Nghiên cứu xác định dư lượng một số cephalosporin trong nước thải nhà máy dược phẩm bằng phương pháp LC và MS MS

Thẩm định phương pháp phân tích dư lượng các kháng sinh trên và bước đầu ứng dụng phương pháp để đánh giá dư lượng kháng sinh trong nước thải của nhà máy sản xuất dược phẩm... Phương phá

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

NGUYỄN VĂN THUẬN NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH DƯ LƯỢNG MỘT

SỐ CEPHALOSPORIN TRONG NƯỚC THẢI NHÀ MÁY DƯỢC PHẨM BẰNG PHƯƠNG

PHÁP LC/MS-MS

LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC

HÀ NỘI 2014

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

NGUYỄN VĂN THUẬN

NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH DƯ LƯỢNG MỘT

SỐ CEPHALOSPORIN TRONG NƯỚC THẢI NHÀ MÁY DƯỢC PHẨM BẰNG PHƯƠNG

PHÁP LC/MS-MS LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC

CHUYÊN NGÀNH KIỂM NGHIỆM THUỐC - ĐỘC CHẤT

MÃ SỐ: 60720410

Người hướng dẫn khoa học:

PGS.TS Nguyễn Thị Kiều Anh

HÀ NỘI 2014

LỜI CẢM ƠN

Với lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc, em xin chân thành cảm ơn PGS TS

Nguyễn Thị Kiều Anh, người đã cống hiến hết mình vì sự nghiệp giáo dục,

người đã tận tình chỉ bảo và hướng dẫn em trong suốt quá trình nghiên cứu, hoàn thành luận văn

Em xin chân thành cảm ơn ThS Nguyễn Thị Thanh Phương – Giám Đốc

Trung Tâm Kiểm Nghiệm Hà Nội người đã tận tình giúp đỡ và tạo điều kiện cho

em hoàn thành luận văn này

Em xin chân thành cảm ơn ThS Nguyễn Thành Đạt – Phó Giám Đốc

Trung Tâm Kiểm Nghiệm Hà Nội đã hết lòng hướng dẫn em thực hiện khóa luận này

Cuối cùng, em xin cảm ơn toàn thể cán bộ nhân viên Trung Tâm Kiểm Nghiệm Hà Nội, gia đình và bạn bè, những người luôn động viên, khích lệ và tạo động lực cho em trong suốt quá trình học tập và thực hiện luận văn này

Hà nội, ngày 03 tháng 09 năm 2014

Học Viên Nguyễn Văn Thuận

LỜI CẢM ƠN

MỤC LỤC

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

DANH MỤC CÁC BẢNG

DANH MỤC CÁC HÌNH

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 3

1.1 TỔNG QUAN VỀ ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 3

1.1.1 Công thức cấu tạo, phân loại và phổ tác dụng 3

1.1.2 Công thức phân tử, công thức cấu tạo, đặc tính của các cephalosporin nghiên cứu 4

1.2 TỔNG QUAN VỀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 6

1.2.1 Các phương pháp chiết tách 6

1.2.2 Tổng quan về phương pháp săc ký lỏng- khối phổ 11

1.2.2.1 Thiết bị khối phổ 11

1.2.2.2 Một số kỹ thuật ghi phổ 14

1.2.2.3 Một số ưu điểm của sắc ký lỏng- khối phổ 15

1.3 MỘT SỐ NGHIÊN CỨU VỀ DƯ LƯỢNG THUỐC KHÁNG SINH CÓ TRONG NƯỚC Ở VIỆT NAM VÀ TRÊN THẾ GIỚI 15

1.4 MỘT SỐ NGHIÊN CỨU VỀ ĐỊNH LƯỢNG ĐỒNG THỜI CÁC CEPHALOSPORIN TRÊN THẾ GIỚI 17

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ CÁC PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20

2.1 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG TIỆN NGHIÊN CỨU 20

2.1.1 Hóa chất – chất chuẩn 20

2.1.2 Máy móc- thiết bị 20

2.1.3 Đối tượng nghiên cứu 21

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 21

2.2.1 Phương pháp thu thập và xử lý mẫu 21

2.2.2 Khảo sát điều kiện xử lý mẫu 21

2.2.3 Xây dựng phương pháp xác định hàm lượng một số Cephalosporin bằng kỹ thuật LC/MS/MS 22

2.2.4 Đánh giá phương pháp phân tích 22

2.3 PHƯƠNG PHÁP XỬ LÝ SỐ LIỆU 25

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 26

3.1 XÂY DỰNG QUY TRÌNH PHÂN TÍCH 26

3.1.1 Khảo sát điều kiện đo phổ khối 26

3.1.2 Khảo sát điều kiện LC 28

3.1.3 Khảo sát quy trình xử lý mẫu 36

3.1.4 Quy trình phân tích 39

3.2 ĐÁNH GIÁ PHƯƠNG PHÁP 41

3.2.1 Độ thích hợp của hệ thống 41

3.2.2 Tính chọn lọc của phương pháp 41

3.2.3 Độ tuyến tính 46

3.2.4 Độ đúng và chính xác của phương pháp 46

3.2.5 Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng 49

3.3 ỨNG DỤNG QUY TRÌNH XÂY DỰNG ĐƯỢC ĐỂ XÁC ĐỊNH DƯ LƯỢNG KHÁNG SINH CÓ TRONG NƯỚC THẢI CÔNG NGHIỆP DƯỢC 51

CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN 54

4.1 LỰA CHỌN QUY TRÌNH XỬ LÝ MẪU 54

4.2 LỰA CHỌN ĐIỀU KIỆN PHÂN TÍCH 54

4.3 Ý NGHĨA THỰC TIỄN CỦA ĐỀ TÀI 56

4.3.1 Tình hình kháng kháng sinh 56

4.3.2 Nghiên cứu dư lượng kháng sinh trong môi trường tại Việt Nam 58

KẾT LUẬN 60

KIẾN NGHỊ 61

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

ACN Acetonitril

BP 2010 Dược điển Anh 2010 (The Bristist Pharmacopoeia)

IS Internal standard (chuẩn nội)

C18 Octadecyl carbon chain

DAD Detector chuỗi diod (Diode array detector)

HPLC Sắc kí lỏng hiệu năng cao (High perform liquid chromatography)

PA Tinh khiết phân tích (Pure analysis)

UV - VIS Quang phổ hấp thụ tử ngoại khả kiến (Ultraviolet and visible absorption

Spectrophotometry)

LOD Giới hạn phát hiện (Limit of Detection)

LOQ Giới hạn định lượng (Limit of Quantitation)

SPE Chiết pha rắn (solid phase extraction)

IAC Chiết ái lực miễn dịch

DANH MỤC CÁC BẢNG  

Bảng 1.1 Phổ tác dụng của các cephalosporin 4

Bảng 1.2.Công thức, đặc tính của các cephalosporin nghiên cứu 5

Bảng 2.1 Các nguyên vật liệu cần có 20

Bảng 3.1 Điều kiện nguồn ion hóa ESI 26

Bảng 3.2: Kết quả lựa chọn ion mẹ 27

Bảng 3.3: Năng lượng bắn phá và các ion con của các kháng sinh, IS 28

Bảng 3.4 Chương trình Gradient pha động 29

Bảng 3.5 Kết quả khảo sát cột sắc ký 31

Bảng 3.6 Khảo sát qui trình chiết pha rắn 37

Bảng 3.7 Kết quả khảo sát qui trình chiết pha rắn 38

Bảng 3.8 Điều kiện LC và MS 40

Bảng 3.9 Độ thích hợp của hệ thống về thời gian và tỷ số diện tích của kháng sinh so với chuẩn nội 42

Bảng 3.10: Sự phụ thuộc tuyến tính giữa tỷ lệ của diện tích kháng sinh và chuẩn nội theo nồng độ 47

Bảng 3.11 Đánh giá độ chính xác và độ đúng của phương pháp 48

Bảng 3.12: Giá trị LOD và LOQ của phương pháp 49

Bảng 3.13 Kết quả phân tích mẫu nước thải thứ nhất 51

Bảng 3.13 Kết quả phân tích mẫu nước thải thứ hai 52

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1 Công thức chung của cephalosporin 3

Hình 1.2: Cấu tạo thiết bị khối phổ 12

Hình 3.1: Sắc ký đồ khảo sát chương trình pha dộng 29

Hình 3.2 Kết quả khảo sát cột sắc ký 32

Hình 3.3: Kết quả khảo sát thể tích tiêm mẫu 34

Hình 3.4: Kết quả khảo sát tốc độ dòng pha động 36

Hình 3.5: Biểu đồ so sánh hiệu suất chiết của 2 qui trình chiết pha rắn 38

Hình 3.6 Sắc ký đồ xác định tính đặc hiệu 45

Hình 3.7 Sắc ký đồ mẫu LOD 50

Hình 3.8: Sắc ký đồ mẫu thử thứ nhất 52

Hình 3.9: Sắc ký đồ mẫu thử thứ hai 53

kỷ 20 và rất được quan tâm tại các nước phát triển Nhiều nghiên cứu đã cho thấy rằng sự tồn tại của các kháng sinh và sự đề kháng kháng sinh trong môi trường nước đã trở nên phổ biến [17], [36]

Song song với việc nâng cao chất lượng chăm sóc và khám chữa bệnh cho nhân dân, lĩnh vực sản xuất thuốc được đặc biệt chú trọng Hiện cả nước có khoảng gần 200 doanh nghiệp có sản xuất dược phẩm với nhiều sản phẩm thuốc với đủ chủng loại: kháng sinh, thuốc chống viêm, thuốc tim mạch, thuốc bổ và vitamin…Kháng sinh nhóm Cephalosporin có phổ kháng khuẩn rộng trên trực khuẩn Gram (-) và Gram (+), đang được chỉ định rộng rãi trong việc điều trị các bệnh nhiễm khuẩn tại nước ta Hiện có nhiều nhà máy, xí nghiệp dược đang sản xuất nhóm kháng sinh này với các dạng bào chế khác nhau như: viên nén, viên nang, bột pha hỗn dịch uống…Tuy nhiên, việc kiểm soát sự tồn dư kháng sinh nhóm Cephalosporin trong nước thải ở các cơ sở sản xuất này vẫn chưa được quan tâm đúng mức Tới thời điểm hiện nay, ở Việt Nam đã có một số nghiên

cứu xác định dư lượng một số kháng sinh trong nước thải bệnh viện [2], nước sông [34],nhưng đối với đối tượng nước thải từ cơ sở sản xuất dược thì mới bước đầu nghiên cứu và có một nghiên cứu về dư lượng cefixim được công bố [20]

Xuất phát từ những lý do trên, chúng tôi tiến hành đề tài: “Nghiên cứu

xác định dư lượng một số cephalosporin trong nước thải nhà máy dược phẩm bằng phương pháp LC/MS-MS” với các mục tiêu như sau:

1 Khảo sát và lựa chọn điều kiện phân tích và qui trình xử lý mẫu để xác định đồng thời dư lượng các kháng sinh Cephalexin, Cefuroxim, Cefixim trong nước thải từ cơ sở sản xuất Dược bằng kỹ thuật LC/MS-MS ở nồng độ ppb

2 Thẩm định phương pháp phân tích dư lượng các kháng sinh trên và bước đầu ứng dụng phương pháp để đánh giá dư lượng kháng sinh trong nước thải của nhà máy sản xuất dược phẩm

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN

1.1 TỔNG QUAN VỀ ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU

1.1.1 Công thức cấu tạo, phân loại và phổ tác dụng

* Công thức chung của cephalosporin

S N

NH

R1O

R2 H

O

O O

H

H H

R3

Hình 1.1 Công thức chung của cephalosporin

Cephalosporin là dẫn chất acyl hóa của acid 7-aminocephalosporanic (A7AC), mang cấu trúc 3-cephem, 3 mới đủ liên hợp điện tử với vòng β –lactam để hợp chất có tác dụng sinh học

Trong A7AC, các carbon bất đối C(6) và C(7) đều có cấu hình R, và hầu như là nguyên nhân làm cho các cephalosporin có tính hữu tuyền khá mạnh [7]

* Phân loại và phổ tác dụng

Hiện nay, cephalosporin được phân loại thành 4 thế hệ dựa trên phổ tác dụng Các cephalosporin thế hệ trước tác dụng trên vi khuẩn Gram (+) mạnh hơn, nhưng trên Gram (-) yếu hơn thế hệ sau và ngược lại [12] Phổ chung của

- Tác dụng tốt trên vi khuẩn Gram (-), bền vững với

β-lactamase, tác dụng trên cả P aeruginosa

- Trên vi khuẩn Gram (+), tác dụng kém thế hệ 1

Thế hệ

IV

Cefepim… - Phổ tác dụng tương tự nhưng mạnh hơn thế hệ 3

Thuốc tác dụng tốt với các vi khuẩn

Enterobacteriaceae, Haemophilus, Pseudomonas, Streptococcus, lậu cầu, não mô cầu

- Bền vững với β-lactamase

1.1.2 Công thức phân tử, công thức cấu tạo, đặc tính của các cephalosporin nghiên cứu

Bảng 1.2 Công thức, đặc tính của các cephalosporin nghiên cứu [3],[7],[14]

Tên chất Thế

hệ

Công thức phân tử, công thức cấu tạo Tính chất vật lí

ít tan trong ethanol

- Độ tan trong nước: 0,284 g/l

- pKa1 = 3,15; pKa2 = 1,1

2.Cephalexin I

C16H17N3O4S

- Dạng bột kết tinh màu trắng, hơi

có mùi lưu huỳnh

- Tan ít trong nước; tan trong các dung dịch kiềm loãng, thực tế không tan trong ethanol 96%, ether

- Độ tan trong nước: 2,97.10-1 g/l

- pK a1 = 3,45; pK a2 = 7,44

3.Cefixim III

C16H15N5O7S2

-Bột trắng hoặc gần như trắng Ít tan trong nước, aceton, glycerin, tan trong methanol, propylen glycol, hơi tan trong ethanol, thực

tế không tan trong ether, ethyl acetat và hexan, hầu như không tan trong dung dịch sorbitol 70% -Độ tan trong nước: 0,104 g/l -Hằng số pKa1 = 3,45; pKa2 = 2,92

có mùi của acid acetic

- Dễ tan trong nước, ít tan trong methanol

+ Chiết các chất dạng acid, base hoặc chất lưỡng tính

+ Chiết các chất dạng nội phức

+ Chiết cặp ion

Chiết lỏng- lỏng là kỹ thuật đơn giản, dễ thực hiện và được sử dụng phổ biến nhất trong các phương pháp xử lý mẫu huyết tương và mẫu có nền mẫu tương đối phức tạp Tuy nhiên kỹ thuật này có nhược điểm: dùng nhiều dung môi, khó khăn kết nối với các thiết bị như GC hay HPLC, có thể tạo nhũ dịch làm sai lệch kết quả

b Chiết pha rắn

Chiết pha rắn (solid phase extraction, SPE) là một phương pháp chiết dựa vào

sự phân tán của chất phân tích giữa hai pha lỏng và rắn, trong đó các chất được

chiết từ pha lỏng vào pha rắn Pha rắn thường là các hạt nhỏ, xốp được nhồi vào các ống nhỏ Pha lỏng chảy qua ống, các chất phân tích tương tác với pha rắn sẽ được giữ lại trên ống Các chất này được rửa giải khỏi pha rắn bằng một dung môi khác phù hợp Thông thường thể tích dung môi rửa giải nhỏ hơn nhiều so với thể tích dịch ban đầu Vì thế qua chiết pha rắn, ngoài tác dụng làm sạch có thể thực hiện thêm bước làm giàu mẫu Ngoài ra, người ta có thể sử dụng luồng khí nóng để rửa giải các chất từ pha rắn, đây là cách thuận tiện để chuyển các

chất vào phân tích trên sắc ký khí [6], [10], [29]

Quá trình chiết pha rắn trải qua 4 giai đoạn: hoạt hóa cột, nạp mẫu, rửa tạp chất và rửa giải [10]

- Hoạt hóa cột chiết: Cho dung môi phù hợp đi qua pha rắn để làm ướt các nhóm hoạt động, đồng thời loại bỏ các khí trong cột và thay thế vào đó là dung môi

- Nạp mẫu: Trước khi nạp mẫu vào cột, nếu cần phải xử lý mẫu sơ bộ để đưa mẫu vào môi trường phù hợp sao cho giai đoạn này phải lưu giữ được toàn

bộ chất phân tích trên cột Chất phân tích cùng một số chất khác được giữ lại trên cột, các tạp chất đi ra khỏi cột càng nhiều càng tốt để tránh cạnh tranh và ảnh hưởng đến quá trình tương tác của chất phân tích với pha tĩnh

- Rửa tạp chất: Sau khi nạp mẫu, trên cột vẫn còn nhiều tạp chất khác có liên kết với pha tĩnh Phải chọn được dung môi rửa tạp sao cho có thể hòa tan và kéo được các tạp chất mà không kéo theo chất phân tích

- Rửa giải: Chất phân tích lưu giữ trên cột được hòa tan và kéo ra khỏi cột bằng một dung môi phù hợp Cần phải tối ưu loại dung môi rửa giải, thể tích

dung môi rửa giải, pH dung môi rửa giải, tốc độ rửa giải…để có thể rửa giải được tối đa chất phân tích nhưng rửa giải tối thiểu các tạp chất còn trên cột

¾ Các loại pha rắn cơ bản và ứng dụng trong phân tích

Chiết pha rắn có bản chất tương tự như sắc ký lỏng, vì thế các loại pha rắn được

sử dụng trong SPE hầu hết tương tự pha rắn của cột sắc ký lỏng Tuy nhiên có sự khác nhau nhất định về dạng hoặc tính chất của pha rắn Hầu hết các chất hấp phụ sử dụng trong SPE đều có bản chất nền Silica có gắn với các nhóm hữu cơ khác

* Nền silica (SiO 2 )

Silica là một polymer vô cơ có cấu trúc chung là (SiO2)x, có thể được tạo thành nhờ quá trình polymer hóa acid silicic Bề mặt silica có chứa các nhóm

hydroxyl (-OH) và thường được gọi là nhóm silanol (SiOH)

Tùy theo đặc tính của pha liên kết mà có thể chia thành một số loại cột có bản chất khác nhau, có thể kể ra bao gồm pha đảo, pha thuận và trao đổi ion

- Pha đảo: Nền silica gắn thêm các nhóm không phân cực như C8, C18…

- Pha thuận: Nền silica gắn thêm các nhóm phân cực như –NH2, -CN, diol…

- Trao đổi ion: Nền silica gắn thêm các nhóm trao đổi cation (dẫn chất phenylsulfonic) hoặc anoin (dẫn chất amoni bậc 4)

* Florisil (Magnesi silicat)

Magnesi silicat (MgSiO3) là các loại hạt có đường kính từ 25-200 µm kích thước thông thường từ 60-100 µm Đây là loại chất hấp phụ ít phân cực và tính acid yếu hơn so với Silica Vì có bản chất phân cực yếu nên Florisil thường được dùng cho các HCBVTV rất phân cực, những chất mà không thể sử dụng cột silica do liên kết quá mạnh với các nhóm silanol

* Graphite cacbon (than chì)

Nền than chì cũng đã được một số tác giả nghiên cứu làm pha rắn trong SPE Than chì là chất kỵ nước bởi vì cấu trúc bao gồm các lớp carbon phẳng dạng lục giác Bề mặt có dạng xốp, cũng có các nhóm hoạt động như nhóm hyroxyl, nhóm carbonyl và các nhóm acid vì thế có thể hấp phụ các chất khác

Bề mặt này cũng có thể gắn các nhóm tương tự như đối với nền silica

* Nền polymer hữu cơ tổng hợp

Các loại nền có bản chất tự nhiên đã chứng minh được vai trò quan trọng của nó trong SPE, tuy nhiên những nền này dễ bị ảnh hưởng bởi môi trường, có thể bị bất hoạt bởi các yếu tố bên ngoài như không khí, nước, môi trường pH Để thay thế, ngày nay người ta sử dụng các loại nền polymer hữu cơ trên cơ sở trùng hợp một số chất hữu cơ Những chất này có diện tích bề mặt lớn, dung lượng hấp thu lớn hơn bởi vì tỷ lệ carbon cao hơn và bề mặt kỵ nước hơn Hơn nữa khoảng

pH làm việc của nền polymer rộng hơn so với nền silica

- Styren-divinylbenzen (PS-DVB)

Nền PS-DVB thu được khi đồng trùng hợp styren và divinylbenzen, có diện tích bề mặt lớn nên dung lượng của cột rất cao, hoạt động ở bất kỳ khoảng

pH nào vì không có nhóm silanol Đây là pha rắn thích hợp cho các chất kém phân cực, không phân cực có khối lượng phân tử lớn

- Các nền polymer chứa nhóm hoạt động

Gần đây, nhiều tác giả đã nghiên cứa phát triển để gắn các nhóm ưa nước trên nền PS-DVB nhằm tăng tính chọn lọc và khả năng ứng dụng của loại cột này Điển hình nhất có thể kể đến là cột Oasis HLB.của Waters HLB (Hydrophilic Lipophilic Balance) có nghĩa là cân bằng thân nước, thân dầu Loại cột này được chế tạo bằng cách đồng trùng hợp N-vinylpyrrolydon và divinylbenzen, trên bề mặt có hai vùng, một vùng thân nước và một vùng thân dầu

* Mixed mode

Cột Mixed mode (tính năng trộn lẫn) là cột có nhiều cơ chế lưu gữ khác nhau, nhằm đạt hiệu quả cao hơn trong quá trình làm sạch mẫu Thông thường, cột mixed-mode có hai cơ chế lưu giữ khác nhau

* Ái lực miễn dịch

Chiết bằng ái lực miễn dịch (IAC) dựa trên liên kết kháng nguyên – kháng thể trong đó một loại imunoglobulin được dùng để gứn với chất phân tích Bởi vì imunoglobulin liên kết chọn lọc với chất kháng nguyên dùng để sản xuất ra nó nên đây là kỹ thuật lý tưởng để phân tích chọn lọc một một chất hoặc một nhóm chất nào đó Ứng dụng của IAC còn khá hạn chế do kỹ thuật này có ứng dụng hạn chế và khá tốn kém

1.2.2 Tổng quan về phương pháp sắc ký lỏng - khối phổ [1],[13]

Phương pháp phổ khối lượng (Mass Spectrometry) là một phương pháp phân tích dụng cụ quan trọng trong phân tích thành phần và cấu trúc các chất Phương pháp này nghiên cứu các chất bằng cách đo, phân tích chính xác khối lượng phân

tử của chất đó dựa trên sự chuyển động của các ion nguyên tử hay ion phân tử

trong một điện trường hoặc từ trường nhất định

Trong nghiên cứu khối phổ của bất kỳ chất nào, trước tiên nó phải được chuyển sang trạng thái bay hơi, sau đó được ion hoá bằng các phương pháp thích hợp Các ion tạo thành được đưa vào đo trong bộ phân tích khối của máy khối phổ Tùy theo loại điện tích của ion nghiên cứu mà người ta chọn kiểu quét ion dương (+) hoặc âm (-) Kiểu quét ion dương thường cho nhiều thông tin hơn về ion nghiên cứu nên được dùng phổ biến hơn

Nạp mẫu dạng khí: Áp dụng đối với các chất khí, chất lỏng (dễ bay hơi) bằng syringe

tiêm mẫu hoặc kết nối với hệ sắc ký khí (GC/MS), sắc khí lỏng (LC/MS)

Nạp mẫu trực tiếp: Áp dụng với các rắn, tinh thể, sơn hoặc keo

Bộ nguồn ion hóa (Ion source): Có nhiệm vụ ion hoá phân tử trung hoà thành

các ion phân tử mang điện tích hoặc sự bắn phá, phân mảnh phân tử trung hoà

thành các mảnh ion, các gốc mang điện tích bằng các phần tử mang năng lượng cao Những tiểu phân không bị ion hóa sẽ bị hút ra khỏi buồng ion qua bơm chân không của thiết bị MS Các ion phân tử tạo thành sẽ được tăng tốc độ và thu gọn (hội tụ) Mỗi ion có khối lượng m và điện tích z nhất định Tỷ số m/z (hay còn gọi là số khối) có ảnh hưởng rất lớn đối với chuyển động này của ion Đây là một thông số rất quan trọng trong định tính cũng như định lượng

− Bộ phận phân tích khối (mass analyzer): Sau khi được tạo thành thì các ion sẽ

được gia tốc và tách riêng theo tỷ số m/z nhờ tác dụng của điện trường và từ trường để đi đến bộ phận phát hiện

− Bộ phận phát hiện ion (detector): có nhiệm vụ chuyển các ion đã đến, khuếch

đại thành tín hiệu điện đo bằng hệ điện tử của máy khối phổ

− Bộ phận ghi và xử lý số liệu (data system)

Hình 1.2: Cấu tạo thiết bị khối phổ

Trong đó:

1: Bộ nạp mẫu (Inlet)

2: Bộ nguồn ion hóa (Ion source)

3: Bộ phận phân tích khối (mass analyzer)

4: Bộ phận phát hiện (Detector)

5: Bộ phận ghi và xử lý số liệu (data system)

5 4

3

2 

1 

      Trong rất nhiều năm, các nhà nghiên cứu kỹ thuật sắc ký lỏng ghép khối phổ phải đối mặt với rất nhiều khó khăn trong việc tìm cách giải quyết được sự tương thích giữa hệ thống sắc ký lỏng và đầu dò khối phổ Nguyên nhân là do quá trình phân tích với đầu dò MS đòi hỏi mức độ chân không cao, nhiệt độ cao, các chất khảo sát phải ở trạng thái khí, vận tốc dòng chảy nhỏ; trong khi hệ thống LC lại hoạt động ở áp suất cao với một lượng dung môi tương đối lớn, nhiệt độ tương đối thấp, các chất phân tích ở thể lỏng Để khắc phục những khó khăn trên, cần phải có một kỹ thuật trung gian gọi là giao diện Rất nhiều kỹ thuật giao diện (interface technology) như chùm tia hạt, bắn phá nguyên tử nhanh dòng liên tục

… đã được nghiên cứu và ứng dụng, nhưng mãi cho đến cuối thập nhiên 80 nhờ

kỹ thuật ion hóa tại áp suất khí quyển (Atmospheric Pressure Ionization – API) mới tạo ra bước đột phá thật sự cho phương pháp LC-MS/MS

Ưu điểm nổi bật của API là khả năng hình thành ion tại áp suất khí quyển ngay trong buồng ion hóa Điều này khác biệt với các kiểu ion hóa sử dụng trước

đó cho LC-MS như bắn phá nguyên tử nhanh với dòng liên tục (Continuous Flow- Fast Atom Bombardment CF-FAB) hay như tia nhiệt (Thermospray – TS) đều đòi hỏi áp suất thấp Một thuận lợi nữa của API là sự ion hóa mềm (soft ionization), không phá vỡ cấu trúc của hợp chất cần phân tích nhờ đó thu được khối phổ của ion phân tử Ngoài ra, với kỹ thuật này, người ta có thể điều khiển được quá trình phá vỡ ion phân tử để tạo ra những ion con tùy theo yêu cầu phân tích Có ba kiểu hình thành ion ứng dụng cho nguồn API trong LC-MS:

• Ion hóa phun điện tử (Electrospray Ionization – ESI)

• Ion hóa hóa học tại áp suất khí quyển (Atmospheric Pressure Chemical Ionization – APCI)

• Ion hóa bằng photon tại áp suất khí quyển (Atmospheric Pressure Photon

Trong đó, hai kỹ thuật APCI và ESI, đặc biệt là ESI được sử dụng nhiều hơn cả

1.2.2.2 Một số kỹ thuật ghi phổ [13],[31]

Trong phân tích khối phổ việc xác định chính xác 1 ion rất quan trọng cho

việc xác định được hợp chất cần phân tích Một hợp chất xác định trong những điều kiện nhất định sẽ cho 1 ion có số khối xác định trên phổ đồ Tuy nhiên, một ion có số khối xác định trên phổ đồ lại có thể xuất phát từ nhiều hợp chất khác nhau vì vậy trong phân tích một hỗn hợp hoặc lẫn nhiều tạp chất nếu điều kiện sắc kí chưa đảm bảo việc phân tách thì việc nhận định các ion thông qua số khối trên phổ đồ có thể bị ảnh hưởng Đối với trường hợp này khối phổ 1 lần (MS) có thể cho kết quả không chính xác so với kỹ thuật khối phổ nhiều lần (2 lần MS/MS)

+ Quét toàn phổ (Full Scan)

Khi thao tác với chế độ scan, đầu dò sẽ nhận được tất cả các mảnh ion để cho khối phổ toàn ion đối với tất cả các chất trong suốt quá trình phân tích Thường dùng để nhận danh hay phân tích khi chất phân tích có nồng độ đủ lớn Đối với đầu dò khối phổ ba tứ cực, chế độ Full scan MS thường được lựa chọn để khảo sát ion mẹ, chế độ Full scan MS/MS quét tất cả các ion con tạo thành thường được sử dụng để xác định ion con cho tín hiệu ổn định và bền nhất

+ Selected Ion Monitoring (SIM)

Trong chế độ SIM, đầu dò MS chỉ ghi nhận tín hiệu một số mảnh ion đặc trưng cho chất cần xác định Khối phổ SIM chỉ cho tín hiệu của các ion đã được lựa chọn trước đó, do vậy không thể dùng để nhận danh hay so sánh với các thư viện

có sẵn Đối với đầu dò khối phổ ba tứ cực, chế độ SIM thường được lựa chọn để khảo sát năng lượng phân mảnh khi đã biết ion mẹ

+ SRM (Selected Reaction Monitoring) và MRM (Multiple Reaction Monitoring)

Đối với khối phổ ba tứ cực, là máy đo khối phổ hai lần liên tiếp (MS-MS), 2 kỹ thuật ghi phổ có độ nhạy cao thường được sử dụng là SRM và MRM

− SRM: cô lập ion cần chọn, sau đó phân mảnh ion cô lập đó, trong các mảnh ion sinh ra, cô lập 1 mảnh ion con cần quan tâm và đưa vào đầu dò

để phát hiện

− MRM: trên thực tế, do yêu cầu về mặt kỹ thuật đối với phân tích vi lượng nên các ion con cần quan tâm thường từ 2 trở lên, do vậy kỹ thuật ghi phổ MRM thông dụng hơn SRM Đầu tiên, cô lập ion cần chọn (ion mẹ) ở tứ cực thứ nhất, phân mảnh ion cô lập đó tại tứ cực thứ 2 (thực chất là buồng

va chạm) thu được các ion con, cô lập 2 (hoặc nhiều) ion con cần quan tâm ở tứ cực thứ 3 và đưa vào đầu dò để phát hiện

1.2.2.3.Một số ưu điểm của sắc ký lỏng khối phổ

Đặc tính nổi bật của LC-MS là tính chọn lọc và độ nhạy cao Vì vậy mà khối phổ thường được sử dụng để xác định lượng siêu vết trong mẫu có thành phần phức tạp như định tính, định lượng thuốc và các dạng chuyển hóa trong dịch sinh học, độc chất học, định lượng dư lượng thuốc trừ sâu, chất bảo quản, chất cấm trong các mẫu thực phẩm, mỹ phẩm, dược liệu, thủy hải sản và môi trường Ngoài ra phương pháp khối phổ còn có thể được sử dụng để xác định mức độ tinh khiết của chất chuẩn hoặc mẫu chuẩn cần phân tích

1.3 MỘT SỐ NGHIÊN CỨU VỀ DƯ LƯỢNG THUỐC KHÁNG SINH CÓ TRONG NƯỚC Ở VIỆT NAM VÀ THẾ GIỚI

Hướng nghiên cứu về dư lượng kháng sinh và các loại dược phẩm nói chung

như một nghiên cứu tại New Mexico (Hoa Kỳ) đã phát hiện ra ngoài kháng sinh còn có một số dược phẩm như: thuốc chống trầm cảm, chống dị ứng, viêm, và hoóc môn trong nước bề mặt và nước ngầm ở các nồng độ khác nhau Nhóm nghiên cứu đã sử dụng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao kết hợp khối phổ (HPLC-MS/MS) để xác định các kháng sinh nhóm Tetracyclin có trong các nguồn nước tự nhiên Cụ thể oxytetracyclin 1890 – 4600 ng/L; tetracyclin 660 ng/L [28]

phương pháp phân tích sự có mặt của các kháng sinh họ Floquinolon trong nước thải bệnh viện Nhóm nghiên cứu đã sử dụng kỹ thuật chiết pha rắn dùng cột silicagel tự chế tạo và định lượng được các kháng sinh ciprofloxacin, norfloxacin, levofloxacin, ofloxacin và lomefloxacin có mặt trong nước thải bệnh viện bằng HPLC với detector huỳnh quang Điều kiện sắc ký: cột C18, nhiệt độ cột 50ºC, tốc độ dòng 0,7 ml/phút, bước sóng kích thích 278 nm và bước sóng phát xạ 445 nm Hiệu suất thu hồi trong nền nước thải đạt từ 80 đến 106% và giới hạn phát hiện trong khoảng 0,5 đến 1,0 µg/L [2]

Trong đề tài nghiên cứu về dư lượng kháng sinh Macrolides, Sulfonamides

và Trimethoprim ở lưu vực sông Mê Kong, Satoshi Managaki và cộng sự đã sử dụng phương pháp LC/MS/MS với cột sắc ký YMC pro C18 (3 µm, 150 mm ×

2 mm), pha động là hệ: Dung dịch acid formic 1% - MeOH (1 % acid formic) chạy gradient, với tốc độ dòng là 0,15 ml/phút Mẫu nước sông được xử lý bằng

kỹ thuật chiết pha rắn với cột Oasis HLB (200mg, Water) Giới hạn định lượng của phương pháp là từ 0,1 – 1,2 ng/ml [34]

Vishal et al cùng cộng sự đã tiến hành nghiên cứu dư lượng của các kháng sinh: amoxicillin, ceftriaxon, amikacin, ofloxacin, ciprofloxacin, norfloxacin và

levofloxacin trong nước thải tại một bệnh viện ở Ujjain, Ấn Độ tại các thời điểm khác nhau Dư lượng ciprofloxacin được phát hiện là 2,20 – 236,6 µg/l và norfloxacin là 6,4 – 29,6 µg/l Một nghiên cứu khác cũng đã xây dựng phương pháp để xác định các nhóm thuốc kháng sinh fluoroquinolon, sulfonamid, trimethoprim, beta-lactam (penicillin và cephalosporin), nitroimidazol và tetracyclin trong nước thải bệnh viện Kết quả cho thấy nồng độ chất phân tích khác nhau dao động trong phạm vi sau đây (đơn vị µg/l): ciprofloxacin 3,6-101,0; metronidazol 0,1-90,2; sulfamethoxazol 0,4-12,8; ofloxacin 0,2-7,6; trimethoprim 0,6-7,6; và doxycyclin 0,6-6,7 [35],[36]

1.4 MỘT SỐ NGHIÊN CỨU VỀ ĐỊNH LƯỢNG ĐỒNG THỜI CÁC CEPHALOSPORIN TRÊN THẾ GIỚI

Nghiên cứu của Xiao-Lin Hou và cộng sự (2013) đã xây dựng và đánh giá

dư lượng của 10 cephalosporins (cefalexin, cefquinome, ceftiofur, cefacetrile, cefalonium, cefapirin, cefazelin, cefoperazone, cefradine, cefotaxim) và desacetylcefapirin trong sữa bò bằng kĩ thuật UHPLC-ESI-MS/MS Các mẫu được chiết pha rắn qua cột HLB sau khi pha loãng với dung dịch đệm phosphate (pH 8,5) Mẫu được phân tích bằng LC-MS/MS trên cột UPLC BEH RP18 (2,1mm × 100 mm, 1,7µm) với gradient rửa giải (acid formic 0,1% và MeOH) Nghiên cứu đã sử dụng chuẩn nội là Ceftiofur-D3 Các giá trị LOD từ 0,004 µg/kg đến 0,60 µg/kg; LOQ từ 0,014 µg/kg đến 2,0 µg/kg Phương pháp được ứng dụng để phân tích 40 mẫu sữa thu thập trên thị trường và 9 mẫu sữa bò sau khi tiêm dưới da Cephalexin [37]

Một nghiên cứu của Trần Thị Thanh Huế (2013) đã xây dựng phương pháp xác định dư lượng Cefixim có trong nước thải từ cơ sở sản xuất Dược Đề tài sử

dụng kỹ thuật HPLC, loại tạp bằng cloroform và acid hóa bằng HCl đến pH 3 Điều kiện sắc ký: Cột Luna C18, detector DAD: λ = 285 nm, thể tích tiêm mẫu:

200 µl, nhiệt độ cột: 32ºC, pha động: methanol – dung dịch đệm phosphat pH = 3,2 (dung dịch NaH2PO4 40 mM, điều chỉnh pH bằng H3PO4) Giới hạn phát hiện của cefixim là 6,68 ng/ml [20]

Năm 1982, Fasching CE và Peterson LR đã tiến hành nghiên cứu so sánh hai phương pháp tách ba kháng sinh cephapirin, cefotaxim và cefoxitin từ protein huyết thanh bằng cột trao đổi anion Sephadex DEAE – A-25 và kết tủa protein với dung dịch acid tricloacetic 6% hoặc ethanol Khi dùng Sephadex để xử lý mẫu, protein và chất cản trở bị loại đi, hoạt chất được cố định trên cột và được rửa giải bằng dung dịch natri clorid 1 M Nghiên cứu được tiến hành phân tích mẫu của 12 bệnh nhân Kết quả cho thấy xử lý mẫu bằng chiết pha rắn với cột trao đổi ion cho thấy phương pháp định lượng nhanh, chính xác, cải thiện độ thu hồi thuốc và loại được hầu hết chất cản trở trong nền mẫu khi phân tích bằng HPLC [19]

Một nghiên cứu của Cha JM và cộng sự tại Đại học bang Colorado, Fort Collins Mỹ (2005), phương pháp đã xây dựng và đánh giá dư lượng của các kháng sinh ß-Lactam gồm: Amoxixillin, ampicillin, oxacillin, cloxacillin, và cephapirin trong nước bề mặt và nước thải nhà máy Nghiên cứu sử dụng kĩ thuật chiết pha rắn với cột Oasis HLB ở pH 7,5 và phương pháp LC-MS/MS với cột sắc ký Xterra MS C18 (2,1 mm × 4 mm, 2,5 µm) cùng cột bảo vệ Pha động gồm: Acid formic 0,1% - Methanol và acetonitrile chạy gradient, nhiệt độ cột 45°C và thể tích tiêm 40 µL) Giới hạn phát hiện của phương pháp được ước tính trong khoảng từ 8 đến 10 ng/L trong nước bề mặt, 13 đến 18 ng/L trong nước hạ lưu sông và 8 đến 15 ng/L trong nước từ một nhà máy xử lý nước thải Phương

pháp đã được ứng dụng để đánh giá sự có mặt của các ß-Lactam trong nước một dòng sông và một nhà máy xử lý nước thải ở phía bắc bang Colorado, Mỹ [15] Một nghiên cứu của Samanidou VF, Hapeshi EA, Papadoyannis IN thuộc Phòng thí nghiệm phân tích Hóa học, khoa Hóa, Đại học Aristotle của Thessaloniki, Hy Lạp năm 2003 đã xây dựng phương pháp xác định đồng thời bốn Cephalosporin Cephalexin, cefadroxil, cefaclor, cefotaxim trong dược phẩm cũng như trong huyết thanh và nước tiểu người bằng HPLC, sử dụng cột Spherisorb ODS -2 250 x 4 mm, phát hiện tại bước sóng 265 nm, giới hạn phát hiện là 0,2 ng cho cefadroxil và cephalexin; 0,1 ng cho cefotaxim và cefaclor trong thể tích tiêm mẫu là 20 µl Phương pháp này được áp dụng cho việc xác định các cephalosporin trong dược phẩm và trong dịch sinh học (huyết thanh, máu người) sau khi chiết pha rắn và nước tiểu sau khi lọc và pha loãng Độ thu hồi của chất phân tích trong khoảng 76,3-112,0 % [32]

H.-J.Brauch và F Sacher, (2008) đã sử dụng kỹ thuật LC/MS/MS để định lượng các kháng sinh cefaclor, cefadroxil, cefalexin, cefixime, ceftiofur, ceftriaxon, cefuroxime có trong nước bề mặt và nước uống Với Hệ thông HPLC: HP 1100 Agilent, cột Luna Phenomenex ( 250 × 2 mm, 5 µm), pha động là hệ: Acid formic 0,1 % và ACN : MeOH (2:1) : Acid formic 0,1 % được chạy gradient Nghiên cứu sử dụng kỹ thuật chiết pha rắn để xử lý mẫu vớt cột ENV+ Giới hạn định lượng của các kháng sinh trong nghiên cứu này là khoảng

20 ng/l [21]

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG TIỆN NGHIÊN CỨU

2.1.1 Hoá chất- chất chuẩn

Bảng 2.1 Các nguyên vật liệu cần có STT Nguyên vật liệu Tiêu chuẩn cần

1 Cefixim (HL 98,88), SKS 0105192

Chuẩn Quốc Gia Nguồn gốc: Viện kiểm nghiệm thuốc Trung Ương

- Cột Oasis HLB 30 µm (Mỹ)

- Bộ chiết pha rắn Restek (Mỹ)

- Thiết bị đuổi bằng khí N2: Gast-col Zipvap 12 (Mỹ)

- Tủ lạnh Hitachi – E25 (Nhật)

- Máy lắc siêu âm: ELMA -100H (Đức)

- Cân phân tích Shimadzu – Auw 220D

- Máy chuẩn độ đo điện thế Metrohm – 702 (Thụy Sĩ)

- Máy lọc chân không New Askir 20 (Ytalia)

- Các dụng cụ thủy tinh trong phân tích

2.1.3 Đối tượng nghiên cứu

- Mẫu trắng: Nước thải ở các cơ sở sản xuất dược có sản xuất kháng sinh nhóm

Cephalosporin không sản xuất các kháng sinh này ít nhất 7 ngày

- Mẫu thử: Nước thải ở các cơ sở sản xuất dược có sản xuất kháng sinh nhóm

Cephalosporin trong ngày sản xuất các kháng sinh

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.2.1 Phương pháp thu thập và xử lý mẫu

+ Phương pháp thu thập mẫu

Lấy nước thải từ nhà máy sản xuất kháng sinh trong giai đoạn nhà máy không sản xuất và trong ngày giai đoạn sản xuất kháng sinh, lọc, điều chỉnh đến pH thích hợp rồi đem đi xử lý mẫu

Để tìm được qui trình chiết pha rắn cho độ thu hồi cao chúng tôi tiến hành khảo sát:

- Qui trình hoạt hóa cột

- Qui trình rửa giải chất phân tích

2.2.3 Xây dựng phương pháp xác định hàm lượng cefixim, cefuroxim, cephalexin bằng kỹ thuật LC/MS/MS

Xây dựng quy trình phân tích:

Điều kiện về khối phổ:

+ Khảo sát điều kiện MS/MS: Khảo sát, lựa chọn điều kiện nguồn Ion hóa, điều kiện bắn phá ion mẹ để tạo ion con, lựa chọn ion con để định lượng

Điều kiện về sắc ký lỏng:

+ Khảo sát lựa chọn chuẩn nội: Đảm bảo phân tách tốt và thời gian phân tích

không quá dài, đáp ứng của chuẩn nội tốt Chúng tôi quyết định chọn chuẩn nội

để khảo sát là Terbutaline sulfat – là chất ít có trong các nhà máy sản xuất dược

phẩm

+ Lựa chọn pha động, cột sắc ký, nhiệt độ, thể tích tiêm mẫu, tốc độ dòng để có thể tách và phát hiện các chất kháng sinh Cefixim, Cephalexin, Cefuroxim ở nồng độ ppb, sắc đồ đẹp, thời gian phân tích không quá dài

2.2.4 Đánh giá phương pháp phân tích[22]

Xử lý các mẫu nghiên cứu theo các phương pháp đã xây dựng, tiến hành sắc

ký theo các điều kiện đã khảo sát sau đó đánh giá phương pháp phân tích dựa trên các chỉ tiêu:

¾ Tính thích hợp của hệ thống [22]

Tiến hành sắc ký 6 lần liên tiếp trong cùng điều kiện một dung dịch chứa chất chuẩn kháng sinh và chất chuẩn nội Đánh giá độ phù hợp của hệ thống thông qua các chỉ số sau đây:

- Giá trị RSD của thời gian lưu và diện tích píc của chất chuẩn nội và kháng sinh (nhỏ hơn 2%)

- Giá trị RSD của tỉ số diện tích píc của kháng sinh/chuẩn nội (nhỏ hơn

2%)

¾ Tính chọn lọc [22]

Độ đặc hiệu của được đánh giá thông qua phân tích các dung dịch chuẩn, mẫu trắng và mẫu tự tạo (mẫu trắng có thêm kháng sinh nghiên cứu) Tiến hành như sau:

- Pha một dung dịch chuẩn chứa các kháng sinh và chất chuẩn nội có nồng

độ đã biết

- Mẫu trắng (không chứa kháng sinh) xử lý theo qui trình đã xây dựng

- Mẫu tự tạo là mẫu trắng có thêm một lượng chính xác các kháng sinh có nồng độ đã biết

- Tiến hành xử lý và sắc ký các dung dịch chuẩn, mẫu trắng và mẫu tự tạo theo các điều kiện đã chọn Trên sắc kí đồ của mẫu trắng tại các thời điểm trùng với thời gian lưu của kháng sinh phải không xuất hiện các píc có các mảnh khối phổ tương ứng với số khối của chất phân tích trong mẫu chuẩn và chuẩn nội Nếu có đáp ứng phải nhỏ hơn 1% so với nồng độ giữa của khoảng tuyến tính

¾ Độ đúng và độ chính xác [22]

Độ đúng của phương pháp được tiến hành trên mẫu tự tạo (mẫu trắng có thêm một lượng chính xác kháng sinh và chất chuẩn nội có nồng độ đã biết) Lựa

trung bình (MQC) và nồng độ cao (HQC) Tiến hành xử lý mẫu và sắc kí theo các điều kiện đã chọn Độ lặp lại của phương pháp được đánh giá thông qua giá trị RSD thu được khi phân tích 6 mẫu tự tạo khác nhau của một nồng độ Tính lượng chuẩn thu hồi được theo phương trình hồi qui đã xây dựng và so sánh với lượng chuẩn thêm vào để đánh giá độ đúng của phương pháp.

¾ Độ tuyến tính [22]

Từ dung dịch chuẩn gốc của các chất kháng sinh nghiên cứu tiến hành pha một dãy ít nhất 5 dung dịch chuẩn làm việc có nồng độ đã xác định trong khoảng tuyến tính cần khảo sát Nồng độ chuẩn nội trong mỗi dung dịch chuẩn làm việc được giữ hằng định Tiến hành sắc kí theo các điều kiện đã chọn Xây dựng đồ thị biểu diễn mối quan hệ giữa tỉ lệ diện tích píc kháng sinh/chuẩn nội (SKS/Si) và

nồng độ kháng sinh Thiết lập phương trình hồi qui tuyến tính dạng y = ax + b

và hệ số tương quan r từ đó kết luận về độ tuyến tính của phương pháp

¾ Giới hạn phát hiện (LOD) [22]

Được tính dựa vào độ lệch chuẩn của đáp ứng và độ dốc của đường tuyến tính

LOD được tính theo công thức:

3,3×SLOD=

a

Trong đó: S là độ lệch chuẩn của đáp ứng và a là hệ số góc của đường chuẩn

− Từ kết quả đường chuẩn xác định độ tuyến tính, tính toán được giá trị LOD

¾ Giới hạn định lượng (LOQ) [22]

LOQ là một thông số quan trọng của phép định lượng các chất có nồng độ thấp trong mẫu LOQ được định nghĩa là nồng độ nhỏ nhất của chất phân tích trong mẫu thử để có thể định lượng được với độ đúng và độ chính xác thích hợp LOQ được tính theo giá trị LOD theo công thức:

LOQ = 3,3 × LOD

2.3 PHƯƠNG PHÁP XỬ LÝ SỐ LIỆU

- Số liệu được xử lý trên Microsoft Office Excel 2010

Một số công thức tính các giá trị thống kê:

¾ Khảo sát điều kiện nguồn ESI

Để khảo sát các điều kiện về khối phổ chúng tôi tiến hành cân chính xác khoảng

25 mg mỗi kháng sinh cefixim, cephalexin, cefuroxim và IS (Terbutaline sulfat),

hòa tan trong hệ dung môi MeOH : H2O (1:1) để được nồng độ khoảng 1 mg/ml,

pha loãng bằng MeOH : H2O (1:1) thu được nồng độ chính xác khoảng 100

ng/ml

Qua tham khảo một số tài liệu [23],[26],[27], và điều kiện thực nghiệm chúng tôi

quyết định chọn điều kiện nguồn ion hóa được trình bày ở bảng 3.1

Bảng 3.1 Điều kiện nguồn ion hóa ESI

DL temperature (nhiệt độ mao quản) 2500C

Nebulizing Gas flow (tốc độ khí phun) 25 l/min

Heat block temperature (nhiệt độ nguồn) 4000C

Drying Gas flow (tốc độ khí làm khô) 15 l/min

Interface vonltage (thế nguồn ion hóa) 5000 v

Trong kỹ thuật ion hóa phun điện tử với chế độ bắn phá ion dương, các ion mẹ

có dạng (MH)+ với số khối m = (M+1) theo phản ứng:

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

3.1 XÂY DỰNG QUY TRÌNH PHÂN TÍCH

3.1.1 Khảo sát điều kiện đo phổ khối

Mo + H+ → (MH)+

Tiến hành khảo sát bắn phá tạọ các ion mẹ, kết quả được trình bày ở bảng 3.2

Bảng 3.2: Kết quả lựa chọn ion mẹ

¾ Khảo sát điều kiện ion hóa lựa chọn ion con

Detector sử dụng trong nghiên cứu này là hê ̣khối phổ 2 lần, do đó để phát hiện đúng chất phân tích thì việc lựa chọn được ion con là rất quan trọng Ion con phải có tín hiệu gấp ít nhất 10 lần so với ion mẹ Để thu được mảnh ion con

có tín hiệu cao cần phải chọn được mức năng lượng bắn phá thích hợp Sử dụng chế độ bơm tự động để bơm từng chất phân tích vào detector khối phổ và lựa chọn ion con đặc trưng có cường độ tín hiệu cao nhất để định tính và định lượng Mảnh ion con m/z có cường độ lớn nhất dùng để định lượng, mảnh ion con thứ 2 có cường độ thấp hơn dùng để xác nhận chất phân tích Đối với các chất chuẩn nội, lựa chọn 1 ion con đặc trưng có cường độ cao nhất Kết quả thu được ở bảng 3.3

Chất phân tích Khối lượng phân tử Ion mẹ (m/z)

Cephalexin 347 348 Cefuroxim 441 442 Cefixim 453,1 454,1

Bảng 3.3: Năng lượng bắn phá và các ion con của các kháng sinh, IS

Chất phân

tích

Ion mẹ (m/z)

Ion con (m/z)

Q1 prebias(V)

CE (eV)

Q3 prebias(V)

IS 226,2 152,1 -10 -15 -19 Cephalexin 348 158,05 -17 -10 -20 Cefuroxim 442 336 -21 -10 -30 Cefixim 454,1 126,1 -21 -10 -26

Nhâṇ xét: Theo qui điṇh của Châu Âu 2002/657/EC [18], số điểm nhâṇ daṇg

(IP) đươc̣ tính đối với kỹ thuâṭ LC/MS/M, tương ứng với 1 ion me ̣và 2 ion con (Phụ lục 5), số điểm nhâṇ daṇg (IP) là 4

Như vậy phương pháp đã đáp ứng đươc̣ yêu cầu của Châu Âu 2002/657/EC [18],

và phù hợp với các nghiên cứu [23][26][27]

3.1.2 Khảo sát điều kiện LC

Để khảo sát điều kiện LC từ dung dịch chuẩn gốc 1 mg/ml pha hỗn hợp chứa đồng thời 3 kháng sinh và chuẩn nội có nồng độ chính xác khoảng 20 ng/ml

¾ Khảo sát chương trình pha động

Qua tham khảo tài liệu [15][21] [23], chúng tôi tiến hành khảo sát 2 chương trình pha động và tốc độ dòng với các điều kiện sắc ký khác như: cột Zorbax C18 (150 x 4,6 mm; 5 µm), thể tích tiêm mẫu 50 µl (nhiệt độ cột: 250C), tốc độ dòng 0,5 ml/phút; Chương trình pha động và tốc độ dòng khảo sát như sau:

Bảng 3.4 Chương trình Gradient pha động

Kênh A: H2O (0,1% acid Formic)

Kênh B: ACN (0,1% acid Formic)

(a) sắc ký đồ khi chạy gradient 1

Thời gian

(phút)

Gradient 1 Gradient 2 Gradient 3

Kênh A Kênh B Kênh A Kênh B Kênh A Kênh B

0- 0,5 98 2 95 5 85 15 0,5-7,5 0 100 0 100 0 100 7,5-10 0 100 0 100 0 100 10-14 98 2 95 5 85 15

(b) sắc ký đồ khi chạy gradient 2

(c) sắc ký đồ khi chạy gradient 3

Hình 3.1: Sắc ký đồ khảo sát chương trình pha dộng

Nhận xét:

- Với chương trình gradient 1 thì pic IS bị doãng không cân xứng

- Với chương trình gradient 2 và 3 thì IS và các kháng sinh đều cho đáp ứng tương đương nhau tuy nhiên chương trình gradient 2 thì các pic cân xứng hơn (hệ số Tailing factor gần giá trị 1 hơn)

Vì vậy chúng tôi quyết định chọn chương trình gradient 1 cho các khảo sát tiếp theo

¾ Khảo sát cột sắc ký

Tiến hành khảo sát trên 2 cột Zorbax C18 (4,6 x 150mm, 5µm) và cột Supelco C18 (12,5 cm × 4,6 mm, 5µm) với chương trình gradient pha động đã chọn như trên, kết quả thu được như sau:

Bảng 3.5 Kết quả khảo sát cột sắc ký

Chất phân

tích

Cột Zorbax C18 Cột Supelco C18 Diện tích

pic

Hệ số kéo đuôi

Diện tích pic

Hệ số kéo đuôi

IS 207801 1,233 325119 2,182 Cefuroxim 10500 1,327 13743 0,795 Cephalexin 57974 1,715 39432 1,087 Cefixim 17921 1.470 24372 1,315

 (a) Sắc ký đồ cột Zorbax C18

 

(b) Sắc ký đồ cột Supleco

Hình 3.2 Kết quả sắc ký đồ khảo sát cột sắc ký