Khảo sát khoảng tuyến tính
Sau khi nghiên cứu các điều kiện thích hợp xác định ofloxacin chúng tôi tiến hành khảo sát khoảng tuyến tính và xây dựng đường chuẩn định lượng ofloxacin trong mẫu thuốc và mẫu nước tiểu theo phương pháp von ampe với các điều kiện đo trong bảng 3.5; nồng độ ofloxacin trong khoảng 2,0 µg/ml đến 11,0 µg/ml.
Bảng 3.5: Các điều kiện ghi đo dòng DP với dung dịch ofloxacin Điện cực làm việc HMDE Thời gian 1 xung 0,04s
Chế độ ghi DP Tốc độ quét thế 12,5mV/s
Kích thước giọt 4 Khoảng quét thế -1,1V÷ -1,5V
Thời gian sục khí nitơ 120s Dung dịch nền Đệm photphat
Biên độ xung 0,05V pH 6,5
Kết quả trình bày trong bảng 3.6, hình 3.12 và hình 3.13.
Bảng 3.6: Sự phụ thuộc tuyến tính cường độ dòng pic vào nồng độ ofloxacin Nồng độ ofloxacin (µg/ml) Cường độ dòng (nA)
2,0 - 58,0 2,5 - 66,7 3,0 - 77,4 4,0 - 106 5,0 - 125 6,0 - 149 7,0 - 168 8,0 - 197 9,0 - 217 11,0 - 263
Sử dụng phần mềm MS- Excel và Origin 8.0 để xây dựng đường chuẩn kiểm tra ý nghĩa thống kê của phương trình hồi qui.
Đường chuẩn ofloxacin
y = 23.028x + 10.1 R2 = 0.9995 0 50 100 150 200 250 300 0 2 4 6 8 10 12 C (m icrogam /m l) Ip (nA)
Hình 3.12: Sự phụ thuộc giữa Ip vào nồng độ ofloxacin -1.10 -1.20 -1.30 -1.40 U (V) -300n -250n -200n -150n -100n -50.0n 0 I (A ) Hình 3.13: Đường DP của ofloxacin phụ thuộc vào
nồng độ
Kết quả cho thấy trong khoảng 2,0 ÷ 11,0 µg/ml có sự phụ thuộc tuyến tính rõ rệt giữa cường độ dòng và nồng độ ofloxacin theo phương trình đường thẳng: IP = (23,028 ± 0,182)Cx + (10,100 ± 1,170); hệ sô tương quan R2 = 0,9995 rất gần với 1 cho thấy các điểm gần như nằm trên một đường thẳng. Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ)
Xác định giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng theo đường chuẩn. Tính toán Sy bằng chương trình tính chuyên dụng và bảng tính Exel đều cho kết quả: Sy = 1,44. Từ đó tính được: Giới hạn phát hiện: y 3.S LOD b 1,88.10-4 mg/ml; Tương đương 5,21.10-7M Giới hạn định lượng: y 10.S LOQ b 6,28.10-4 mg/ml; Tương đương 1,74.10-6M
Độ đúng của phép đo
Khảo sát độ đúng của phép đo bằng phương pháp thêm chuẩn. Thuốc chuẩn được thêm vào với tỉ lệ 80%; 100% và 120% vào dung dịch chuẩn nồng độ có sẵn là 4,0 µg/ml. Đo 4 mẫu độc lập ở điều kiện đã khảo sát. Kết quả đo và tính toán được trình bày trong bảng 3.7.
Bảng 3.7: Độ thu hồi của ofloxacin Tỉ lệ thêm vào (%) Nồng độ chuẩn thêm vào nền (µg/ml) Nồng độ chuẩn tìm lại (µg/ml) Nồng độ tìm lại trung bình (µg/ml) Ðộ lệch chuẩn tương đối RSD(%) Độ thu hồi Rev (%) 80% 3,2 3,20 3,15 1,58 98,44 3,18 3,13 3,09 100% 4,0 4,10 4,07 1,29 101,75 4,21 4,01 3,98 120% 4,8 4,72 4,76 1,13 99,17 4,79 4,70 4,81
Kết quả thực nghiệm cho thấy phương pháp có độ đúng cao, độ thu hồi trung bình là 99,82%, nằm trong giới hạn cho phép là 98 – 102%.
Độ chính xác
Khảo sát độ lặp lại ở nồng độ 3,0 µg/ml; 5,0 µg/ml; 9,0 µg/ml. Ở mỗi nồng độ, đo 6 mẫu độc lập ở điều kiện đã khảo sát. Kết quả đo và tính toán theo phương pháp đường chuẩn được trình bày trong bảng 3.8.
Bảng 3.8: Độ lặp lại của ofloxacin Mẫu (số xác định song song) Nồng độ chuẩn (µg/ml) Nồng độ xác định (µg/ml) Nồng độ trung bình (µg/ml) RSD (%) 1 3,00 2,98 2,95 1,27 2 3,00 2,89 3 3,00 2,80 4 3,00 2,95 5 3,00 2,99 6 3,00 3,06 1 5,00 4,86 4,88 1,16 2 5,00 4,87 3 5,00 4,99 4 5,00 4,87 5 5,00 4,82 6 5,00 4,91 1 9,00 9,12 8,94 0,81 2 9,00 9,20 3 9,00 8,79 4 9,00 8,77 5 9,00 8,85 6 9,00 8,91
Kết quả thực nghiệm cho thấy phương pháp có độ đúng, độ chính xác cao, độ lệch chuẩn tương đối đều nằm trong giới hạn cho phép (< 2%). Vậy có thể áp dụng để phân tích định lượng thuốc ofloxacin trong các mẫu thuốc. 3.1.3. Xây dựng qui trình định lượng ofloxacin trong mẫu thuốc.
Thuốc Ofloxacin hiện đạng lưu hành trên thị trường chủ yếu dưới hai dạng bào chế: thuốc nhỏ mắt và thuốc viên. Căn cứ vào các kết quả nghiên cứu và qui định về xác định độ đồng đều hàm lượng và độ đồng đều khối lượng trong kiểm nghiệm dược phẩm của Bộ Y tế (được qui định trong Dược
điển Việt Nam III, phần phụ lục 8.2 8.3) [1; 4], chúng tôi xây dựng qui trình phân tích đối với hai loại chế phẩm này như sau:
Qui trình xác định với thuốc nhỏ mắt: Theo qui định về định lượng hoạt chất trong thuốc nhỏ mắt [1; 4], lấy 05 lọ thuốc nhỏ mắt Ofloxacin 0,3% (15mg/5ml) đổ dồn vào một lọ nhựa sạch, xác định thể tích trung bình của 1 lọ, lắc trộn kỹ. Chuyển toàn bộ dung dịch vào bình định mức 50ml, định mức đến vạch (dung dịch 1). Lấy chính xác 5,00 ml dung dịch 1 chuyển vào bình định mức 25ml, định mức bằng nước cất đến vạch (dung dịch 2A, dung dịch này có nồng độ tương ứng khoảng 0,3 mg/ml).
Dùng micropipet lấy 250,0µl dung dịch 2A vào bình định mức 25ml, thêm 5ml dung dịch đệm photphat pH = 6,5 rồi định mức bằng nước cất đến vạch. Lắc kỹ rồi chuyển vào bình điện phân và tiến hành đo trong các điều kiện đã chọn. Hàm lượng ofloxacin được xác định bằng phương pháp thêm chuẩn.
Qui trình xác định với thuốc viên: Căn cứ vào qui định về định lượng hoạt chất trong thuốc viên nén và viên nang [1; 4], cân 20 viên thuốc, xác định khối lượng trung bình của 1 viên, nghiền mịn, trộn đều. Cân chính xác lượng bột tương ứng 50 mg ofloxacin hòa tan trong cốc thủy tinh rồi chuyển toàn bộ vào bình định mức 100ml, định mức bằng nước cất đến vạch. Lắc kỹ dung dịch, để lắng trong (dung dịch 1). Lấy 25,00 ml dung dịch 1 chuyển vào bình định mức 50ml, định mức bằng nước cất đến vạch (dung dịch 2B, dung dịch này có nồng độ tương ứng khoảng 0,25mg/ml).
Dùng micropipet lấy 300,0µl dung dịch 2B vào bình định mức 25,0ml, thêm 5ml dung dịch đệm photphat pH = 6,5 rồi định mức bằng nước cất đến vạch. Lắc kỹ rồi chuyển vào bình điện phân và tiến hành đo trong các điều kiện đã chọn. Hàm lượng ofloxacin được xác định bằng phương pháp thêm chuẩn.
Hàm lượng ofloxacin trong 1 lọ thuốc được xác định theo công thức: Hàm lượng ofloxacin /lọ =25 Cx 25 50 1*10 3
0, 25 5 5
(mg)
Hàm lượng ofloxacin trong 1 viên thuốc được xác định theo công thức: Hàm lượng ofloxacin /viên =25 Cx 50 100 200*10 3
0,3 50 50
(mg)
3.1.4. Áp dụng thực tế phân tích hàm lượng ofloxacin trong các mẫu thuốc Tiến hành định lượng ofloxacin trong 2 loại thuốc là thuốc nhỏ mắt Tiến hành định lượng ofloxacin trong 2 loại thuốc là thuốc nhỏ mắt Ofloxacin 0,3% (15mg/5ml) sản xuất tại Công ty Cổ phần Traphaco (Số lô SX: 290811) và thuốc Ofloxacin 200mg viên nén sản xuất tại Công ty Cổ phần Dược phẩm Imexpharm; (Số lô SX: 020512).
Tiến hành 6 lần cân đo mẫu theo qui phân tích đã xây dựng trong mục 3.1.3. Kết quả được trình bày trong bảng 3.9 và 3.10.
Bảng 3.9: Kết quả định lượng ofloxacin trong thuốc nhỏ mắt Ofloxacin 0,3% (15mg/5ml) sản xuất tại Công ty Cổ phần Dược phẩm Traphaco
Mẫu Nồng độ (µg/ml)
Hàm lượng (mg/ lọ)
Phần trăm so với ghi trên
nhãn (%) Số liệu thống kê 1 2,84 14,18 94,57 X= 14,07 (93,80%) SD = 0,20 RSD = 1,43 % m = 14,07 ± 0,21 (mức tin cậy 95%) 2 2,77 13,84 92,27 3 2,76 13,81 92,06 4 2,85 14,24 94,91 5 2,85 14,27 95,14 6 2,82 14,08 93,85
Bảng 3.10: Kết quả định lượng ofloxacin trong viên nén Ofloxacin 200mg sản xuất tại Công ty Cổ phần Dược phẩm Imexpharm;
Mẫu Nồng độ (µg/ml)
Hàm lượng (mg/viên)
Hàm lượng
phần trăm (%) Số liệu thống kê
1 2,95 196,99 98,49 X= 196,46 (98,23%) SD = 3,33 RSD = 1,69 % m = 196,46 ± 3,49 (mức tin cậy 95%) 2 3,02 201,60 100,80 3 2,98 198,77 99,39 4 2,90 193,65 96,83 5 2,89 192,83 96,41 6 2,92 194,94 97,47
Phân tích đối chứng theo phương pháp HPLC 98,5%
Kết quả định lượng hàm lượng ofloxacin trong 2 loại thuốc có độ lệch chuẩn tương đối < 2% đáp ứng yêu cầu của phương pháp định lượng dược phẩm theo qui định của Bộ Y tế. Hàm lượng phần trăm ofloxacin so với ghi trên nhãn của thuốc do Công ty Cổ phần Dược phẩm Traphaco sản xuất từ 92,06 đến 95,14; của thuốc do Công ty Cổ phần Dược phẩm Imexpharm là 96,41 đến 100,80%. Đối chiếu với tiêu chuẩn theo Dược điển Việt Nam 4, các thuốc đều đạt yêu cầu về hàm lượng từ 90% đến 110% so với ghi trên nhãn.
So sánh kết quả phân tích với mẫu gửi đi kiểm nghiệm đối chứng (MĐC) tại Công ty Cổ phần Hóa dược Việt Nam theo phương pháp HPLC (chuẩn Dược điển Việt Nam) cho thấy sự sai lệch giữa các kết quả phân tích là nhỏ, sự sai khác chỉ là ngẫu nhiên.
3.1.5. Nghiên cứu qui trình định lượng ofloxacin trong các mẫu nước tiểu Thực nghiệm thấy rằng, khi đo mẫu nước tiểu không chứa thuốc cùng Thực nghiệm thấy rằng, khi đo mẫu nước tiểu không chứa thuốc cùng điều kiện đo ofloxacin không thấy xuất hiện pic lạ nhưng đường nền bị lệch; tiến hành đo mẫu nước tiểu chứa thuốc có xuất hiện pic đặc trưng của ofloxacin nhưng không cân đối (hình 3.14 và 3.15).
Khi pha loãng nước tiểu rồi thêm thuốc vào đo thấy pic xuất hiện cân đối hơn. Như vậy các thành phần tạp chất trong nước tiểu có ảnh hưởng đến việc ghi đo dòng xung vi phân của ofloxacin nhưng không nhiều (chỉ gây hiệu ứng lệch chân pic mà không làm chuyển dịch thế đỉnh pic và không xuất hiện pic lạ gây nhiễu). Có thể thấy nếu nồng độ ofloxacin trong nước tiểu lớn có thể định lượng trực tiếp, đây có lẽ là ưu điểm rất lớn của phương pháp von- ampe khi định lượng ofloxacin trong nước tiểu so với các phương pháp khác đòi hỏi xử lý mẫu rất phức tạp. Để định lượng được các mẫu nước tiểu có nồng độ ofloxacin thấp (không pha loãng hoặc pha loãng rất ít) vẫn đảm bảo độ chính xác, chúng tôi lựa chọn được phương pháp xử lý mẫu nước tiểu theo phương pháp chiết pha rắn với cột chiết HLB.
-1.00 -1.10 -1.20 -1.30 -1.40 -1.50 -1.60 U (V) -800n -600n -400n -200n 0 I (A ) Hình 3.14: Đường CV của 1,0 ml nước tiểu chứa ofloxacin 10 µg/ml.
-1.10 -1.20 -1.30 -1.40 U (V) -150n -100n -50.0n 0 I (A )
Hình 3.15: Đường DP của 1,0ml nước tiểu không chứa thuốc (1) và 1,0 ml nước tiểu chứa ofloxacin 4 µg/ml (2). Cột chiết Oasis® HLB (hydrophilic-lipophilic balance) với chất hấp phụ kết hợp cơ chế tương tác pha đảo và tương tác ưa nước. Pha tĩnh này được trùng hợp từ hai monome có tỷ lệ bằng nhau là N-vinylpyrolidon có tính ưa nước và divinylbenzen có tính kỵ nước. Các nhóm chức phân cực của monome N-vinylpyrolidon đã tạo ra các hốc phân cực nên pha tĩnh Oasis có hệ số lưu giữ đối với các chất phân tích phân cực
1
cao hơn 3 lần so với cột C18 truyền thống đồng thời có khả năng làm việc trong khoảng pH rộng.
Pha tĩnh Oasis HLB có khả năng lưu giữ tốt các thành phần phân cực, các hợp chất acid, bazơ và cả trung tính, rất thích hợp để chiết và làm giàu các đối tượng thuốc trong mẫu máu và mẫu nước tiểu như kháng sinh β-lactam, các sulfonamids, các quinolones….
Có thể thấy, cột chiết Oasis HLB có nhiều ưu điểm hơn cột C18 về khả năng lưu giữ, tách chiết và khoảng pH làm việc, đặc biệt trong lĩnh vực phân tích dược phẩm nên chúng tôi lựa chọn cột HLB để xử lý mẫu nước tiểu.
Khảo sát thành phần dung dịch rửa giải:
Theo khuyến cáo của nhà sản xuất, với cột chiết Oasis HLB Extraction Cartridge có thể sử dụng dung môi rửa giải là dung dịch CH3OH để tách hiệu quả các dược phẩm. Theo Dược điển Việt nam Hỗn hợp dung dịch natri lauryl sulfat 0,24%, - acetonitril - acid acetic băng (580 : 400 : 20) để phân tích ofloxacin bằng phương pháp HPLC tác giả Chan K. P. và các đồng nghiệp đã dung hệ dung môi acetonitrile – methanol 0,05M - TBA·Cl - TFA (37,5 : 12,5 : 949 : 1) phân tích ofloxacin trong dịch sinh học [33]. Vì vậy chúng tôi tiến hành khảo sát trên một số hỗn hợp dung môi của metanol và acetonnitrin.
Với phương pháp chiết pha rắn (SPE), với các mẫu nước, việc lựa chọn chất hấp phụ và dung môi rửa giải dựa vào đặc tính phân cực và đặc tính ion của chất phân tích. Nếu chất phân tích là ion và phân tử phân cực thì nên sử dụng chất hấp phụ có tính trao đổi ion. Trong trường hợp chất phân tích phân cực mà không có tính ion thì tốt nhất nên sử dụng chất hấp phụ theo nguyên tắc pha đảo. Ofloxacin có tính phân cực, có tính axit yếu với cá giá trị pKa1 = 5,8; pKa2= 8,0 [31]; mẫu nước tiểu có pH khoảng 5 đến 6, vì
vậy chúng tôi lựa chọn pH của dung môi trong khoảng 4 đến 5, ở điều kiện này ofloxacin tồn tại ở dạng phân tử không phân ly, quá trình chiết sẽ theo nguyên tắc pha đảo.
Các hệ dung môi được pha chế từ metanol; acetonnitrin; dung dịch đệm photphat pH 4,0 và 5,0; đệm axetat pH 4,0 theo tỉ lệ thể tích. Thành phần của các hệ dung môi khảo sát được thể hiện trong bảng 3.11.
Để đánh giá hiệu quả chiết của các hệ dung môi chúng tôi tiến hành như sau:
Bước 1: Lấy mẫu nước tiểu người không uống thuốc. Thêm ofloxacin vào mẫu với nồng độ 0,5mg/ml. Lấy 2,5ml nước tiểu đã thêm thuốc cho chảy qua cột HLB. Rửa tạp chất bằng đệm photphat. Rửa giải thu hồi mẫu bằng dung môi khảo sát. Chuyển toàn bộ dịch chiết vào bình định mức 25ml, định mức bằng nước cất đến vạch (dung dịch A). Dùng pipet lấy chính xác 2,5ml dung dịch A chuyển vào bình định mức 25ml, thêm 8ml đệm photphat pH = 6,5, định mức đến vạch rồi chuyển vào bình điện phân và tiến hành đo theo điều kiện xác định ofloxacin đã chọn.
Bước 2: Tiến hành giống như bước 1 nhưng thuốc ofloxacin được thêm vào dịch chiết thu hồi được sau khi qua cột với một lượng tương đương.
Hiệu quả tách của dung môi được đánh giá thông qua hiệu suất chiết, tính theo công thức: t c I H (%) I
trong đó: It: cường độ dòng pic của mẫu giả xử lý theo qui trình (bước 1) Ic: cường độ dòng pic của mẫu chuẩn thêm vào dịch chiết mẫu trắng (bước 2).
Bảng 3.11: Hiệu suất chiết của các hệ dung môi
TT Hệ dung môi (tỉ lệ thể tích) Hiệu suất chiết
1 Acetonnitrin: đệm photphat pH 5,0 (96:4) 66,8
2 Metanol: đệm axetat pH 4,0 (90:10) 77,5
3 Metanol: đệm photphat pH 4,0 (90:10) 79,7
4 Metanol: nước (80:20) 81,3
5 Acetonnitrin: metanol: đệm photphat pH 4,0 (5:85:10) 86,6 6 Acetonnitrin: metanol: nước (10:80:10) 75,3
(ĐKTN: Thể tích dung môi = 3ml, tốc độ chảy 0,5 ml/phút)
Với hỗn hợp dung môi Acetonnitrin: metanol: đệm photphat pH 4,0 (5:85:10) cho hiệu suất chiết cao, pic gọn không có tín hiệu nhiễu. Vậy, chọn thành phần dung môi chiết là hỗn hợp Acetonnitrin: metanol: đệm photphat (5:85:10)
Sự ảnh hưởng của dung môi đến cường độ dòng pic
Dung môi chiết tốt phải không ảnh hưởng đến pic của chất phân tích, chúng tôi khảo sát sự ảnh hưởng của dung môi đến cường độ dòng pic của chất ofloxacin. Lấy 0,30 ml dung dịch ofloxacin 0,025mg/ml, thêm 8ml đệm photphat, Vml hỗn hợp dung môi, định mức thành 25ml được dung dịch ofloxacin 3,0 µg/ml. Tiến hành ghi đo đường DP trong các điều kiện như trong bảng 3.4. Kết quả thể hiện trong bảng 3.12 và biểu diễn trong hình 3.16.
Kết quả khảo sát cho thấy, với thể tích dung môi trong khoảng 1ml đến 4,0ml không có sự ảnh hưởng đáng kể đến cường độ dòng pic và thế đỉnh pic, khi thể tích dung môi lớn hơn 4,0ml có sự giảm cường độ dòng pic, chân pic lệch, vì vậy không nên dùng thể tích dung môi lớn hơn 4,0 ml. Như vậy hỗn hợp dung môi Acetonnitrin: metanol: đệm photphat (5:85:10) phù hợp dùng