Nghiên cứu xác định dư lượng một số kháng sinh trong nước thải nhà máy dược phẩm bằng phương pháp sắc ký lỏng khối phổ

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI TRẦN THỊ LINH ANH NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH DƯ LƯỢNG MỘT SỐ KHÁNG SINH TRONG NƯỚC THẢI NHÀ MÁY DƯỢC PHẨM BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ L

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

TRẦN THỊ LINH ANH

NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH DƯ LƯỢNG

MỘT SỐ KHÁNG SINH TRONG NƯỚC THẢI NHÀ MÁY DƯỢC PHẨM BẰNG PHƯƠNG PHÁP

SẮC KÝ LỎNG KHỐI PHỔ

LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

TRẦN THỊ LINH ANH

NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH DƯ LƯỢNG

MỘT SỐ KHÁNG SINH TRONG NƯỚC THẢI NHÀ MÁY DƯỢC PHẨM BẰNG PHƯƠNG PHÁP

SẮC KÝ LỎNG KHỐI PHỔ

LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC

CHUYÊN NGÀNH: KIỂM NGHIỆM THUỐC – ĐỘC CHẤT

MÃ SỐ: 60720410

Người hướng dẫn khoa học:

PGS.TS Nguyễn Thị Kiều Anh

LỜI CẢM ƠN

Lời đầu tiên, tôi xin bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc đến PGS.TS Nguyễn Thị Kiều Anh đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu

Tôi xin trân trọng cảm ơn NCS.Lê Xuân Kỳ đã tận tình hướng dẫn và tạo điều kiện cho tôi trong suốt quá trình nghiên cứu đề tài

Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến các thầy cô giáo, các anh chị kỹ thuật viên bộ môn Hóa phân tích-Độc chất đã nhiệt tình giúp đỡ và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt thời gian làm thực nghiệm tại bộ môn

Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn các thầy cô trong Ban Giám hiệu, phòng Đào tạo sau đại học cùng toàn thể các thầy cô các bộ môn trường Đại học Dược Hà Nội đã tận tình dạy dỗ và giúp đỡ tôi trong suốt thời gian học tập tại trường

Cuối cùng, tôi xin chân thành cảm ơn gia đình và bạn bè đã động viên, quan tâm và tạo điều kiện giúp đỡ hoàn thành luận văn này

Hà Nội, tháng 3 năm 2016

Trần Thị Linh Anh

MỤC LỤC

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

DANH MỤC CÁC BẢNG

DANH MỤC CÁC HÌNH

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG I TỔNG QUAN 3

1.1 Tổng quan về đối tượng nghiên cứu 3

1.1.1 Tổng quan về Clarithromycin và Azithromycin 3

1.1.2 Tổng quan về Sulfamethoxazol và Trimethoprim 5

1.1.3 Một số nghiên cứu xác định dư lượng kháng sinh Clarithromycin, Azithromycin, Sulfamethoxazol và Trimethoprim trong nước thải 7

1.2 Tổng quan về phương pháp dùng trong nghiên cứu 11

1.2.1 Sắc ký lỏng hiệu năng cao 11

1.2.2 Phương pháp chiết pha rắn 15

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18

2.1 Đối tượng và phương tiện nghiên cứu 18

2.1.1 Hoá chất - chất chuẩn 18

2.1.2 Máy móc - trang thiết bị 18

2.1.3 Đối tượng nghiên cứu 19

2.2 Phương pháp nghiên cứu 19

2.2.1 Thu thập và xử lý mẫu sơ bộ 19

2.2.2 Xử lý mẫu 19

2.2.3 Xây dựng phương pháp định lượng bằng LC-MS/MS 20

2.2.4 Thẩm định quy trình phân tích đã xây dựng 20

2.2.5 Lấy mẫu, phân tích một số kháng sinh trong thực tế 21

2.3 Phương pháp xử lý số liệu 21

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 22

3.1 Xây dựng phương pháp phân tích 22

3.1.2 Khảo sát và lựa chọn điều kiện xử lý mẫu 33

3.2 Thẩm định quy trình phân tích 38

3.2.1 Độ phù hợp của hệ thống 38

3.2.2 Độ đặc hiệu 39

3.2.3 Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng 40

3.2.4 Độ tuyến tính và khoảng xác định 41

3.2.5 Độ đúng và độ lặp lại 43

3.3 Ứng dụng quy trình phân tích 45

CHƯƠNG 4 BÀN LUẬN 49

4.1 Về xử lý mẫu 49

4.2 Về phương pháp phân tích 50

4.3 Về thẩm định phương pháp 51

4.4 Về ứng dụng phương pháp 52

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 55

TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

AOAC : Hiệp hội các nhà hóa phân tích chính thống (Association

of Official Analytical Chemists)

LC – MS : Sắc ký lỏng khối phổ (Liquid chromatography – mass spectrometry)

LOD : Giới hạn phát hiện (Limit of Detection)

LOQ : Giới hạn định lượng (Limit of Quantitation)

MeCN : acetonitril

PA : Tinh khiết phân tích (Pure analysis)

RSD : Độ lệch chuẩn tương đối (Relative standard deviation)

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1 Cấu trúc vòng lacton các phân nhóm Macrolid 3

Bảng 1.2 Một số nghiên cứu xác định hàm lượng kháng sinh nghiên cứu trong nước thải trên thế giới 7

Bảng 2.3 Các nguyên vật liệu dùng trong nghiên cứu 18

Bảng 3.4 Các thông số hoạt động của nguồn ion hóa 24

Bảng 3.5 Các điều kiện khối phổ để phân tích các kháng sinh nghiên cứu 24

Bảng 3.6 Điều kiện khảo sát pha động 27

Bảng 3.7 Hiệu suất chiết các kháng sinh khi rửa giải với các thể tích khác nhau (n=2) 34

Bảng 3.8 Hiệu suất chiết các kháng sinh ở 2 thể tích mẫu chiết 100ml và 200ml 35

Bảng 3.9 Quy trình phân tích các kháng sinh nghiên cứu 36

Bảng 3.10 Kết quá đánh giá độ phù hợp của hệ thống LC-MS/MS 38

Bảng 3.11 LOD và LOQ của các kháng sinh (Tính trên mẫu ban đầu) 41

Bảng 3.12 Kết quả xây dựng đường chuẩn các kháng sinh nghiên cứu 42

Bảng 3.13 Kết quả khảo sát độ đúng và độ lặp lại của phương pháp 44

Bảng 3.14 Kết quả nồng độ kháng sinh trong các mẫu thử (nồng độ ng/ml) 46

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1 Sơ đồ hệ thống LC-MS/MS 12

Hình 1.2 Sơ đồ tạo ion dương bằng nguồn ESI 13

Hình 3.3 Phổ đồ của 4 kháng sinh và IS 23

Hình 3.4 Sắc ký đồ phân tích các kháng sinh khảo sát cột sắc ký 26

Hình 3.5 Sắc ký đồ phân tích các kháng sinh khảo sát thành phần pha động 28

Hình 3.6 Sắc ký đồ phân tích các kháng sinh khảo sát tốc độ dòng pha động 30

Hình 3.7 Sắc ký đồ phân tích các kháng sinh khảo sát thể tích tiêm mẫu 32

Hình 3.8 Biểu đồ hiệu suất chiết các kháng sinh khảo sát thể tích dung môi rửa giải 34

Hình 3.9 Sắc ký đồ phân tích các kháng sinh khảo sát độ đặc hiệu của phương pháp 40

Hình 3.10 Sắc ký đồ của các kháng sinh phân tích ở nồng độ LOQ 41

Hình 3.11 Sắc ký đồ các kháng sinh một số mẫu nước thải 48

ĐẶT VẤN ĐỀ

Hiện nay, vấn đề về thực trạng kháng kháng sinh đã mang tính toàn cầu

và đặc biệt nổi trội ở các nước đang phát triển với gánh nặng của các bệnh nhiễm khuẩn và những chi phí bắt buộc cho việc thay thế các kháng sinh cũ bằng các kháng sinh mới, đắt tiền Các bệnh nhiễm khuẩn đường tiêu hoá, đường hô hấp, các bệnh lây truyền qua đường tình dục và nhiễm khuẩn bệnh viện là các nguyên nhân hàng đầu có tỉ lệ mắc và tỉ lệ tử vong cao ở các nước đang phát triển [10] Việc kiểm soát các loại bệnh này đã và đang chịu sự tác động bất lợi của sự phát triển và lan truyền tình trạng kháng kháng sinh của vi khuẩn Bên cạnh tình trạng sử dụng thuốc tràn lan và bất hợp lý, thì việc tích lũy kháng sinh trong môi trường tự nhiên, tích tụ dần trong thức ăn của con người từ đó xâm nhập vào cơ thể con người cũng sẽ dẫn đến gia tăng tình trạng kháng kháng sinh Nhiều nghiên cứu đã cho thấy rằng sự tồn tại của các kháng sinh và sự đề kháng kháng sinh trong môi trường nước đã trở nên phổ biến [16,17]

Hầu hết các kháng sinh được sử dụng ở người và thải ra môi trường dưới nhiều hình thức khác nhau như bài tiết, tồn dư kháng sinh trong các dụng

cụ, bông, băng y tế… điều này đã góp phần vào sự tồn dư trong nước thải Trong đó hiện nay, các kháng sinh như Clarithromycin, Azithromycin, Trimethoprim, Sulfamethoxazol cũng đang được sản xuất và sử dụng rộng rãi Theo thống kê từ năm 2010 đến tháng 12 năm 2015 của Cục Quản lý Dược, Clarithromycin có 95 số đăng ký, Azithromycin có 53 số đăng ký, Sulfamethoxazol và Trimethoprim có 79 số đăng ký trong nước, chiếm tỷ lệ tương đối so với kháng sinh các nhóm khác Các nhà máy sản xuất các kháng sinh này đều đạt tiêu chuẩn GMP và có quy trình, hệ thống xử lý nước thải sau sản xuất Tuy nhiên, việc kiểm soát sự tồn dư kháng sinh trong nước thải

quan nhà nước về giới hạn nồng độ của các kháng sinh trong nước thải của các nhà máy sản xuất Bên cạnh đó, các kháng sinh này khá bền, khó phân hủy nên sự tồn dư, có mặt lâu dài trong môi trường nước sẽ ảnh hưởng đện hệ

vi sinh vật gây ra tình trạng kháng kháng sinh Tới thời điểm hiện nay, ở Việt Nam chủ yếu các nghiên cứu dư lượng kháng sinh Clarithromycin, Azithromycin, Sulfamethoxazol và Trimethoprim đều trong trong nước sông, nước thải chăn nuôi, còn với nước thải y tế thì mới có một số nghiên cứu

bước đầu Xuất phát từ những yêu cầu trên, chúng tôi tiến hành đề tài “Nghiên

cứu xác định dư lượng một số kháng sinh trong nước thải nhà máy dược phẩm bằng phương pháp sắc ký lỏng khối phổ”, với mục tiêu là:

1 Xây dựng phương pháp xác định đồng thời dư lượng các kháng sinh Clarithromycin, Azithromycin, Sulfamethoxazol và Trimethoprim trong nước thải nhà máy dược phẩm bằng LC-MS/MS ở nồng độ ppb

2 Thẩm định phương pháp phân tích dư lượng các kháng sinh trên và bước đầu ứng dụng phương pháp để đánh giá dư lượng kháng sinh trong nước thải nhà máy dược phẩm

CHƯƠNG I TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan về đối tượng nghiên cứu

1.1.1 Tổng quan về Clarithromycin và Azithromycin

1.1.1.1 Nguồn gốc

Clarithromycin và Azithromycin là các kháng sinh thuộc nhóm Macrolid Năm 1950, macrolid đầu tiên được phân lập là picromycin, sau đó là erythromycin năm 1952 Erythormycin là kháng sinh đầu tiên thuộc nhóm macrolid được dùng rộng rãi nhất Những năm 1960, các nghiên cứu cấu trúc của một số kháng sinh macrolid được thực hiện và dạng tổng hợp đầu tiên của kháng sinh nhóm Macrolid là methymycin được đưa ra bởi Masamune năm

1975 Các dạng bán tổng hợp và tổng hợp toàn phần có nhiều ưu điểm hơn erythromycin (bền vững với môi trường acid, ít tác dụng không mong muốn,

ít tương tác thuốc hơn) Các macrolid tự nhiên được điều chế chủ yếu từ môi

trường nuôi cấy vi khuẩn Streptomyces Còn các kháng sinh bán tổng hợp

(trong đó có Clarithromcyin và Azirhromycin) được các nhà bào chế lấy từ Macrolid tự nhiên rồi thay đổi một số nhóm thế nhằm khắc phục các nhược điểm của Macrolid gốc [28]

1.1.1.2 Phân loại và cấu trúc

Kháng sinh nhóm Macrolid có cấu trúc hóa học cơ bản là vòng lacton (chứa từ 12-17 nguyên tử carbon - còn gọi là vòng ester) có chứa 1 hay nhiều đường (deoxy sugar) (thường là cladinose và desosamin) Dựa trên số nguyên

tử carbon trên vòng, Macrolid được chia làm nhóm vòng lacton 14C, 15C, 16C

Bảng 1.1 Cấu trúc vòng lacton các phân nhóm Macrolid

Vòng lacton 14C

(erythromycin, roxithromycin,

clarithromycin)

Vòng lacton 15C (azithromycin)

Vòng lacton 16C (midecamycin, spiramycin,

josamycin)

Ngoài ra, người ta còn phân lo

III, trong đó Clarithromycin và Azithromycin đư

trực khuẩn Gram âm đư

i ta còn phân loại Macrolid thành các nhóm th, trong đó Clarithromycin và Azithromycin được xếp vào nhóm th

Clarithromycin (CLA)

69NO13 747,953

t lý: Không tan trong nước, tan trong aceton và methylen

clorid, khó tan trong methanol [4]

(AZI)

N2O12

t lý: Không tan trong nước, dễ tan trong dung môi h

như: ethanol, methanol, aceton, cloroform, diethyl ether và dung d

ng

Clarithromycin và Azithromycin có phổ tác dụng chung c

Macrolid có phổ kháng khuẩn hẹp, chủ yếu tập trung vào m

n Gram dương và một số vi khuẩn không điển hình

ạt tính trên cầu khuẩn Gram dương (liên c

dương (Clostridium perfringens, Corynebacterium diphtheriae,

Listeria monocytogenes) Thuốc không có tác dụng trên ph

n Gram âm đường ruột và chỉ có tác dụng yếu trên m

acrolid thành các nhóm thế hệ I, II,

p vào nhóm thế hệ II

c, tan trong aceton và methylen

tan trong dung môi hữu cơ như: ethanol, methanol, aceton, cloroform, diethyl ether và dung dịch HCl

ng chung của nhóm

p trung vào một số

n hình

n Gram dương (liên cầu, tụ cầu), trực

Clostridium perfringens, Corynebacterium diphtheriae,

ng trên phần lớn các chủng

u trên một số chủng vi

khuẩn Gram âm khác như

tác dụng khá tốt trên các ch

tác dụng tốt trên các vi khu

pneumoniae, Legionella pneumophila, C trachomatis, Mycobacteria

gồm M scrofulaceum, M kansasii, M avium

khuẩn ưa khí gram âm và dương bao g

Legionella pneumophilia, Neisseria gonorrhoeae, Neisseria menigitidis, E

n Gram âm khác như H influenzae và N meningitidis

t trên các chủng N gonorrhoeae Kháng sinh nhó

t trên các vi khuẩn nội bào như Campylobacter jejuni, M

pneumoniae, Legionella pneumophila, C trachomatis, Mycobacteria

M scrofulaceum, M kansasii, M avium-intracellulare

M fortuitum) Một số chủng liên cầu huyết tán beta nhóm A và

i macrolid [5]

tác dụng

Clarithromycin và Azithromycin có cùng cơ chế tác d

ng kìm khuẩn do ức chế tổng hợp protein c

u phân 50S của ribosom, ngăn cản sự chuy

p nhận sang vị trí cho nên các aminoacyl

p nhận, làm cho các aminoacid không g

t lý: SMX không tan trong nước, dễ tan trong aceton, hơi

tan trong ethanol 96%, tan trong dung dịch natri hydroxyd loãng và dung

SMX có phổ kháng khuẩn rộng, tác d

n ưa khí gram âm và dương bao gồm: Staphylococcus, Streptococcus,

Legionella pneumophilia, Neisseria gonorrhoeae, Neisseria menigitidis, E

N meningitidis, tuy nhiên lại có

Kháng sinh nhóm macrolid

Campylobacter jejuni, M pneumoniae, Legionella pneumophila, C trachomatis, Mycobacteria (bao

intracellulare – nhưng không

t tán beta nhóm A và

tác dụng của nhóm

p protein của tế bào vi chuyển vị peptidyl-trí cho nên các aminoacyl-ARNt mới không

oacid không gắn được vào chuỗi

tan trong aceton, hơi

ch natri hydroxyd loãng và dung dịch

ng, tác dụng lên nhiều vi

Staphylococcus, Streptococcus, Legionella pneumophilia, Neisseria gonorrhoeae, Neisseria menigitidis, E

coli, Salmonella, Shigella, Enterobacter, Proteus mirabilis, Proteus indol, Klebsiella, Haemophilus influenzae…

ụng: SMX có cấu trúc tương tự acid para aminobenzoic

nh tranh với PABA nhờ có ái lực cao vgiai đoạn I của quá trình tổng hợp acid folic c

1.1.2.2 Trimethoprim (TMP)

Trimethoprim là kháng sinh tổng hợp dẫn xuất pyrimidin

N4O3

KLPT: 290,32

t lý: ít tan trong cloroform, ethanol ho

òa tan trong nước, tan trong acid acetic băng

ng: TMP chống lại tác nhân gây nhiễm khu

E coli, Proteus, Klebsiella, Enterobacter, Staphylococcus saprophyticus, Streptococcus faecalis và chống lại nhiều vi khu

tác dụng: TMP có tác dụng kìm khuẩ

reductase của vi khuẩn [5]

Trimethoprim thường được sử dụng phối hợp với Sulfamethoxazol nh

và tăng tác dụng điều trị, chế phẩm là Cotrimoxazol (tethoxazol: Trimethoprim là 5:1)

Trimethoprim 13C3

Trimethoprim 13C3 là chất đồng vị Carbon của Trimethoprim

Shigella, Enterobacter, Proteus mirabilis, Proteus indol,

acid para aminobenzoic

c cao với dihydropteroat

p acid folic của vi khuẩn)

t pyrimidin

ít tan trong cloroform, ethanol hoặc aceton, tan nhẹ,

c, tan trong acid acetic băng [4,7]

m khuẩn đường tiết

E coli, Proteus, Klebsiella, Enterobacter, Staphylococcus

Hiện nay trên thế giới, những nghiên cứu về các kháng sinh nói chung

và kháng sinh nhóm macrolid, cotrimoxazol nói riêng rất phong phú với nhiều nền mẫu khác nhau từ các nguồn nước tự nhiên đến nước thải sinh hoạt, bệnh viện, công ty dược Một số nghiên cứu của các tác giả nước ngoài phân tích các kháng sinh CLA, AZI, TMP và SMX trong nước thải được tổng hợp ở bảng 1.2

Bảng 1.2 Một số nghiên cứu xác định hàm lượng kháng sinh nghiên cứu

trong nước thải trên thế giới

Độ thu hồi (%)

20 SMX

TMP

Chiết SPE cột trao đổi anion 500 mg rồi đến cột HLB

500 mg, rửa giải bằng 10ml hỗn hợp 95% methanol /5%

dung dịch H3PO44,38mM

- Cột: C18; 150mm x 2,1 mm; 5µm

- Pha động: amoni acetat 1mM chứa 0,007% acid acetic băng và 10%

acetonitril: acetonitril (gradient nồng độ)

24 SMX

TMP

Chiết SPE cột ENVI-18 500mg, rửa giải bằng 5ml methanol chứa acid formic 0,1M

- Cột: C18; 150mm x 4,6 mm; 5µm

- Pha động: acid formic 0,1M: acetonitril (gradient nồng độ)

- Detector: UV, λmax 270 nm,

1,48 8,06 ≈100

26 SMX

TMP

Chiết SPE cột C2/ENV+ 1g hoặc ENV+ 200mg, rửa giải bằng 5ml methanol chứa 5%

triethylamin

- Cột: C18; 150mm x 4,6 mm; 5µm

- Pha động: nước chứa acid formic 0,1%: acetonitril chứa acid formic 0,1% (gradient nồng độ)

90

18 AZI

Chiết lỏng lỏng bằng methyl tert- butyl ether

ml methanol

- Cột:C18; 125 mm x 2,0 mm; 5µm

- Pha động: hỗn hợp đệm amoni acetat 10mM pH 6 và acetonitril (90:10) : acetonitril (gradient nồng độ)

acetat10mM (pH 6)/ acetonitril (50%:50%)

- Cột : C18; 250 mm x 2,1 mm; 5µm

- Pha động: hỗn hợp 10%

acetonitril và 90% amoni acetat 10mM (pH 6):

60 60-

70

mg, rửa giải bằng 2 lần 1,5 ml methanol-

ethylacetat (1:1), 2 lần 1,5 ml methanol chứa amoni 1%

- Cột:C18; 150 mm x 2,0 mm; 3µm

- Pha động: nước chứa acid formic 0,1%: methanol chứa acid formin 0,1% (gradient nồng độ)

- Detector: ESI - MS

- IS: tylosin, josamycin, sulfamerazin

0,606 0,303 3,667 1,21

>80

>80

>80 30-

mg, rửa giải bằng 2x3ml methanol

- Cột:C18; 50 ×2.1 mm, 1,8

µm

- Pha động: (1:10 (gradient nồng độ)

- Detector: ESI - MS

- IS: josamycin

1,43 – 22

45-70

Đa số các nghiên cứu đều tiến hành phân tích các kháng sinh trên nền mẫu nước thải đã qua xử lý của các nhà máy xử lý nước thải ở các thành phố lớn của các nước trên thế giới Một số tác giả cũng thực hiện nghiên cứu phân tích dư lượng kháng sinh trên nền mẫu là nước sông hay nước ven biển [27,30]

Các nghiên cứu đã công bố đều lựa chọn phương pháp chiết pha rắn khi

xử lý mẫu và phân tích định lượng bằng phương pháp LC – MS do phương pháp SPE có tính chọn lọc, khả năng làm giàu mẫu tốt và phương pháp LC-

MS có độ đặc hiệu cao, giới hạn phát hiện thấp, mà hàm lượng kháng sinh trong mẫu nước thải lại thấp, ở dạng vết với nồng độ ppb

1.1.3.2 Ở Việt Nam

Ở Việt Nam, đã có một số đề tài và dự án nghiên cứu đánh giá dư lượng nhiều nhóm kháng sinh (quinolon, sulfonamid, macrolid, tetracyclin) nhưng ở trên nền mẫu là nước thải chăn nuôi: nghiên cứu của Phan Thị Phương Hoa và cộng sự (2011) nghiên cứu xác định dư lượng nhóm sulfonamid, macrolid [25], nghiên cứu của Satoshi M và cộng sự (2007) xác định dư lượng nhóm sulfonamid, macrolid [29] Trong đó, các nghiên cứu dư lượng kháng sinh nhóm macrolid, sulfonamid trong nước thải chăn nuôi ở Việt Nam đã tiến hành nghiên cứu ở hai khu vực sông Hồng miền Bắc và khu vực sông Mê Kông miền Nam nhưng chỉ lấy mẫu và chiết mẫu ở Việt Nam, sau đó phân tích LC – MS/MS ở Nhật [25,29]

Các nghiên cứu xác định dư lượng kháng sinh trong nước thải y tế ở Việt Nam chủ yếu được thực hiện trong những năm gần đây và với đối tượng

là các kháng sinh nhóm quinolon, cephalosporin, macrolid, sulfamethoxazol, metronidazol [3,6,13,14] Trong đó, có nghiên cứu của Dương Hồng Anh và cộng sự tiến hành định lượng Quinolon trong nước thải bệnh viện sử dụng kỹ thuật chiết pha rắn dùng cột silicagel tự tạo, phân tích các chất bằng HPLC với detector huỳnh quang [3] Nghiên cứu của Trần Thị Thanh Huế xây dựng phương pháp xác định dư lượng kháng sinh cefixim trong nước thải nhà máy dược áp dụng kỹ thuật chiết lỏng – lỏng bằng cloroform, phân tích bằng HPLC detector DAD [9] Còn lại đa phần các nghiên cứu đều lựa chọn phương pháp chiết pha rắn và phân tích bằng LC-MS để tiến hành định lượng

Đối tượng là sulfamethoxazol có nghiên cứu nhóm tác giả Đại học Dược Hà Nội (2013) thực hiện trên mẫu nước thải bệnh viện, nhưng mới chỉ ở

trên mẫu nước thải công nghiệp dược Tương tự, nghiên cứu xác định dư lượng nhóm macrolid trong nước thải công nghiệp dược (2015) cũng mới thực hiện phân tích đồng thời 2 hoạt chất Clarithromycin và Azithromycin, bước đầu đưa ra điều kiện phân tích và chưa áp dụng thử trên các mẫu nước thải thực tế [8]

Vì vậy, trong nghiên cứu này, chúng tôi phát triển phương pháp phân tích các kháng sinh clarithromycin, azithromycin, sulfamethoxazol và trimethoprim có trong nước thải từ cơ sở sản xuất Dược phẩm để áp dụng quy trình định lượng vào mẫu nước thải thực tế Hy vọng đề tài sẽ góp phần vào việc kiểm tra dư lượng kháng sinh trong nước thải, từ đó xem khả năng ảnh hưởng đến hệ vi sinh vật dẫn đến tình trạng kháng kháng sinh

1.2 Tổng quan về phương pháp dùng trong nghiên cứu

1.2.1 Sắc ký lỏng hiệu năng cao

1.3.1.1 Khái niệm

Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) là kĩ thuật phân tích dựa trên cơ sở của sự phân tách các chất trên một pha tĩnh chứa trong cột, nhờ dòng di chuyển của pha động lỏng dưới áp suất cao Sắc ký lỏng dựa trên cơ chế hấp phụ, phân bố, trao đổi ion, loại cỡ, ái lực… tùy thuộc vào loại pha tĩnh sử dụng [1]

1.2.1.3 Sắc ký lỏng khối phổ

 Khái niệm

Sắc ký lỏng khối phổ là kỹ thuật phân tích có sự kết hợp khả năng phân tách các chất trong hỗn hợp của bộ phận sắc ký lỏng hiệu năng cao (High performance liquid chromatography – HPLC) và khả năng phân tích số khối (m/z) của bộ phận khối phổ (Mass spectrometry – MS)

 Thiết bị khối phổ (Đầu dò khối phổ)

- Bộ nạp mẫu: Chuyển các mẫu cần phân tích vào nguồn ion hoá của thiết bị

khối phổ Trong sắc ký lỏng khối phổ, bộ phận nạp mẫu chính là đầu ra của cột sắc ký

- Bộ nguồn ion hóa: Có nhiệm vụ ion hoá phân tử trung hoà thành các ion

phân tử mang điện tích hoặc sự bắn phá, phân mảnh phân tử trung hoà thành các mảnh ion, các gốc mang điện tích bằng các phần tử mang năng lượng cao Ion phân tử và các mảnh ion là các phân tử có khối lượng từ đó người ta

Nguồn ion hóa

Tứ cực thứ nhất

Buồng va chạm

Tứ cực thứ hai

Có ba kiểu hình thành ion: Ion hóa phun điện tử (Electrospray Ionizaton

– ESI), Ion hóa hóa học ở áp suất khí quyển (Atmospheric Pressure Chemical Ionization – APCI), Ion hóa bằng photon tại áp suất khí quyển (Atmospheric Pressure Photonization – APPI)

Trong đó, kiểu Ion hóa phun điện tử (ESI) được thực hiện ở áp suất khí

quyển Các mẫu thử trong dung dịch được đưa vào nguồn ion qua một ống mao quản mà ở đầu ống này có một điện thế có thể lên đến 5000V Đồng thời, các dung dịch mẫu này được phun sương dưới tác động của một dòng khí Kết quả là tạo ra các hạt mang điện tích và được gia tốc đến điện cực Kỹ thuật này phù hợp cho các chất phân cực, không bền với nhiệt và nghiên cứu các phân tử sinh học có khối lượng tới 100 000 Da

Hình 1.2 Sơ đồ tạo ion dương bằng nguồn ESI Ngoài ra, còn có nguồn ion hóa đa phương thức (MMI, Multimode ionization) có thể vận hành, thao tác ở hai chế độ ion hóa ESI và APCI

- Bộ phận phân tích khối (mass analyzer): Sau khi được tạo thành thì các ion

sẽ được gia tốc và tách riêng theo tỷ số m/z nhờ tác dụng của điện trường và

từ trường để đi đến bộ phận phát hiện

Một số bộ phân tích khối thường dùng: Tứ cực (Quadrupole), Bẫy ion

(Ion trap), Ống đo thời gian bay (Time-of-flight tube)

Trong đó, bộ phân tích khối Tứ cực (Quadrupole): có 4 thanh tích điện

đặt song song, 2 thanh đối nhau có điện tích bằng nhau Các ion phù hợp với tần số quét sẽ đi thẳng tới detector, những ion khác bị phá hủy do bị va đập vào tứ cực

Hiện nay, có loại dùng bộ phân tích gồm ba tứ cực xếp nối tiếp nhau Q1, Q2, Q3 (gọi là bộ tứ cực chập ba) để ghi phổ Tứ cực Q1, Q3 làm nhiệm

vụ phân tích khối, tứ cực Q2 là ngăn để cho các ion va chạm, tạo ra các ion mảnh nhỏ hơn, khí dùng cho va chạm thường là khí argon Kỹ thuật phân tích khối phổ kiểu này được gọi là khối phổ hai lần MS/MS và thường được dùng

để khẳng định cấu trúc các chất hữu cơ và phân tích hỗn hợp nhiều thành phần

- Bộ phận phát hiện ion (detector): có nhiệm vụ chuyển các ion đã đến,

khuếch đại thành tín hiệu điện đo bằng hệ điện tử của máy khối phổ

- Bộ phận ghi và xử lý số liệu (data system)

Là một hệ thống bao gồm hệ thống kết nối và thu nhận dữ liệu thô

và phần mềm kiểm soát, điều khiển thiết bị, quá trình phân tích và tính toán, xử lý, báo cáo, kết xuất dữ liệu thô vừa thu được Một số kỹ thuật ghi phổ trong đầu dò khối phổ bao gồm :

+ Quét toàn phổ (SCAN)

Khi thao tác với chế độ scan, đầu dò sẽ nhận được tất cả các mảnh ion để cho khối phổ toàn ion đối với tất cả các chất trong suốt quá trình phân tích Thường dùng để nhận danh hay phân tích khi chất phân tích có nồng độ đủ lớn Đối với đầu dò khối phổ ba tứ cực, chế độ Full scan MS thường được lựa chọn để khảo sát ion mẹ, chế độ Full scan MS/MS quét tất cả các ion con tạo thành thường được sử dụng để xác định ion con cho tín hiệu ổn định và bền nhất

+ Selected Ion Monitoring (SIM)

Trong chế độ SIM, đầu dò MS chỉ ghi nhận tín hiệu một số mảnh ion đặc trưng cho chất cần xác định Khối phổ SIM chỉ cho tín hiệu của các ion đã được lựa chọn trước đó, do vậy không thể dùng để nhận danh hay so sánh với các thư viện có sẵn Đối với đầu dò khối phổ ba tứ cực, chế độ SIM thường được lựa chọn để khảo sát năng lượng phân mảnh khi đã biết ion mẹ

+ SRM (Selected Reaction Monitoring) và MRM (Multiple Reaction Monitoring)

Đối với khối phổ ba tứ cực, là máy đo khối phổ hai lần liên tiếp MS), 2 kỹ thuật ghi phổ có độ nhạy cao thường được sử dụng là SRM và MRM

(MS- SRM: cô lập ion cần chọn, sau đó phân mảnh ion cô lập đó, trong các mảnh ion sinh ra, cô lập 1 mảnh ion con cần quan tâm và đưa vào đầu

dò để phát hiện

 MRM: trên thực tế, do yêu cầu về mặt kỹ thuật đối với phân tích vi lượng nên các ion con cần quan tâm thường từ 2 trở lên, do vậy kỹ thuật ghi phổ MRM thông dụng hơn SRM Đầu tiên, cô lập ion cần chọn (ion mẹ) ở tứ cực thứ nhất, phân mảnh ion cô lập đó tại tứ cực thứ

2 (thực chất là buồng va chạm) thu được các ion con, cô lập 2 (hoặc nhiều) ion con cần quan tâm ở tứ cực thứ 3 và đưa vào đầu dò để phát hiện

1.2.2 Phương pháp chiết pha rắn

Do các công ty sản xuất đồng thời nhiều dược phẩm nên mẫu thường có thành phần rất phức tạp, hàm lượng chất cần phân tích khá thấp, không tương thích cho việc phân tích trực tiếp trên hệ sắc ký Vì vậy, trước khi phân tích mẫu cần phải tách, làm giàu các hợp phần của mẫu cần phân tích

Dựa trên các mối liên hệ giữa độ chọn lọc, độc tính dung môi, giá thành, thời gian để chọn phương pháp chiết mẫu sao cho hiệu quả nhất

Các phương pháp chiết mẫu dùng trong nước thải thông thường là: Chiết lỏng – lỏng và chiết pha rắn (SPE), trong đó chiết pha rắn được lựa chọn phổ biến hơn do những ưu điểm của nó

Chiết pha rắn (SPE) là phương pháp chiết dựa vào sự phân tán của chất

phân tích giữa hai pha lỏng và rắn, trong đó các chất được chiết từ pha lỏng vào pha rắn Pha rắn thường là các hạt nhỏ, xốp được nhồi vào các ống nhỏ Pha lỏng chảy qua ống, các chất phân tích tương tác với pha rắn sẽ được giữ lại trên ống Các chất này được rửa giải khỏi pha rắn bằng một dung môi khác phù hợp Thông thường thể tích dung môi rửa giải nhỏ hơn nhiều so với thể tích dung dịch mẫu Vì thế chiết pha rắn ngoài tác dụng làm sạch có thể thực hiện thêm bước làm giàu mẫu Nguyên liệu tạo pha rắn trong SPE tương tự như trong sắc ký lỏng, có thể là dẫn chất polysiloxan, polymer tạo pha liên kết, ngoài ra còn có cả pha không liên kết Tùy theo đặc tính của pha rắn mà

có thể chia thành các loại cột có bản chất khác nhau, bao gồm: pha thuận, pha đảo hay trao đổi ion

Có 2 cơ chế tách chất phân tích khỏi mẫu nhờ chiết pha rắn:

+ Các chất tạp được rửa giải khỏi cột, chỉ có chất phân tích được lưu giữ lại sao cho lượng tạp chất trong chất phân tích được giảm thiểu tối đa, chất phân tích sau đó được rửa giải bằng một dung môi rửa giải mạnh, bay hơi tới cắn hoặc trực tiếp đem đi phân tích

+ Tạp chất được giữ lại trên cột, chất phân tích đi ra theo pha lỏng được thu hồi

Để xây dựng quy trình chiết pha rắn, cần tiến hành các bước như sau:

- Chọn pha rắn: tuỳ theo bản chất của chất phân tích mà lựa chọn pha rắn có bản chất thích hợp Mặt khác, tuỳ thuộc vào lượng chất phân tích trong mẫu mà lựa chọn cột có lượng pha rắn và thể tích rửa giải khác nhau Lượng pha rắn dao động từ 50 mg đến 10 g, ứng với thể tích nền

- Qui trình chiết (SPE cột pha đảo): gồm 4 giai đoạn

1 Hoạt hóa cột chiết: Cho dung môi phù hợp đi qua pha rắn để hoạt hóa các nhóm hoạt động, đồng thời loại bỏ các khí trong cột và thay thế vào

đó là dung môi

2 Nạp mẫu: Trước khi nạp mẫu vào cột, nếu cần phải xử lý mẫu sơ bộ

để đưa mẫu vào môi trường phù hợp sao cho giai đoạn này phải lưu giữ được toàn bộ chất phân tích trên cột Chất phân tích cùng một số chất khác được giữ lại trên cột, các tạp chất đi ra khỏi cột càng nhiều càng tốt để tránh cạnh tranh và ảnh hưởng đến quá trình tương tác của chất phân tích với pha tĩnh

3 Rửa tạp chất: Sau khi nạp mẫu, trên cột vẫn còn nhiều tạp chất khác

có liên kết với pha tĩnh Phải chọn được dung môi rửa tạp sao cho có thể hòa tan và kéo được các tạp chất mà không kéo theo chất phân tích

4 Rửa giải: Chất phân tích lưu giữ trên cột được hòa tan và kéo ra khỏi cột bằng một dung môi phù hợp Đối với dung môi rửa giải, cần phải tối ưu loại dung môi, thể tích, pH dung môi rửa giải, tốc độ rửa giải…để có thể rửa giải được tối đa chất phân tích nhưng rửa giải tối thiểu các tạp chất còn trên

cột [2,11]

Chiết pha rắn là kỹ thuật có thể khắc phục được các nhược điểm của chiết lỏng- lỏng: khả năng chiết chất phân tích hiệu quả hơn, dung môi sử dụng ít, dễ dàng tập trung chất phân tích, kỹ thuật tiến hành thuận tiện, khả năng làm giàu mẫu tốt, đặc biệt có ưu điểm là cơ chế chiết đa dạng phù hợp với chất phân tích, tính chọn lọc tốt hơn Tuy nhiên có nhược điểm là giá thành của phương pháp còn cao, khó áp dụng ở quy mô rộng

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP

NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tượng và phương tiện nghiên cứu

2.1.1 Hoá chất - chất chuẩn

Bảng 2.3 Các nguyên vật liệu dùng trong nghiên cứu

Chất chuẩn

Chuẩn VKN SKS: 0213183.02 HL:938,4µg/mg

SKS: 0313109.02; HL: 99,70% (NT)

CIL - Mỹ SKS: SDED-002; HL: 50µg/ml

Dung môi, hóa chất

2.1.2 Máy móc - trang thiết bị

- Máy sắc ký lỏng khối phổ Agilent Triple Quad LC/MS 6460 (Mỹ)

- Cột Agilent Zorbax Eclipse XDB - C18 (150mm x 3mm; 3,5µm), Cột Agilent Eclipse XDB-C18 (150mm x 4,6mm; 5µm) - Mỹ

- Cột chiết pha rắn OASIS HLB 6cc Vac Cartridge 200mg, 6ml, lô 090A, Oasis (Mỹ)

- Máy đo pH Eutech Instruments pH 510, Cyberscan ,Singapore

- Bộ chiết pha rắn LiChrolut, Đức

- Cân phân tích XP105 Mettler Toledo (chính xác đến 0,01mg), Thụy Sĩ

- Thiết bị đuổi dung môi bằng khí N2 Pierce Reacti – Therm / #18822,

Mỹ

- Các dụng cụ thủy tinh trong phân tích class A (Đức)

2.1.3 Đối tượng nghiên cứu

- Mẫu trắng: Nước thải ở các cơ sở sản xuất đã được kiểm tra bằng sắc

ký lỏng khối phổ không phát hiện các kháng sinh nghiên cứu (dưới LOD)

- Mẫu thử: Nước thải ở các cơ sở có số đăng ký sản xuất các kháng sinh

nghiên cứu (Clarithromycin, Azithromycin, Trimethoprim, Sulfamethoxazol)

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Thu thập và xử lý mẫu sơ bộ

- Lấy nước thải từ nhà máy sản xuất kháng sinh

- Lọc và bảo quản mẫu sau khi lấy ở 2 - 8 oC và tiến hành phân tích trong 24h hoặc ở -30oC trong 1 tháng

2.2.2 Xử lý mẫu

Do mẫu có tính chất phức tạp và lượng chất phân tích trong mẫu (nếu có) rất nhỏ, lựa chọn xử lý mẫu bằng phương pháp chiết pha rắn Để tìm được quy trình tối ưu chiết tách và làm giàu mẫu với các kháng sinh nghiên cứu, tiến hành khảo sát các nội dung sau:

- Thể tích dung môi rửa giải: khảo sát với 3 mức thể tích dung môi rửa giải khác nhau

- Thể tích mẫu chiết: khảo sát với hai mức thể tích mẫu thử: 100 ml, 200

ml

2.2.3 Xây dựng phương pháp định lượng bằng LC-MS/MS

Tiến hành khảo sát theo các nội dung sau:

a Lựa chọn chuẩn nội: sử dụng chuẩn nội là Trimethoprim 13C3 để đảm bảo phân tách tốt và phù hợp với các chất phân tích (có tính chất tương

tự các kháng sinh nghiên cứu)

b Khảo sát điều kiện khối phổ:

 Tiến hành phân tích trên thiết bị có bộ phân tích khối dạng tứ cực chập

ba Lựa chọn nguồn ion, thế ion hóa, ion mẹ, điều kiện phân mảnh và các ion con để phân tích được đồng thời các kháng sinh trong hỗn hợp Khảo sát, tìm điều kiện khối phổ phân tích đồng thời 04 kháng sinh và IS: Azithromycin, Clarithromycin, Sulfamethoxazol, Trimethoprim và Trimethoprim 13C3

 Khảo sát điều kiện sắc ký: cột sắc ký, thành phần và tỷ lệ pha động, tốc độ dòng, thể tích tiêm để có thể tách và phát hiện đồng thời các kháng sinh nghiên cứu, sắc ký đồ sắc nét và thời gian phân tích không quá dài

2.2.4 Thẩm định quy trình phân tích đã xây dựng

Tiến hành thẩm định phương pháp trên mẫu tự tạo chứa các kháng sinh nghiên cứu với các chỉ tiêu:

- Độ đặc hiệu của phương pháp

- Độ thích hợp của hệ thống

- Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng

- Độ tuyến tính và khoảng xác định

2.2.5 Lấy mẫu, phân tích một số kháng sinh trong thực tế

Mẫu nước thải được lấy ở một số xí nghiệp Dược có số đăng ký các kháng sinh AZI, CLA, SMX, TRI để đánh giá sự có mặt và hàm lượng của các kháng sinh nghiên cứu theo quy trình đã xây dựng được ở trên Lấy mẫu ngẫu nhiên ở các cơ sở sản xuất và ở các thời điểm khác nhau: các ngày khác nhau (ngày cuối tuần - ngày trong tuần, ngày nắng – ngày mưa) và các thời điểm trong một ngày (sáng – trưa – chiều) Tiến hành lấy mẫu nước thải đầu vào và đầu ra của hệ thống xử lý nước thải

2.3 Phương pháp xử lý số liệu

- Phần mềm Microsoft Excel để tính toán và xử lý thống kê

- Một số công thức tính các giá trị thống kê:

Nồng độ dư lượng kháng sinh trong mẫu thực được tính theo công thức:

CKS = SKS/SIS - b

a f Với: SKS, SIS: diện tích pic của kháng sinh và chuẩn nội trong dịch chiết

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 3.1 Xây dựng phương pháp phân tích

3.1.1 Khảo sát và lựa chọn các điều kiện khối phổ

3.1.1.1 Điều kiện khối phổ

Để phân tích dư lượng kháng sinh bằng LC-MS/MS cần phải xác định được ion phân tử (ion mẹ) và ion sản phẩm (ion con) Với kỹ thuật ion hóa ESI, chế độ ion dương, các ion phân tử thường được tạo thành bằng cách thêm một proton [M-H]+, một số trường hợp thêm hai proton [M-2H]++ Sau

đó, cần phải xác định được các ion con tạo thành từ ion mẹ trên để định tính

và định lượng

Sử dụng dung dịch các kháng sinh có nồng độ 2 µg/ml tiêm không qua cột với hệ dung môi acetonitril - nước (1 : 1) có chứa acid formic 0,1% vào hệ thống MS để xác định ion mẹ và hai ion con đối với mỗi kháng sinh Dùng ion con có tín hiệu lớn và ổn định hơn làm ion định lượng, ion con còn lại dùng để định tính Các điều kiện phân mảnh ion như thế đầu vào (Fragment voltage: Frag), năng lượng bắn phá (CE) được tối ưu hóa tự động theo thiết bị khối phổ

Kết quả khảo sát các điều kiện của nguồn ion hóa và điều kiện phân mảnh được thể hiện ở hình 3.3 và các bảng 3.4, 3.5

Bảng 3.4 Các thông số hoạt động của nguồn ion hóa

Thông số (đơn vị) Giá trị tối ưu

Nhiệt độ khí phun (oC) 300

Áp suất đầu phun (psi) 25 Thế nguồn ion hóa (V) 3600

Bảng 3.5 Các điều kiện khối phổ để phân tích các kháng sinh nghiên cứu

(m/z)

Ion định lượng Ion định

tính (m/z)

Ion (m/z)

CE (eV)

Frag (V)

Nhận xét: các điều kiện ion hóa và điều kiện phân mảnh ở bảng 3.4 và

bảng 3.5 đã xác định được điều kiện MS/MS để phân tích các kháng sinh nghiên cứu và chất chuẩn nội Kết quả khảo sát cho thấy ion mẹ của CLA, TMP, SMX, TMP 13C3 đều ở dạng [M-H]+ có số khối lớn hơn khối lượng phân tử một đơn vị (m/z=M+1) cho cường độ tín hiệu lớn nhất và phân mảnh cho ion con định lượng và định tính dạng [M-H]+ Riêng với AZI, ion mẹ ở

Ion mẹ [M-2H] ++ (m/z=375,2) Ion con [M-H] + (m/z=591,3)

Từ đó, mỗi chất được xác định bằng một ion mẹ và hai ion con dùng để định lượng và định danh Kết quả này đáp ứng yêu cầu hiện nay đối với phương pháp phân tích bằng LC-MS/MS theo quy định của Châu Âu (2002/657/EC) với số điểm nhận dạng (IP) là 4

3.1.1.2 Khảo sát và lựa chọn điều kiện sắc ký

Để khảo sát điều kiện sắc ký, từ các dung dịch chuẩn gốc 1mg/ml tiến hành pha hỗn hợp các kháng sinh AZI, TMP, SMX 50 ng/ml, CLA 25ng/ml

và IS có nồng độ 10ng/ml, sử dụng dung môi methanol Tiến hành tiêm 10µl vào hệ thống sắc ký và khảo sát với các thông số khác như sau:

- Thể tích tiêm: 10µl

- Tốc độ dòng: 0,5 ml/phút

- Các điều kiện khối phổ theo bảng 3.4 và 3.5

- Thời gian giữa các lần phân tích (postrun): 5 phút

- Pha động A: Acid formic 0,1% trong nước

Pha động B: Acid formic 0,1% trong acetonitril

 Cột sắc ký

Cột sắc ký có vai trò phân tách các chất và các thành phần khác nhau trong mẫu Trong nghiên cứu này, cột pha đảo C18 được lựa chọn để sử dụng

vì là loại cột phổ biến, phù hợp với các chất phân tích trong nghiên cứu

Tiến hành khảo sát hai loại cột là: Cột Agilent Eclipse XDB-C18 (150mm x 4,6mm; 5µm) (cột 1) và cột Agilent Zorbax Eclipse XDB-C18

(150mm x 3mm; 3,5µm) (cột 2) Sử dụng cùng hệ pha động Sắc ký đồ tổng hợp của các kháng sinh nghiên cứu sử dụng hai loại cột trên được trình bày ở hình 3.4

Hình 3.4 Sắc ký đồ phân tích các kháng sinh khảo sát cột sắc ký (a) Cột Agilent Eclipse XDB-C18 (150mm x 4,6mm; 5µm)

(b) Cột Agilent Zorbax Eclipse XDB-C18 (150mm x 3mm; 3,5µm) Nhận xét: Từ kết quả sắc ký đồ của các kháng sinh cho thấy: cả 2 cột

đều cho kết quả tách tương tự nhau với các chất phân tích Sử dụng cột (2)

thời với cùng một thể tích tiêm, cột (1) cho pic không cân xứng, bị đổ đầu, Trimethoprim có pic tạp và đáp ứng của pic kém hơn cột (2) Vì vậy, chúng tôi lựa chọn cột (2) để tiến hành phân tích

 Pha động

Pha động trong sắc ký lỏng khối phổ được sử dụng với hai mục đích: tách các chất trong hỗn hợp và tác động vào quá trình ion hóa của các chất phân tích Trong kỹ thuật ESI (+), các acid/muối (acid formic, acid acetic, amoni format ) có vai trò cung cấp proton thường được thêm vào pha động

để tăng khả năng ion hóa các chất phân tích

Trong hầu hết các nghiên cứu đã công bố để phân tích hỗn hợp kháng sinh bằng LC-MS/MS, pha động chứa acid formic 0,1% trong hỗn hợp acetonitril và nước được sử dụng để phân tách các kháng sinh Hệ pha động chứa các thành phần như trên đã được sử dụng trong nghiên cứu này

Với kênh A: Acid formic 0,1% trong nước; kênh B: Acid formic 0,1% trong acetonitril Chương trình pha động khảo sát như bảng 3.6:

Bảng 3.6 Điều kiện khảo sát pha động

Kết quả như hình 3.5

Thời gian

(phút)

Hình 3.5 Sắc ký đồ phân tích các kháng sinh khảo sát thành phần pha động

(a)

(b)

(c)

Nhận xét: Dựa vào kết quả ở hình 3.5 cho thấy: với chương trình

gradient 1 thì pic IS và trimethoprim bị giãn và tách pic.Với chương trình gradient 2 và 3 thì IS và các kháng sinh đều cho pic các chất nhọn, đối xứng,

độ rộng chân pic hẹp, chương trình gradient 2 cho thời gian lưu các chất ngắn hơn gradient 3 nhưng không đáng kể Tuy nhiên, chương trình gradient 2 cho cường độ tín hiệu đáp ứng các chất lớn hơn gradient 3 Vì vậy, chúng tôi lựa chọn điều kiện pha động theo gradient 2 để phân tích các kháng sinh

 Tốc độ dòng pha động

Trong kỹ thuật sắc ký lỏng khối phổ, tốc độ dòng pha động phải phù hợp với lượng khí phun và áp suất đầu phun Nếu tốc độ dòng quá thấp, thời gian phân tích sẽ dài và ảnh hưởng đến hình dạng pic Ngược lại, nếu tốc độ dòng quá cao, mẫu dễ bị mất do chưa kịp ion hóa và có thể lẫn nhiều tạp dung môi

Sử dụng dung dịch chuẩn hỗn hợp các kháng sinh AZI, TMP, SMX 50 ng/ml, CLA 25 ng/ml và IS nồng độ 10 ng/ml tiêm vào hệ thống sắc ký với các điều kiện cột, pha động, thể tích tiêm và nhiệt độ cột như trên Tiến hành khảo sát với ba tốc độ dòng: 0,3 ml/phút; 0,5 ml/phút và 0,6ml/phút Kết quả sắc ký đồ các kháng sinh khi phân tích với các tốc độ dòng khác nhau được thể hiện ở hình 3.6:

Hình 3.6 Sắc ký đồ phân tích các kháng sinh khảo sát tốc độ dòng pha động

Nhận xét: Sắc ký đồ thu được với các tốc độ dòng khác nhau cho thấy:

tốc độ 0,3 ml/phút cho sắc ký đồ có các pic có thời gian lưu từ 6,7 đến 7,8 phút, độ rộng chân pic lớn hơn so với tốc độ dòng 0,5ml/phút Tốc độ dòng 0,5ml/phút cho các pic có thời gian lưu từ 4,7 đến 5,7 phút, độ rộng chân pic hẹp Tốc độ dòng 0,6ml/phút cho các pic có thời gian lưu từ 4,2 dến 5,1 phút,

độ rộng chân pic hẹp nhưng cường độ tín hiệu ( diện tích pic) kém hơn so với tốc độ dòng 0,5ml/phút

Do đó, chọn tốc độ dòng 0,5ml/phút để có sắc ký đồ cho pic có thời gian lưu phù hợp, pic cân xứng, độ rộng chân pic hẹp và cường độ tín hiệu pic phù hợp

 Thể tích tiêm

Thể tích tiêm mẫu quyết định lượng mẫu được đưa vào cột Vì vậy, cần chọn thể tích tiêm mẫu phù hợp để thu được các pic cân xứng và có giới hạn phát hiện phù hợp

Tiến hành tiêm vào hệ thống sắc ký hỗn hợp dung dịch các kháng sinh với các thể tích tiêm 5; 10 và 20 µl Kết quả được thể hiện ở hình 3.7

Nhận xét: Với thể tích tiêm 5µl, các pic thu được cân xứng, độ rộng

chân pic nhỏ nhưng đồng thời, diện tích pic thu được nhỏ hơn Với thể tích tiêm 20µl, sắc ký đồ của Trimethoprim, Sulfamethoxazol và IS bị giãn chân pic và tách pic Do đó, chọn thể tích tiêm 10µl

Ngoài ra, việc lựa chọn chuẩn nội đồng vị Trimethoprim 13C3 giúp hạn chế ảnh hưởng nền mẫu do đây là chất có tính chất tương tự kháng sinh nghiên cứu đồng thời không có trong tự nhiên, nên không có trong mẫu thực lấy để phân tích

Hình 3.7 Sắc ký đồ phân tích các kháng sinh khảo sát thể tích tiêm mẫu