tán thậm chí có thể phản ứng với chất phân tích làm giảm nồng độ của chất phân tích. Vì vậy trước khi đo cần thiết phải đuổi oxi khỏi nền. Trong phương pháp von-ampe loại bỏ oxi hòa tan trong nước bằng cách sục khí nito vào dung dịch, thời gian sục khí được chọn khi không có sự ảnh hưởng đến dòng pic.
- Thế tích lũy Eacc: Trong phương pháp von-ampe hòa tan hấp phụ thế tích lũy (làm giàu) là thông số quan trọng. Cần tìm được thế tích lũy phù hợp để chất hấp phụ lên điện cực lớn nhất trong cùng một khoảng thời gian, khi đó dòng hòa tan sẽ có giá trị lớn nhất, tăng độ nhạy của phép phân tích. Với các hợp chất hữu cơ một số tác giả thường chọn thế khoảng – 0,4V.
- Thời gian tích lũy tacc: Thời gian tích lũy càng nhiều thì chất hấp phụ lên điện cực càng lớn làm cường độ dòng hòa tan tăng, nhưng đến một giá trị nhất định cường độ dòng hòa tan sẽ bão hòa. Tùy thuộc nồng độ chất phân tích và yêu cầu phân tích mà có thể chọn thời gian tích lũy phù hợp.
2.3.7. Xử lý mẫu
Đối với chế phẩm ofloxacin:
Dung dịch gốc thử:
+ Đối với thuốc viên: Cân 20 viên thuốc, xác định khối lượng trung bình của 1 viên, nghiền mịn, trộn đều. Cân chính xác lượng thuốc chứa khoảng 50,0mg ofloxacin, hòa tan bằng nước cất, định mức đến 100ml, siêu âm 15 phút.
+ Thuốc nhỏ mắt: lấy 5 lọ thuốc nhỏ mắt Ofloxacin 0,3% (15mg/5ml) đổ dồn vào một lọ nhựa sạch, xác định thể tích trung bình của 1 lọ, lắc trộn kỹ. Chuyển toàn bộ dung dịch vào bình định mức 50ml, định mức đến vạch (dung dịch 1). Lấy chính xác 5,0 ml dung dịch 1 chuyển vào bình định mức 25ml, định mức bằng nước cất đến vạch (dung dịch 2A, dung dịch này có nồng độ tương ứng khoảng 0,3 mg/ml).
Đối với chế phẩm metronidazole
Dung dịch gốc thử: Cân 20 viên thuốc, xác định khối lượng trung bình
của 1 viên, nghiền mịn, trộn đều. Cân chính xác lượng thuốc chứa khoảng 50,0mg metronidazole, hòa tan bằng khoảng 20ml axit axetic 0,1N rồi dùng nước cất định mức đến 100ml, siêu âm 15 phút.
Đối với chế phẩm clopheniramin maleat
Dung dịch gốc thử: Cân 20 viên thuốc, xác định khối lượng trung bình
của 1 viên, nghiền mịn, trộn đều.
Với chế phẩm đơn thành phần chứa clopheniramin maleat: Cân chính xác lượng thuốc chứa khoảng 40,0mg clopheniramin maleat, hòa tan bằng nước, cất rồi định mức đến 1000ml, siêu âm 15 phút.
Với chế phẩm hai thành phần (chứa clopheniramin maleat và paracetamol): Cân chính xác lượng thuốc chứa khoảng 4,0mg clopheniramin
Đối với chế phẩm cefadroxil
Dung dịch gốc thử: Cân 20 viên thuốc, xác định khối lượng trung
bình của 1 viên, nghiền mịn, trộn đều. Cân chính xác lượng thuốc chứa khoảng 50,0mg cefadroxil, hòa tan bằng nước cất rồi định mức đến 1000ml, siêu âm 15 phút.
Trong các mẫu thuốc viên có các tá dược. Để loại bỏ ảnh hưởng của các tá dược trong phân tích mẫu thuốc chúng tôi định lượng bằng phương pháp thêm chuẩn.
Trong các mẫu nước tiểu chứa thuốc đem phân tích chứa nhiều tạp chất cần xử lý triệt để bằng phương pháp chiết pha rắn (SPE).
2.3.8. Xử lý số liệu
Để áp dụng phép phân tích vào thực tế cần phải đánh giá độ tin cậy của phương pháp. Các đại lượng thống kê dùng để đánh giá độ tin cậy của phương pháp phân tích gồm: độ lặp lại, khoảng tuyến tính, giới hạn phát hiện (LOD), giới hạn định lượng (LOQ). [11, 16, 17].
2.3.8.1. Độ lặp lại
Độ lặp lại là đại lượng đặc trưng cho mức độ gần nhau giữa các giá trị riêng lẻ xi của cùng một mẫu phân tích, được tiến hành bằng một phương pháp phân tích, trong cùng điều kiện thí nghiệm trong khoảng thời gian ngắn. Độ lặp lại xác định thông qua độ lệch chuẩn tương đối (RSD). Khi độ lệch chuẩn tương đối nhỏ thì phép phân tích có độ lặp lại tốt hay sai số của phép phân tích nhỏ.
2.3.8.2. Độ đúng
Độ đúng là mức độ gần nhau của kết quả phân tích với giá trị thực (hay giá trị đã được chấp nhận) µ. Độ đúng của phép phân tích được đánh giá thông qua việc phân tích mẫu chuẩn. Phương pháp phân tích có độ đúng tốt khi kết quả xác định được nằm trong khoảng tin cậy của giá trị thực µ ± ε
(được thông báo trong chứng chỉ của mẫu chuẩn) hoặc có thể so sánh kết quả xác định được với giá trị thực theo chuẩn student (t).
Ngoài ra có thể đánh giá độ đúng thông qua việc phân tích mẫu thêm chuẩn rồi tính độ thu hồi Rev.
2.3.8.3. Giới hạn phát hiện (LOD)
LOD được xem là nồng độ thấp nhất (xL) của chất phân tích mà hệ thống phân tích còn cho tín hiệu phân tích (yL) khác có nghĩa với tín hiệu của
mẫu trắng hay tín hiệu nền [16, 17]
Tức là: yL = yB k.SB
Với yB là tín hiệu trung bình của mẫu trắng sau nb thí nghiệm. SB là độ lệch chuẩn tín hiệu của mẫu trắng, k là đại lượng số học được chọn theo độ tin cậy mong muốn. Với độ tin cậy cần đạt là 99% thì k ≈3
b n Bj B j 1 B 1 y y n B 2 1 2 B n 1 Bi B i 1 S (y y )
Như vậy nồng độ nhỏ nhất mà thiết bị phân tích có thể phát hiện được theo phương trình hồi qui dạng y = a + bx trong phương pháp đường chuẩn được tính theo công thức: xL yB 3.SB a
b
Tuy nhiên, trong nhiều trường hợp khi không có chất phân tích thì không đo được tín hiệu nên có thể thay mẫu trắng bằng mẫu thêm chuẩn bằng cách thêm một lượng biết trước chất phân tích ở nồng độ nhỏ nhất có thể ghi tín hiệu vào nền mẫu thực, sau đó đo tín hiệu phân tích và cũng tính độ lệch chuẩn tương tự như trên.
Trường hợp không phân tích mẫu trắng thì có thể xem như độ lệch chuẩn mẫu trắng SB đúng bằng sai số của phương trình hồi qui, tức là SB = Sy
nồng độ phát hiện YLOD = a+ 3Sy. Sau đó dùng phương trình hồi qui có thể tìm được LOD [17]. LOD= b Sy . 3
2.3.8.4. Giới hạn định lượng (LOQ)
LOQ được xem là nồng độ thấp nhất (xQ) của chất phân tích mà hệ thống phân tích định lượng được với tín hiệu phân tích (yQ) khác có ý nghĩa
định lượng với tín hiệu của mẫu trắng hay tín hiệu nền [16,17].
yQ = yB + K. SB
Thông thường LOQ được tính với K = 10 tức là B 10.S LOQ b 2.3.8.5. Giới hạn tuyến tính
Trong phân tích định lượng khi tăng nồng độ chất phân tích đến giá trị nào đó thì quan hệ giữa tín hiệu đo và nồng độ chất phân tích không còn phụ thuộc tuyến tính. Tại nồng độ lớn nhất của chất phân tích mà tín hiệu phân tích còn tuân theo phương trình tuyến tính bậc nhất thì gọi là giới hạn tuyến tính. Khoảng nồng độ chất phân tích từ giới hạn định lượng đến giới hạn
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG QUI TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG OFLOXACIN 3.1.1. Khảo sát các điều kiện cơ bản xác định ofloxacin 3.1.1. Khảo sát các điều kiện cơ bản xác định ofloxacin
Khảo sát chọn thành phần và pH dung dịch nền
Khảo sát thành phần và pH của dung dịch nền rất quan trọng quyết định đến kết quả phân tích. Trong dung dịch điện phân để giảm sự điện di người ta cần cho thêm lượng dư chất điện li trơ vào dung dịch. Chất điện li thường dùng là: KCl; KNO3; NH4Cl; NaOH; HCl; các dung dịch đệm như photphat, axetat, Britton-Robinson… pH của dung dịch cũng ảnh hưởng đến thế đỉnh và cường độ dòng khuếch tán giới hạn. Khi thay đổi pH của dung dịch đo, thế đỉnh pic có thể dịch chuyển về phía âm hơn hoặc dương hơn tùy vào phản ứng điện cực.
Tiến hành ghi đo đường von-ampe vòng trên một khoảng thế rộng, quan sát sự xuất hiện pic trên đường catot và anot để xác định đặc tính trên điện cực của ofloxacin và khoảng quét thế phù hợp. Từ kết quả thu nhận được của quá trình ghi đường CV, tiến hành ghi đường DP của thuốc trong khoảng thế hẹp sao cho lấy hết chân pic mà không cần quá dài mất thời gian ghi đo không cần thiết.
Tiến hành đo trực tiếp von-ampe vòng dung dịch ofloxacin nồng độ 0,04mg/ml trong các dung dịch nền ở các pH khác nhau trong khoảng thế - 0,8V đến -1,6V, thấy trong nền đệm axetat; đệm Britton-Robinson; đệm photphat pH từ 3 đến 10 xuất hiện pic trên đường catot trong khoảng thế từ - 1,0 đến -1,5V. Đường CV của dung dịch ofloxacin cho thấy quá trình điện hóa trên điện cực thủy ngân là bất thuận nghịch.
Tiến hành ghi đường DP của dung dịch ofloxacin 0,01mg/ml trong các nền đệm axetat; đệm Britton-Robinson; đệm photphat ở pH = 6,5 trong
khoảng từ -1,0 đến -1,5V. Kết quả trên hình 3.2 cho thấy trong nền đệm photphat pic cao và cân đối hơn đệm Britton-Robinson và đệm axetat, vì vậy chọn nền đệm photphat. -800m -1.00 -1.20 -1.40 -1.60 U (V) -500n -400n -300n -200n -100n 0 I (A )
Hình 3.1: Đường CV của ofloxacin 0,04mg/ml trong nền đệm photphat pH = 6,5 -1.00 -1.10 -1.20 -1.30 -1.40 -1.50 U (V) -400n -300n -200n -100n 0 I (A )
Hình 3.2: Đường DP của ofloxacin 0,01mg/ml trong các nền đệm 1. nền đệm axetat pH = 6,5
2. nền đệm Britton-Robinson pH = 6,5 3. nền đệm photphat pH = 6,5
(ĐKTN: sục khí 120s; biên độ xung: 0,05V; thời gian 1 xung: 0,04s; tốc độ quét thế: 12,5mV/s)
Tiến hành khảo sát sự phụ thuộc cường độ dòng của dung dịch ofloxacin 3,0 µg/ml vào pH của dung dịch nền, trong nền đệm photphat pH từ 4,0 đến 8,5. Kết quả cho thấy, ở pH thấp pic nhọn nhưng không cân đối, khi pH tăng lên thế đỉnh pic dịch chuyển về phía âm hơn pic roãng, cường độ giảm. Cụ thể, ở pH < 6,0 cho pic nhọn nhưng lệch chân, điều này có thể làm giảm độ chính xác khi tiến hành định lượng, khi pH tăng lên, pic cân đối hơn