Tại Việt Nam, mới chỉ có một số ít nghiên cứu về vấn đề dư lượng kháng sinh trong môi trường. Như nghiên cứu về xác định các kháng sinh nhóm Quinolon trong nước thải bệnh viện [2], một số nghiên cứu sử dụng kỹ
sinh nitrofuran, nhóm sulfonamides trong các loại thực phẩm tươi hay dư lượng của Cloramphenicol trong thủy sản. [8],[11].
Một số nghiên cứu quốc tế có sự tham gia của Việt Nam cũng cho thấy mức độ ô nhiễm dư lượng kháng sinh tại Việt Nam cao hơn so với các nước khác trên thế giới [33],[34]. Các nghiên cứu này đều có chung khuyến nghị là cần tiếp tục có các nghiên cứu khác một cách có hệ thống để đánh giá toàn diện tình hình ô nhiễm dư lượng kháng sinh ở Việt Nam.
Tuy nhiên, nghiên cứu về dư lượng kháng sinh trong nước thải nhà máy công nghiệp dược tại Việt Nam chưa được quan tâm một cách đúng mức trong khi số lượng nhà máy dược phẩm sản xuất kháng sinh là rất lớn. Gần đây nhất chỉ có nghiên cứu xác định dư lượng Cefixim trong nhà máy nước thải dược phẩm bằng phương pháp HPLC, nồng độ kháng sinh xác định được là từ 19,24 - 43,33 ppb [20].
Như vậy tình hình kháng kháng sinh trên thế giới nói chung và ở Việt Nam nói riêng đã và đang để lại những hậu quả nghiêm trọng về sức khỏe, tính mạng con người cũng như chi phí điều trị. Ngoài nguyên nhân do việc sử dụng thuốc không hợp lý thì một nguyên nhân khác đang rất được quan tâm đấy là do dư lượng của kháng sinh có trong môi trường như trong thực phẩm tươi sống hay từ các nguồn nước. Bởi lẽ chỉ cần một lượng nhỏ các loại kháng sinh khác nhau tồn dư trong thực phẩm cũng như nước thải thì vi khuẩn có thể hình thành nên các gen kháng thuốc gây ra những hậu quả nghiêm trọng cho cộng đồng. Hơn thế nữa khi mà những dư lượng kháng sinh trong môi trường được tích lũy trong cơ thể chúng ta thì chúng có thể gây ra những hậu quả mà chúng ta cũng chưa thểđoán trước.
Trong đó ký hiệu: (-): Âm tính (+): Dương tính
SKS/SIS : Tỷ lệ diện tích pic kháng sinh và chuẩn nội
Hình 3.9: Sắc ký đồ mẫu thử M2
Nhận xét: Như vậy qua phân tích mẫu nước thải của nhà máy sản xuất dược phẩm thứ nhất thì không phát hiện được có kháng sinh trong nước thải Đối với mẫu thử thứ 2 thì thu được nồng độ Cefuroxim rất thấp (<1 ng/ml) nó thấp hơn LOD và LOQ của phương pháp điều đó chứng tỏ được vai trò của kỹ thuật chiết pha rắn là rất quan trọng trong việc làm giàu mẫu trước khi phân tích.
của chúng đến tình trạng kháng kháng sinh của vi sinh vật nhằm hỗ trợ các nhà hoạch định chính sách trong việc đưa ra các giải pháp, các qui định cho vấn đề môi trường này.
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
KẾT LUẬN
Qua quá trình thực hiện đề tài, chúng tôi thu được các kết luận như sau: Xây dựng quy trình định lượng đồng thời 4 kháng sinh: cefuroxim,
cephalexin, cefixim, cefaclor trong nước thải ở các cở sở sản xuất dược:
- Đã khảo sát được qui trình xử lý mẫu cụ thể như sau: Hoạt hóa cột bằng 5 ml MeOH và 5 ml dung dịch acid formic 0,1%, rửa giải cột bằng 5 ml MeOH và 5 ml ACN : H2O : Triethylamin (90 :10 : 0,5). Qui trình xử lý này có hiệu suất cao (độ thu hồi từ 40 – 80%) và ổn định (RSD < 8%).
- Đã khảo sát các điều kiện về khối phổ: Lựa chọn ion mẹ, năng lượng bắn phá ion mẹ để thu được ion con, lựa chọn được các ion con phù hợp cho quá trình phân tích định lượng phù hợp với tiêu chuẩn Châu Âu 2002/657/EC.
- Đã khảo sát lựa chọn các điều kiện về sắc ký lỏng khác như: lựa chọn cột Zorbax C18 (150 x 4,6 mm; 5 µm), thể tích tiêm mẫu 50 µl, tốc độ dòng 0,5 ml/phút, chương trình gradient pha động để có thể định lượng được đồng thời 3 kháng sinh trong nước thải công nghiệp dược ở nồng độ ppb.
Thẩm định quy trình trình định lượng các kháng sinh trong nước thải
ở các cở sở sản xuất dược:
- Đã thẩm định được phương pháp có tính chọn lọc cao: có thể phân tích đồng thời cefuroxim, cephalexin, cefixim trong hỗn hợp nhiều cephalosporin khác.
- Đã xây dựng được khoảng tuyến tính rộng từ khoảng 1 ng/ml – 70 ng/ml với hệ số tương quan rất chặt chẽ r > 0,99.
- Phương pháp có độ lặp lại cao RSD < 8% với n = 6 (Theo AOAC nồng độ từ 10 – 100 ng/ml: RSD ≤ 21%) .
- Độ nhạy cao với giá trị LOD và LOQ thấp (LOD từ 0,58 ng/ml- 1,22 ng/ml), giá trị này sẽ thấp hơn nhiều khi mẫu được làm giàu bởi kỹ thuật chiết pha rắn, chứng tỏ phương pháp này rất khả thi để ứng dụng phát hiện dư lượng kháng sinh trong môi trường.
- Độ thu hồi của các kháng sinh nằm trong khoảng 40 – 80% (RSD < 8%) đạt qui định > 30%.
Áp dụng trên mẫu thực:
Đã áp dụng quy trình xây dựng được vào phân tích mẫu nước thải của Công ty dược phẩm vào ngày có sản xuất kháng sinh. Kết quả cho thấy quy trình xây dựng được đã xác định được dư lượng cefuroxim trong nước thải nhà máy công nghiệp dược.
Đối với mẫu nước thải nghi là có cephalexin và cefixim thì qui trình phân tích cho kết quả âm tính. Điều này có thể là do qui trình xử lý nước thải của nhà máy là tốt hoặc có thể là do ngày lẫy mẫu không phù hợp.
KIẾN NGHỊ
- Tiếp tục nghiên cứu triển khai quy trình trên để xác định đồng thời nhiều kháng sinh ở nhà máy công nghiệp dược cũng như các nguồn nước có nguy cơ chứa kháng sinh cao như nước thải bệnh viện, nước trong nuôi trồng thủy sản.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
Tiếng Việt
1. Trần Tử An (2011), Kiểm nghiệm dược phẩm, Nhà xuất bản y học, Tr 84- 110.
2. Dương Hồng Anh (2006), Phân tích đánh giá sự có mặt của các kháng
sinh họ floquinilon trong nước thải bệnh viện, Đề tài nghiên cứu khoa học
của Trường Đại Học Quốc Gia Hà Nội.
3. Bộ y tế (2009), Dược điển Việt Nam IV, nhà xuất bản Y học. 4. Bộ y tế (2009), Dược thư quốc gia Việt Nam, nhà xuất bản Y học.
5. Bộ Y tế - GARP-Việt Nam - Oxford University Clinical Research Unit, Báo
cáo sử dụng kháng sinh và kháng kháng sinh tại 15 bệnh viện Việt Nam
năm 2008-2009, tr. 12-17
6. Lê Thị Hồng Hảo, Phạm Xuân Đà (2013), Xử lý mẫu trong phân tích thực phẩm, nhà xuất bản khoa học và kỹ thuật.
7. Trần Đức Hậu (2007), Hóa dược tập 2, nhà xuất bản Y học, tr 118-133. 8. Trần Thị Hồng,(2012) “Xác định đồng thời dư lượng kháng sinh nhóm
nitrofuran trong một số loại thực phẩm tươi sống trên địa bàn Hà Nội bằng phương pháp sắc ký lỏng khối phổ LC/MS/MS”,Trường Đại học Khoa học Tự nhiên Luận văn ThS. ngành Hóa phân tích
9. Nguyễn Văn Kính và nhóm nghiên cứu quốc gia GARP-Việt Nam (2010),
Phân tích thực trạng: Sử dụng kháng sinhvà khángkháng sinh ở Việt
Nam, Global Antibiotic Resistance Partnership, tr. 17-33
10.Phạm Luận (2004), Một số vấn đề cơ sở của sự chiết trong phân tích, trường đại học Quốc gia Hà Nội
11.Vũ thị Trang (2012), “Phương pháp sắc ký lỏng khối phổ xác định dư
lượng một số kháng sinh nhóm sulfonamides trong thịt gia súc gia cầm”, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên Luận văn ThS. ngành Hóa phân tích 12.Mai Tất Tố, Vũ Thị Trâm (2007), Dược lí học tập 2, NXB Y học, tr 149-
153.
13.Nguyễn Đình Triệu (2005), các phương pháp phân tích vật lý và hóa lý, nhà xuất bản khoa học và kỹ thuật, tr.41-60.
Tiếng Anh
14.British pharmacopoeia 2010
15.Cha J.M Yang S, Carlson K.H (2005), "Trace determination of-lactam antibiotics in surface water and urban wastewater using liquid
chromatography combined with electrospray tandem mass spectrometry", Journal of Chromatography A, (1115), pp. 46-57
16.Chuanwu Xi1,Yongli Zhang1,Carl F. Marrs, Wen Ye, Carl Simon, Betsy Foxman, Jerome Nriagu (2009), Prevalence of Antibiotic Resistance in Drinking Water Treatment and Distribution Systems, Applied and Environmental Microbiology, p 5714-5718.
17.European Centre for Disease Prevention and Control director’s presentation (2012), EU action on Antimicrobial Resistance – European Antibiotic Awareness Day, EU Health Prize for Journalists 2011, 31 January 2012, Brussels
18.European Union (2002) Commission Decision 2002/657/EC, Official Journal of the European Communities, L 221/14
chromatography. Antimicrob Agents Chemother. Volume 21(4), p 628- 633.
20.Hue, T.T.T., Son, D.C, Anh, N.T.L, Anh, N. T. K., Phong, T. K., and Hiramatsu K. (2014), A Simple and Rapid Method to Measure Residue Of Cefixime - a Cephalosporin Antibiotic in the Wastewater of
Pharmaceutical Production Plant. Journal of the Faculty of Agriculture,
Кyushu University, 59(1),169-175
21.H.-J. Brauch and F. Sacher, (2008) “Determination of Cephalosporin Antibiotics by Solid-phase Extraction followed by Liquid Chromatography and Tandem Mass Spectrometry “, Volume I, pp.151 – 167
22.International Conference on Harmonisation of Technical Requirements for Registration of Pharmaceuticals for Human Use (2005),Validation of
anatical Procedures: Text and Methodology Q2(R1), ICH Harmonised
Tripartite Guideline
23.Karageorgou E Myridakis A, Stephanou EG, Samanidou V (2013), "Multiresidue LC–MS/MS analysis of cephalosporins and quinolones in milk following ultrasound-assisted matrix solid-phase dispersive extraction combined with the quick, easy, cheap, effective, rugged, and safe methodology", Journal of Separation Science, (36), pp. 2020-2027. 24.Kumarasamy KK, Toleman MA, Walsh TR et al, (2010), Emergence of a
new antibiotic resistance mechanism in India, Pakistan, and the UK: a
molecular, biological, and epidemiological study. Lancet. Infect.
Dis, 10 (9), pp. 597–602
25.Kyungwon Lee, (2010), “Increase of ceftazidime- and fluoroquinolone- resistant Klebsiella pneumoniae and imipenem-resistant Acinetobacter
spp. in Korea: analysis of KONSAR study data from 2005 and 2007”, Yonsei Med J, 51(6), pp 901 – 911
26. Lei Tong a, Ping Li a, Yanxin Wang , Kuanzheng Zhu b, (2009),“Analysis of veterinary antibiotic residues in swine wastewater and environmental water samples using optimized SPE-LC/MS/MS”, Chemosphere 74, pp. 1090–1097
27.Lindberga, R., Jarnheimer, P., Olsen, B., Johansson, M., and Tysklind M. (2004), Determination of antibiotic substances in hospital sewage water using solid phase extraction and liquid chromatography/mass
spectrometry and group analogue internal standards, Chemosphere 57
1479–1488
28.McQuillan D., et al (2002), Drug Residue in Ambient Water: Initial
Surveillance in New Mexico, USA, 7th Annual New Mexico Environmental
Health Conference
29.Mitra S. (2003), Sample Preparation Techniques in Analytical chemistry, John Wiley & Sons, USA
30.NNIS report (2004), National Nosocomial Infections Surveillance System
Report, data summary from January 1992 through June 2004. Am. J.
Infect. Control, 32, 470-485
31.Robert E.ardray (2003), Liquid Chromatography – mass spectrometry An introduction, University of fluddersfield.
32.Samanidou VF, Hapeshi EA, Papadoyannis IN (2003), Rapid and sensitive high-performance liquid chromatographic determination of four
cephalosporin antibiotics in pharmaceuticals and body fluids, J
33.Satoru Suzuki, Phan Thi Phuong Hoa,(2012),“Distribution of quinolones, sulfonamides, tetracyclines in aquatic environment and antibiotic resistance in indochina”, Front. Microbiol , 3(67), pp.1-8
34.Satoshimanagaki, Ayakomurata, Hideshigetakada, Bui cach tuyen, Nguyen H.Chiem, (2007),”Distribution of Macrolides, Sulfonamides, and Trimethoprim in Tropical Waters: Ubiquitous Occurrence of Veterinary Antibiotics in the Mekong Delta”, Environ. Sci. Technol, 41,pp. 8004– 8010
35.Vishal et al (2010), Antibiotics and antibiotic- resistant bacteria in water
associated with a hospital in Ujjain India, BMC Public Heath, 10: 414,
36.Vishal et al. (2012), Identification of extended- spectrum β- lactamase and quinolone resistance genes in Escherichia coli isolated from hospital
wastewater from central India, J Antimicrob Chemother; 67: 857 – 859
37.Xiao-Lin Houa, Yin-Liang Wub, Yan Lvb, Xiu-Qin Xub, Jian Zhaob, Ting Yangb, (2013) , “Development and validation of an ultra high performance liquid chromatography tandem mass spectrometry method for determination of 10 cephalosporins and desacetylcefapirin in milk”, Journal of Chromatography B, 931 6– 11
38.WHO (2014), Antimicrobial resistance: global report on surveillance 2014 (http://www.who.int/drugresistance/documents/surveillancereport/en/)
BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI
BẢN TÓM TẮT LUẬN VĂN
Họ và tên học viên: Nguyễn Văn Thuận Khóa 17
Chuyên ngành: Kiểm Nghiệm Thuốc Và Độc Chất Mã số: 60720410 Tên đề tài: Nghiên cứu xác định dư lượng một số cephalosporin trong nước thải nhà máy dược phẩm bằng phương pháp LC/MS-MS
Tên cơ sởđào tạo: Trường Đại học Dược Hà Nội
1. Mục đích và đối tượng nghiên cứu
1.1 Mục đích:
1.Khảo sát và lựa chọn điều kiện phân tích và qui trình xử lý mẫu để xác định dư lượng các kháng sinh Cephalexin, Cefuroxim, Cefixim trong nước thải từ cơ sở sản xuất Dược bằng kỹ thuật LC/MS-MS ở nồng độ ppb.
2. Thẩm định phương pháp phân tích dư lượng các kháng sinh trên và bước đầu ứng dụng phương pháp để đánh giá dư lượng kháng sinh trong nước thải của nhà máy sản xuất dược phẩm
2.Phương pháp nghiên cứu đã sử dụng:
Phương pháp LC/MS-MS kết hợp với kỹ thuật chiết pha rắn để làm giàu mẫu 3.Kết quả chính và kết luận
3.1 Kết quả chính
- Đã xây dựng được qui trình xử lý mẫu bằng kỹ thuật chiết pha rắn với cột Oasis cho hiệu suất tốt từ 40 – 80% với độ lăp lại cao (RSD < 8%).
- Đã khảo sát ,lựa chọn các ion mẹ, năng lượng bắn phá ion con và các ion con đạt tiêu chuẩn về IP 4 điểm của Châu Âu 2002/657/EC
- Khảo sát được các điều kiện về LC như: Cột Zobrax C18(150 mm x 4,6 mm; 5 µm)
- Chương trình gradient pha động, thể tích tiêm mẫu 50 µl, tốc độ dòng là 0,5 ml/phút
- Đã thẩm định được phương pháp LC/MS-MS với độ chính xác cao:
+ Độ thích hợp của hệ thống: độ thích hợp về hệ thống giữa tỷ lệ về diện tích pic kháng sinh và chuẩn nội cho độ lặp lại cao với RSD < 5%
+ Độ tuyến tính: phương pháp có sự phụ thuộc tuyến tính chặt chẽ giữa tỷ lệ diện tích pic kháng sinh và chuẩn nội trong khoảng nồng độ khảo sát từ 1 – 70 ng/ml với r > 0,99.
+Độ đặc hiệu: kết quả thẩm định độ đặc hiệu cho thấy trên sắc ký đồ mẫu trắng không thấy sự xuất hiện pic của kháng sinh và chuẩn nội, ngoài ra phương pháp còn cho thấy có thể phân tích được đồng thời 3 kháng sinh trên
+ Độ đúng và độ chính xác: Phương pháp cho độ đúng tốt với hiệu suất chiết 40 – 80% và độ chính xác cao RSD < 8%
+ Giá trị LOD và LOQ của mẫu tiêm thấp: LOD từ 0,58 – 0,77 ng/ml, LOQ từ 1,75 – 2,30 ng/ml, giá trị này còn thấp hơn nhiều khi được kết hợp với qui trình làm giàu mẫu bằng chiết pha rắn
- Đã ứng dụng thành công phương pháp nghiên cứu để kiểm tra dư lượng kháng sinh tại nhà máy công nghiệp dược
3.2 Kết luận:
Kỹ thuật xử lý mẫu bằng chiết pha rắn kết hợp với sắc ký lỏng khối phổ 2 lần cho phép đánh giá dư lượng kháng sinh ở nồng độ ppb phù hợp với mục tiêu của đề tài và có ý nghĩa quan trọng trong việc đánh giá sự ô nhiễm môi trường tại các nguồn nước của nhà máy công nghiệp dược.
Hà Nội 5/10/2014 Học Viên Nguyễn Văn Thuận
PHỤ LỤC 1
PHỤ LỤC 2
PHỤ LỤC 3
SẮC KÝ ĐỒ KHẢO SÁT ĐỘ ĐÚNG ĐỘ CHÍNH XÁC CỦA PHƯƠNG PHÁP
PHỤ LỤC 4
PHỤ LỤC 5