Xác định acrylamide trong một số loại thực phẩm bằng phương pháp sắc ký lỏng khối phổ lc msms

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y TẾ CÔNG CỘNG BÁO CÁO KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ĐỀ TÀI CẤP CƠ SỞ H P XÁC ĐỊNH ACRYLAMIDE TRONG MỘT SỐ LOẠI THỰC PHẨM BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG KHỐI PHỔ LC-MS/MS U Chủ nhiệm đề tài: TS Đặng Thế Hưng H Cơ quan (Tổ chức) chủ trì đề tài: Trường ĐH Y tế công cộng Mã số đề tài (nếu có): YTCC_CS46 Năm 2017 MỤC LỤC DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT PHẦN A: TÓM TẮT TIẾNG VIỆT 2.5 LC-MS instrumentation 13 PHẦN B: TÓM TẮT KẾT QUẢ NỔI BẬT CỦA ĐỀ TÀI 16 PHẦN C: NỘI DUNG BÁO CÁO CHI TIẾT KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ĐỀ TÀI 18 ĐẶT VẤN ĐỀ 18 CHƯƠNG TỔNG QUAN 20 H P 1.1.Tổng quan acrylamide 20 1.1.1 Khái quát chung Acrylamide 20 1.1.2 Sự hình thành Acrylamide thực phẩm 21 1.1.3 Độc tính acrylamide 23 U 1.1.4 Các qui định acrylmide 24 1.1.5 Các phương pháp phân tích acrylamide thực phẩm 25 H 1.2 Tổng quan phương pháp sắc ký lỏng ghép khối phổ 26 1.2.1 Hệ thống sắc ký lỏng hiệu cao 26 1.2.2 Khối phổ (Mass Spectrometry) 28 CHƯƠNG ĐỐI TƯỢNG, PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 33 2.1 Đối tượng nội dung nghiên cứu 33 2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 33 2.1.2 Nội dung nghiên cứu 33 2.2 Phương tiện nghiên cứu 33 2.2.1 Dụng cụ 33 2.2.2 Thiết bị 33 2.2.3 Hoá chất 34 2.3.5 Phương pháp xử lý số liệu 41 3.1 Khảo sát điều kiện xác định acrylamide LC/MS/MS 42 3.1.1 Khảo sát diều kiện khối phổ 42 3.1.1.1 Khảo sát ion mẹ ion 42 3.1.1.2 Tối ưu điều kiện MS 43 3.1.2 Khảo sát điều kiện săc ký lỏng 44 H P 3.1.3 Khảo sát quy trình chiết mẫu 47 3.2 Thẩm điṇh phương pháp 50 3.2.1 Xác định tính chọn lọc/ đặc hiệu 50 3.3 Ứng dụng phương pháp để xác định acrylamide snack khoai tây chiên 53 U KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 56 TÀI LIỆU THAM KHẢO 58 H DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1 Độ tan Acrylamide dung môi khác Bảng 1.2 Hàm lượng Acrylamide số thực phẩm Bảng 1.3: Một vài tiêu chuẩn cho phép hàm lượng acrylamide Bảng 2.1 Số điểm IP đạt kỹ thuật sắc ký lỏng ghép khối phổ Bảng 2.2 Độ lặp lại chấp nhận nồng độ khác (theo AOAC) Bảng 2.3 Độ thu hồi chấp nhận nồng độ khác (theoAOAC) Bảng 3.1 Ion mẹ acrylamide Bảng 3.2 Các thông số tối ưu khảo sát ion mẹ H P Bảng 3.3 Các thông số tối ưu MS/MS Bảng 3.4 Chương trình pha động Bảng 3.5 Quy trình chiết acrylamide Bảng 3.6 Điểm IP nhận dạng Acrylamide Bảng 3.7 Khoảng tuyến tính đường chuẩn Bảng 3.8 Kết độ lặp lại thu hồi U Bảng 3.9 Kết độ tái lặp phòng thí nghiệm Bảng 3.10 Kết phân tích thống kê Anova Bảng 3.11 Hàm lượng Acrylamide số mẫu snack khoai tây H DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1 Cơ chế hình thành acrylamide theo phản ứng Maillard Hình 1.2 Mơ hình hệ thống LC-MS/MS Hình 1.3 Sơ đồ đơn giản hệ thống sắc ký lỏng Hình 1.4 Sơ đồ cấu trúc máy khối phổ MS Hình 1.5 Bộ nguồn ion hóa Hình 1.6 Bộ phân tích tứ cực Hình 1.7 Mơ hình phân tích tứ cực chặp ba Hình 3.1 Tỷ lệ nước acetone để chiết acrylamide H P Hình 3.2 Khối lượng PSA để làm dịch chiết acrylamide U H DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT STT Chữ viết tắt Giải thích LC Sắc ký lỏng (Liquid chromatography) LC-MS/MS Sắc ký lỏng hai lần khỗi phổ (Liquid chromatography tandem-mass spectrometry) LC-MS Sắc ký lỏng khối phổ (Liquid chromatography mass spectrometry) GC Sắc ký khí (gas chromatography) AOAC Hiệp hội nhà hóa học phân tích (Association of Official Analytical Chemists) H P LOD Giới hạn phát (Limit of Detection) LOQ Giới hạn định lượng (Limit of Quantitation) SD Độ lệch chuẩn RSD Độ lệch chuẩn tương đối 10 APCI Ion hóa hóa học áp suất khí (Atmospheric pressure chemical U ionization) 11 D-SPE Chiết phân tán pha rắn (Dispersive solid phase extraction) 12 ESI Ion hóa phun điện tử (Electrospray ionization) 13 IS Chất chuẩn nội (Internal standard) 14 PSA Các amin bậc bậc (Primary secondary amines) 15 SPE Chiết pha rắn (Solid phase extraction) H PHẦN A: TÓM TẮT TIẾNG VIỆT I Đặt vấn đề mục tiêu nghiên cứu Acrylamide chất độc hình thành thực phẩm có nguy ảnh hưởng tới sức khỏe người Tuy nhiên hiểu biết có mặt acrylamide nguy phơi nhiễm người với chất qua thức ăn hạn chế nước phát triển có Việt Nam Chính nghiên cứu xác định acrylamide thực phẩm tảng khoa học để hỗ trợ cho nghiên cứu tiếp theo, nhằm đánh giá nguy phơi nhiễm cộng đồng với chất qua nguồn thực phẩm Để xác định acrylamide thực phẩm, đề tài nghiên cứu “Xác định acrylamide số loại thực phẩm phương pháp sắc ký lỏng khối phổ LC-MS/MS” thực với mục tiêu sau: H P Xây dựng thẩm định phương pháp xác định acrylamide mẫu thực phẩm snack khoai tây chiên: - Khảo sát điều kiện máy sắc ký lỏng hai lần khối phổ để xác định acrylamide - Khảo sát điều kiện xử lý mẫu - Thẩm định phương pháp xây dựng U Áp dụng phương pháp xây dựng để xác định acrylamide mẫu snack khoai tây chiên II Đối tượng, phương tiện phương pháp nghiên cứu 2.1 Đối tượng nghiên cứu H - Đối tượng nghiên cứu hợp chất acrylamide - Đối tượng phân tích mẫu snack khoai tây chiên bán thị trường (tại cửa hàng tạp hóa, siêu thị) 2.2 Phương tiện nghiên cứu 2.2.1 Hóa chất, thuốc thử, chất chuẩn - Các hoá chất sử dụng nghiên cứu thuộc loại tinh khiết phân tích, bao gồm methanol, hexane, acetone, acetonitril, formic acid, magnesi sulfat, PSA - Chất chuẩn acrylamide Sigma-aldrich có độ tinh khiết 98% - Nội chuẩn Acrylamide-d3 2.2.2 Thiết bị, dụng cụ Hệ thống sắc ký lỏng khối phổ hai lần (LC-MS/MS) ABSciex, cân phân tích số, máy ly tâm, trang thiết bị, dụng cụ khác phòng thí nghiệm 2.3 Phương pháp nghiên cứu 2.3.1 Phương pháp xử lý mẫu - Chuẩn bị mẫu sơ bộ: Toàn mẫu xay nhỏ đồng - Xử lý mẫu: Mẫu chiết hỗn hợp acetone nước Trước chiết acrylamide, mẫu loại béo hexane Dung dịch chiết sau làm PSA trước bơm vào hệ thống LC-MS/MS để xác định acrylamide 2.3.2 Phương pháp phân tích sắc ký khối phổ LC-MS/MS - Sử dụng sắc ký lỏng pha đảo với cột sắc ký Phenomenex, μm, 150 mm x 4,6 mm, nhiệt độ cột H P 30oC Pha động gồm hai kênh A (methanol) B (Acetonitrile: 0.01% formic acid nước với tỷ lệ 5:95) với chế độ gradient, tốc độ dịng: 0,8 mL/phút Thể tích tiêm mẫu10 μL - Khối phổ ba tứ cực với nguồn ESI(+) Acrylamide lựa chọn ion phân tử (72), bắn phá lựa chọn ion sản phẩm để định lượng (55) xác nhận (44) 2.3.3 Phương pháp thẩm định Thẩm định thông số phương pháp bao gồm U 2.3.3.1 Độ chọn lọc Đánh giá tính chọn lọc thơng qua đánh giá điểm xác nhận theo tiêu chuẩn châu Âu EC 657/2002 H 2.3.3.2 Giới hạn phát (LOD), giới hạn định lượng (LOQ) Theo cách ước lượng tỉ lệ R Xác định từ mẫu thực thêm chuẩn nồng độ 5-7 lần LOD ước lượng 2.3.3.3 Khoảng tuyến tính xây dựng đường chuẩn Để xác định khoảng tuyến tính, thực đo dung dịch chuẩn có nồng độ thay đổi khảo sát phụ thuộc tín hiệu vào nồng độ Xác định phụ thuộc diện tích pic thu vào nồng độ khơng cịn tuyến tính Xây dựng đường chuẩn có nội chuẩn, nhằm mục đích loại trừ ảnh hưởng mẫu đến kết phân tích 2.3.3.4 Độ lặp lại độ thu hồi Để xác định độ lặp lại độ thu hồi phương pháp phân tích, tiến hành thí nghiệm lặp lại mẫu thực thêm chuẩn mức nồng độ khác nhau, nồng độ thực lần 2.3.4 Phân tích mẫu thực Áp dụng quy trình thẩm định để phân tích hàm lượng acrylamide 28 mẫu snack khoai tây chiên 2.3.5 Xử lý kết Các kết xử lý theo phần mềm Analyst thiết bị LC-MS/MS phần mềm Microsolf Excel III Kết phát 3.1 Khảo sát điều kiện xác định acrylamide LC/MS/MS 3.1.1 Khảo sát điều kiện sắc ký lỏng khối phổ Sử dụng khối phổ ba tứ cực với nguồn ESI(+), tiêm dung dịch chuẩn acrylamide để tối ưu hóa điều kiện Lựa chọn ion phân tử hai ion sản phẩm Đã lựa chọn điều kiện H P tối ưu để phân tích acrylamide Trong nghiên cứu này, cột pha đảo Phenomenex, μm, 150 mm x 4,6 mm sử dụng để xác định acrylamide Khảo sát tối ưu chế độ gradient phù hợp để tách acrylamide với pha động gồm kênh: kênh A (methanol) B (Acetonitrile: 0.01% formic acid nước với tỷ lệ 5:95) với chế độ gradient, tốc độ dòng: 0,8 mL/phút Tổng thời gian chạy 10 phút 3.1.2 Khảo sát quy trình chiết mẫu U - Khảo sát dung môi chiết: hệ dung môi chiết acetone/nước (tỷ lệ 90/10) xác định hệ dung môi phù hợp để chiết acrylamide khỏi mẫu với lượng tạp thấp - Khảo sát thành phần d-SPE: kết hợp MgSO4 để loại nước PSA xác định phù hợp để H loại thành phần tạp khỏi mẫu 3.1.3 Thẩm định phương pháp 3.1.3.1 Tính đặc hiệu, chọn lọc Để xác định tính đặc hiệu/chọn lọc sắc ký lỏng khối phổ sử dụng phương pháp xác nhận (confirmation method) Theo định 657/2002 Châu Âu, tính đặc hiệu đánh giá thông qua số điểm nhận dạng (IP) tỷ lệ ion xác nhận định lượng Số điểm IP cần phải đạt điểm Trong đó, ion mẹ tính điểm, ion tính 1,5 điểm Như vậy, theo kết thu số điểm IP đạt phương pháp điểm, đáp ứng yêu cầu đề 3.1.3.2 Khoảng tuyến tính đường chuẩn Pha dung dịch chuẩn acrylamide nồng độ 0; 10; 20; 50; 100; 200; 500; 1000 2500 ng/mL Nồng độ nội chuẩn acrylamide-d3 giữ cố định 100 ng/mL Xây dựng đường phụ thuộc tỷ lệ diện tích píc với diện tích píc nội chuẩn nồng độ tương ứng Đường chuẩn có hệ số tương quan 0,99 độ chệch điểm nhỏ 15% khoảng nồng độ từ 10 đến 2500 ng/mL có phụ thuộc tuyến tính diện tích píc nồng độ tương ứng Khoảng nồng độ bao trùm hàm lượng acrylamide mẫu snack khoai tây đáp ứng yêu cầu ứng dụng thực tế 3.1.3.3 Giới hạn phát giới hạn định lượng LOD LOQ xác định cách ước lượng theo tỷ lệ R Phân tích mẫu thử thêm chuẩn nồng độ gấp 5-7 lần LOD (50 ppb) ước lượng từ tài liệu tham khảo Kết xác định H P được: LOD 7.52 ppb LOQ 24.82 ppb 3.1.3.4 Độ lặp lại độ thu hồi Các kết cho thấy đa số trường hợp có hệ số biến thiên RSD% 15% độ thu hồi R% khoảng 80-110% Điều khẳng định phương pháp có độ lặp lại độ thu hồi tốt, đáp ứng yêu cầu AOAC 3.2 Xác định acrylamide thực phẩm U Kết phân tích cho thấy hàm lượng acrylamide mẫu snack khoai tây chiên dao động từ 58-18296 g/kg Khoảng hàm lượng nằm hàm lượng snack khoai tây chiên nghiên cứu số thị trường Đài Loan, Hồng Kong, Trung Quốc Hàn Quốc IV Kiến nghị H Tiếp tục nghiên cứu xây dựng quy trình xác định acrylamide mẫu khác bánh bích quy, café, mì ăn liền… 10 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ I KẾT LUẬN Trên sở kết thực nghiệm nghiên cứu để xác định acrylamide thực phẩm phương pháp sắc ký lỏng khối phổ, thu kết sau: Đã tối ưu hóa điều kiện MS/MS để xác định Acrylamide ➢ Khảo sát tìm ion mẹ, ion định tính định lượng acrylamide ➢ Tìm điều kiện tối ưu MS Đã tối ưu hóa điều kiện chạy sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC) ➢ Pha tĩnh + Cột phân tích: Cột Phenomenex (150 mm x 4,6 mm; 5.0 μm) H P ➢ Pha động hệ dung môi gồm kênh, kênh A: Methanol kênh B: Acetonitril: 0.01% HCOOH = 5:95) tìm chương trình gradient chạy tối ưu Đã khảo sát quy trình xử lý mẫu: Chúng tơi đưa quy trình xử lý mẫu tối ưu áp dụng cho mẫu snack khoai tây chiên Sử dụng hexane để loại béo, sau dùng hỗn hợp dung mơi Acetone/Nước với tỷ lệ 90/10 để chiết acrylamide khỏi mẫu Dịch chiết làm MgSO4 (200 mg) PSA (120 mg) U Thẩm định phương pháp ➢ Tính đặc hiệu / chọn lọc: Theo định 657/2002 Châu Âu, tính đặc hiệu đánh giá thơng qua số điểm nhận dạng (IP) tỷ lệ ion xác nhận định lượng Số điểm IP cần H phải đạt điểm Trong đó, ion mẹ tính điểm, ion tính 1,5 điểm Như vậy, theo kết thu số điểm IP đạt phương pháp điểm, đáp ứng yêu cầu đề ➢ Giới hạn phát (LOD) acrylamide 7.52 ppb LOQ 24.82 ppb phù hợp để xác định hàm lượng acrylamide mẫu snack khoai tây ➢ Khoảng tuyến tính: Đường chuẩn dựng từ nồng độ 0; 10; 20; 50; 100; 200; 500; 1000 2500 ng/mL Khoảng nồng độ có tuyến tính đạt yêu cầu R =0.996 > 0.99 ➢ Độ tái lặp thu hồi: Các kết cho thấy đa số trường hợp có hệ số biến thiên RSD% 15% độ thu hồi R% khoảng 80-110% Điều khẳng định phương pháp có độ lặp lại độ thu hồi tốt, đáp ứng yêu cầu AOAC 56 Ứng dụng phương pháp để phân tích số mẫu thực tế gồm 28 mẫu snack khoai tây Hàm lượng acrylamide mẫu snack khoai tây chiên dao động từ 58-18296 g/kg Khoảng hàm lượng nằm hàm lượng snack khoai tây chiên nghiên cứu trước II KIẾN NGHỊ ❖ Tiếp tục khảo sát thêm số lượng mẫu snack khoai tây khoai tây triên hệ thống LCMS/MS để có số liệu tổng thể hàm lượng acrylamide mẫu tiêu thụ Việt nam ❖ Mở rộng thêm đối mẫu thực phẩm có chứa acrylamide bánh quy, café nhiều mẫu thực phẩm chứa tinh bột qua chế biến nhiệt độ cao để dùng cho nghiên cứu sau đánh giá phơi nhiễm acrylamide thực phẩm người Việt Nam H P U H 57 TÀI LIỆU THAM KHẢO K Svensson, , L Abramsson, W Becker, A Glynn, K.-E Hellenäs, Y Lind, J Rosén, Food and Chemical Toxicology, Volume 41, Issue 11, November 2003, Pages 1581– 1586 Marta Mesías, Francisco J Morales Acrylamide in commercial potato crisps from Spanish market: Trends from 2004 to 2014 and assessment of the dietary exposure Food and Chemical Toxicology, Volume 81, July 2015, Pages 104-110 Joanna Wyka, Agnieszka Tajner-Czopek, Anna Broniecka, Ewa Piotrowska, Monika Bronkowska, Jadwiga Biernat Estimation of dietary exposure to acrylamide of Polish teenagers from an urban environment Food and Chemical Toxicology, Volume H P 75, January 2015, Pages 151-155 Mehmet Fatih Cengiz, Cennet Pelin Boyacı Gündüz Acrylamide exposure among Turkish toddlers from selected cereal-based baby food samples Food and Chemical Toxicology, Volume 60, October 2013, Pages 514-519 Louise Normandin, Michèle Bouchard, Pierre Ayotte, Carole Blanchet, Adam Becalski, Yvette Bonvalot, Denise Phaneuf, Caroline Lapointe, Michelle Gagné, U Marilène Courteau Dietary exposure to acrylamide in adolescents from a Canadian urban center Food and Chemical Toxicology, Volume 57, July 2013, Pages 75-83 Ping Ping ZHOU, Yun Feng ZHAO, Hua Liang LIU, Yong Jian MA, Xiao Wei LI, H Xin YANG, Yong Ning WU Dietary Exposure of the Chinese Population to acrylamide Biomedical and Environmental Sciences, Volume 26, Issue 6, June 2013, Pages 42A1-429 Hanna Mojska, Iwona Gielecińska, Katarzyna Stoś Determination of acrylamide level in commercial baby foods and an assessment of infant dietary exposure Food and Chemical Toxicology, Volume 50, Issue 8, August 2012, Pages 2722-2728 Anja Olsen, Jane Christensen, Malene Outzen, Pelle Thonning Olesen, Henrik Frandsen, Kim Overvad, Jytte Halkjær Pre-diagnostic acrylamide exposure and survival after breast cancer among postmenopausal Danish women Hogervorst JG, de Bruijn-Geraets D, Schouten LJ, van Engeland M, de Kok TM, Goldbohm RA, van den Brandt PA, Weijenberg MP Dietary acrylamide intake 58 and the risk of colorectal cancer with specific mutations in KRAS and APC Carcinogenesis 2014 May;35(5):1032-8 10 Toxicology, Volume 296, Issues 1–3, 14 June 2012, Pages 67-72 11 Véronique Sirot, Frédéric Hommet, Alexandra Tard, Jean-Charles Leblanc Dietary acrylamide exposure of the French population: Results of the second French Total Diet Study Food and Chemical Toxicology, Volume 50, Issues 3–4, March–April 2012, Pages 889-894 12 Hanna Mojska, Iwona Gielecińska, Lucjan Szponar, Maciej Ołtarzewski Estimation of the dietary acrylamide exposure of the Polish population, Food and Chemical Toxicology, Volume 48, Issues 8–9, August–September 2010, Pages 2090-2096 H P 13 Zhou PP, Zhao YF, Liu HL, Ma YJ, Li XW, Yang X, Wu YN Dietary Exposure of the Chinese Population to acrylamide Biomedical and Environmental Sciences, Volume 26, Issue 6, June 2013, Pages 42A1-429 Wong WW, Chung SW, Lam CH, Ho YY, Xiao Y Dietary exposure of Hong Kong adults to acrylamide: results of the first Hong Kong Total Diet Study Food 14 Additives & Contaminants: 2014; 31(5):799-805 U 15 Lee JH, Lee KJ, Ahn R, Kang HS Urinary concentrations of acrylamide (AA) and Nacetyl-S-(2-carbamoylethyl)-cysteine (AAMA) and associations with demographic factors in the South Korean population International Journal of Hygiene and H Environmental Health Volume 217, Issue 7, September 2014, Pages 751–757 16 Ji K, Kang S, Lee G, Lee S, Jo A, Kwak K, Kim D, Kho D, Lee S, Kim S, Kim S, Hiuang YF, Wu KY, Choi K Urinary levels of N-acetyl-S-(2-carbamoylethyl)cysteine (AAMA), an acrylamide metabolite, in Korean children and their association with food consumption Science of the Total Environment Volumes 456–457, July 2013, Pages 17–23 17 Catherine Harper Vietnam Noncommunicable Disease Prevention and Control Programme 2002-2010 Implementation Review 18 Biedermann, M., Biedermann-Brem, S., Noti, A., Grob, K., Egli, P., & Mandli, H (2002b) Two GC-MS methods for the analysis of acrylamide in foods 19 Mitteilungen aus Lebensmitteluntersuchung und Hygiene, 93, 638–652 59 20 Biedermann, M., Noti, A., Biedermann-Brem, S., Mozzetti, V., & Grob, K (2002c) Experiments on acrylamide formation and possibilities to decrease the potential of acrylamide formation in potatoes Mitteilungen aus Lebensmitteluntersuchung und Hygiene, 93, 668–687 21 Bologna, L S., Andrawes, F F., Barvenik, F W., Lentz, R D., & Sojka, R E (1999) Analysis of residual acrylamide in field crops Journal of Chromatography Science, 37, 240–244 Borodin, N (1925) 22 Biological observations on the Atlantic sturgeon Transactions of the American Fisheries Society, 55, 184–190 Brandl, F., Demiani, S., Ewender, J., Franz, R., Gmeiner, M., Gruber, L., et al (2002) H P 23 A rapid and convenient procedure for the determination of acrylamide in foodstuffs Electronic Journal of Environmental, Agricultural and Food Chemistry, 1(3), 137–144 24 Brown, L., & Rhead, M M (1979) Liquid chromatographic determination of acrylamide monomer in natural and polluted aqueous environments The Analyst, 104, 391–399 25 Brown, L., Rhead, M M., Hill, D., & Bancroft, K C C (1982) Quantitative and U quantitative studies on the in situ adsorption, degradation and toxicity of acrylamide by the spiking of the waters of two sewage works and a river Water Research, 16, 579– 591 Casella, I G., & Contursi, M (2004) H 26 Quantitative analysis of acrolein in heated vegetable oils by liquid chromatography with pulsed electrochemical detection Journal of Agricultural and Food Chemistry, 52, 5816–5821 Castle, L (1993) 27 Determination of acrylamide monomer in mushrooms grown on polyacrylamide gel Journal of Agricultural and Food Chemistry, 41, 1261–1263 Castle L (2003) 28 OudTurnhout Castle, L., & Eriksson, S (2005) Analytical methods used to measure acrylamide concentrations in foods Journal of AOAC International, 88, 274–284 Castle, L., Campos, M J., & Gilbert, J (1991) 29 Determination of acrylamide monomer in hydroponically grown tomato fruits by capillary gas chromatography-mass spectrometry Journal of the Science of Food and Agriculture, 54, 549–555 Cavalli S, Maurer R & Höfler F (2002) 60 30 Fast determination of acrylamide in food samples using accelerated solvent extraction followed by ion chromatography with UV or MS-detection, 2003, LC/GC Europe, The Applications book, pp 1-3 Cavalli, S., Polesello, S., & Saccani, G (2004) 31 Determination of acrylamide in drinking water by large-volume direct injection and ion-exclusion chromatography-mass spectrometry Journal of Chromatography A, 1039, 155–159 Claus, A., Carle, R., & Schieber, A (2008) Acrylamide in cereal products: A review Journal of Cereal Science, 47, 118–133 Delatour, T., Périsset, A., Goldmann, T., Riedeker, S., & Stadler, R H (2004) 32 Improved sample preparation to determine acrylamide in difficult matrixes such as chocolate powder, cocoa, and coffee by liquid chromatography tandem mass H P spectrometry Journal of Agricultural and Food Chemistry, 52, 4625–4631 33 Dionex (2004) Fast determination of acrylamide in food samples using Accelerated Solvent Extraction (ASE) followed by Ion chromatography with UV or MS detection Application Note, 409, 1-4 34 Zhang, Y.; Jiao, J.; Cai, Z.; Zhang, Y.; Ren, Y (2007), An improved method validation for rapid determination of acrylamide in foods by ultra-performance liquid chromatography combined U with tandem Chromatography A, 1142, pp 194 – 198 mass spectrometry, Journal of 35 Zhang, Y.; Jiao, J.; Ren, Y.; Wu, X.; Zhang, Y (2005), Determination of acrylamide in H infant cereal-based foods by isotope dilution liquid chromatography coupled with electrospray ionization tandem mass spectrometry, Analytica Chimica Acta, 551, pp 150 – 15 61 PHỤ LỤC H P U Sắc đồ ion acrylamide H Sắc đồ ion d3-acrylamide 62 QUY TRÌNH PHÂN TÍCH ACRYLAMIDE QUY TRÌNH PHÂN TÍCH XÁC ĐỊNH ACRYLAMIDE TRONG THỰC PHẨM BẰNG KỸ THUẬT SẮC KÝ LỎNG GHÉP KHỐI PHỔ LC-MS-MS Phạm vi áp dụng Quy trình áp dụng xác định acrylamide snack khoai tây kỹ thuật sắc ký lỏng ghép khối phổ LC-MS-MS Nguyên tắc Acrylamide chiết khỏi mẫu dung dịch acetone-nước Dịch chiết làm sach hỗn hợp MgSO4 PSA Xác định định lượng acrylamide kỹ thuật sắc ký lỏng ghép khối phổ LC-MS-MS H P Thuốc thử Trong quy trình này, sử dụng thuốc thử có cấp độ tinh khiết, phân tích nước cất hai lần loại ion 3.1 Chuẩn acrylamide, 99,0 %; 3.2 Chuẩn nội acrylamide-d3; 3.3 Acetone, loại dùng cho LC/MS; U 3.4 Acetonitril, loại dùng cho LC/MS; 3.5 Methanol, loại dùng cho LC/MS; 3.6 Nước, loại dùng cho LC/MS; H 3.7 Ethyl acetate, loại dùng cho phân tích; 3.8 Axit formic, loại dùng cho phân tích; 3.9 N-hexan, loại dùng cho phân tích; 3.10 MgSO4, loại dùng cho phân tích 3.11 Dung dịch chuẩn gốc acrylamide - AA 500μg/ml: cân xác khoảng 25.0 mg acrylamide vào cốc có mỏ ml, thêm nước siêu để hoà tan chuyển dung dịch vào bình định mức 50 ml, tráng rửa cốc nhiều lần, định mức đến vạch nước siêu Dung dịch bảo quản 4oC, chai tối màu, ổn định năm 3.12 Dung dịch nội chuẩn acrylamide (2,3,3-D3) - AAD3 500μg/ml: cân xác khoảng 12.5 mg acrylamide vào cốc có mỏ 5ml, thêm nước siêu để hoà tan chuyển dung dịch vào bình định mức 25 ml, tráng rửa cốc nhiều lần, định mức đến vạch nước siêu Dung dịch bảo quản 4oC, chai tối màu, ổn định năm 3.13 Dung dịch chuẩn trung gian AA 100μg/ml: lấy xác 2.0 ml chuẩn gốc AA 500μg/ml vào bình định mức 10 ml, thêm nước siêu đến vạch Dung dịch bảo quản chai tối màu, 20 – 25oC tránh ánh sáng, ổn định tháng 63 3.14 Dung dịch chuẩn trung gian AA 10μg/ml: lấy xác 0.2 ml chuẩn gốc AA 500μg/ml vào bình định mức 10 ml, thêm nước siêu đến vạch Dung dịch bảo quản chai tối màu, 20 – 25oC tránh ánh sáng, ổn định tháng 3.15 Dung dịch nội chuẩn AAD3 10μg/ml: lấy xác 0.2 ml chuẩn gốc AA 500μg/ml vào bình định mức 10 ml, thêm nước siêu đến vạch Dung dịch bảo quản chai tối màu, 20 – 25oC tránh ánh sáng, ổn định tháng 3.16 Dung dịch chuẩn trung gian AA 1μg/ml: lấy xác ml chuẩn gốc AA 10μg/ml vào bình định mức 10 ml, thêm nước siêu đến vạch Dung dịch bảo quản chai tối màu, 20 – 25oC tránh ánh sáng, ổn định tuần 3.17 Dung dịch nội chuẩn AAD3 1μg/ml: lấy xác ml chuẩn gốc AAD3 10μg/ml vào bình định mức 10 ml, thêm nước siêu đến vạch Dung dịch bảo quản chai tối màu, 20 – 25oC tránh ánh sáng, ổn định H P tuần LƯU Ý: - Lượng chuẩn loại phải điều chỉnh hợp lý để đạt nồng độ chuẩn gốc 1000 g / ml sau tính tốn hiệu chỉnh theo giấy chứng nhận độ tinh khiết nhà sản xuất - Thể tích methanol thích hợp phải điều chỉnh hợp lý để đạt nồng độ chuẩn nội gốc 1000 g / ml tùy theo quy cách đóng gói nhà sản xuất 3.18 Dung dịch HCOOH 0.01%: thêm 100μl HCOOH 100% vào 999.9 ml nước siêu sạch, lắc đánh siêu âm 3.19 Dung dịch HCOOH 0.01% - ACN (95:5): trộn 950 ml dung dịch HCOOH U 0.01% với 50 ml ACN, khuấy đều, đánh siêu âm Thiết bị, dụng cụ H Sử dụng thiết bị, dụng cụ phịng thử nghiệm thơng thường cụ thể sau: 4.1 Hệ thống máy sắc ký lỏng khối phổ LC/MS/MS API3200 - Bơm kênh dung mơi biến đổi dịng; - Detector MS / MS; - Máy tính phần mềm phân tích; - Cột sắc ký Phenomenex, μm, 150 mm x 4,6 mm; 4.2 Ống ly tâm polypropylene, dung tích 50 ml có nắp; 4.3 Máy ly tâm lạnh, tốc độ 4000 r / min; 4.4 Máy lắc ngang, 400 r / min; 4.5 Máy lắc vortex, tốc độ 400 r / min; 4.6 Bộ quay chân khơng, có điều chỉnh nhiệt độ; 4.7 Bình lê, dung tích 50 ml; 64 4.8 Máy đo pH, độ xác đến 0,01; 4.9 Tủ ấm, có điều chỉnh nhiệt độ; 4.10 Cân phân tích, có độ xác đến 0,1 mg; 4.11 Bình định mức, dung tích 10 ml, 25 ml, 50 ml, 100 ml 1000 ml; 4.12 Pipet tự động, dung tích 50 l, 100 l, 250 l; 1000 l; 5000 l; 4.13 Ống thủy tinh, dung tích 10 ml; 4.14 Lọ đựng mẫu, dung tích 1,5 ml; 4.15 Đầu lọc nylon, đường kính lỗ 45 m Xây dựng đường chuẩn Đường chuẩn xây dựng theo bảng Bảng - Xây dựng đường chuẩn H P U H Chuẩn bị mẫu Cân lượng xác khoảng 2,0 g mẫu đồng vào ống ly tâm Cho vào 100 l chuẩn nội acrylamide 100 g/l Lắc 30 giây, sau để yên 15 trước tiến hành bước Tiến hành thử nghiệm 7.1 Chiết mẫu làm mẫu 65 - Cân 1g mẫu đồng vào ống nhựa PP - Thêm 0.05ml nội chuẩn Acrylamide-D3 10μg/ml - Thêm 5ml Hexan lắc phút - Gạn bỏ hết lớp dung dịch (Hexan), để mẫu khơ hồn tồn - Bổ sung 10ml hỗn hợp Aceton - H2O (92:8), lắc 10 phút - Ly tâm 4500 v/phút phút - Lấy 1ml lớp dung dịch vào ống ly tâm 2ml chứa 110mg PSA (Primary Secondary Amine) 200mg MgSO4 - Vortex 30 giây - Ly tâm 4500 v/phút phút Lấy lớp dung dịch phân tích LC-MS/MS 7.2 Tiến hành thử nghiệm LC-MS-MS 7.2.1 Điều kiện HPLC - Cột sắc ký Phenomenex, μm, 150 mm x 4,6 mm; H P - Nhiệt độ cột theo nhiệt độ phịng; - Thể tích bơm mẫu: 10 l; - Thời gian phân tích: min; - Tốc độ dịng: 0,4 ml / min; Pha động: chương trình gradient thể theo bảng Thời gian (phút) U Bảng - Chương trình pha động Tốc độ dịng Kênh A (Methanol) Kênh B (Acetonitril: (mL/phút) 0.01% 0.01 0.8 4.0 0.8 6.0 0.8 7.0 0.8 9.0 H 5:95) 100% 50% 50% 50% 50% 100% 0.8 100% 9.1 0.8 100% 10 0.8 100% 7.2.2 Điều kiện MS Điều kiện MS sau: Kiểu ion hóa: ESI (+); 66 HCOOH = Nhiệt độ nguồn ion hóa: 150 oC; Nhiệt độ hóa dung mơi: 400 oC; Tốc độ dịng khí làm bay dung mơi: 600 l / h; Tốc độ dịng khí qua khối nón: 30 l / h; Các điều kiện phân ly MS/MS sau: Chất Bảng - Điều kiện phân ly MS/MS Ion mẹ Ion DP (V) CE (V) Acrylamide 72 D3-acrylamide 55 44 50 58 75 44 18 18 20 20 16 18.5 19 20 H P 7.3 Trình tự bơm mẫu CXP (V) 7.3.1 Bơm dung mơi kiểm tra máy, dung dịch hòa tan acrylamide; 7.3.2 Bơm dung dịch lập đường chuẩn; 7.3.3 Bơm mẫu thử U Tính tốn biểu thị kết 8.1 Tính hệ số tín hiệu Tính cho chất cần phân tích theo phương trình: RF  Trong đó: RF: hệ số tín hiệu; H Sp SpIS Sp: tổng diện tích pic ion thứ cấp chất cần phân tích; SpIS: diện tích pic ion thứ cấp chất chuẩn nội tương ứng 8.2 Xây dựng đường chuẩn Xây dựng phương trình bậc hệ số tín hiệu với nồng độ chất chuẩn cho vào mẫu thực chuẩn bị mẫu theo mục 6.4 Phương trình có dạng: RF = ax + b Trong đó: - RF: Hệ số tín hiệu, tính theo mục 8.1; - x: nồng độ chất chuẩn thêm vào mẫu; - b: điểm cắt đường chuẩn với trục tung; - a: hệ số góc đường chuẩn Phương trình đạt u cầu hệ số hồi quy R2 ≥ 0,99 67 8.3 Hàm lượng chất phân tích mẫu Dư lượng chất cần phân tích mẫu tính theo phương pháp đường chuẩn xây dựng theo mục 8.2 Nồng độ mẫu phân tích tính theo cơng thức sau: C Cx V F a Trong đó: C: nồng độ chất phân tích có mẫu, tính g / kg; Cx: nồng độ chất phân tích đo suy từ đường chuẩn, g /l; V: thể tích định mức cuối cùng, tính ml; F: hệ số pha lỗng mẫu đo (nếu khơng pha loãng, F = 1); a: khối lượng mẫu thử, tính gam (g); H P 8.4 Biểu thị kết Kết biểu thị đơn vị g / kg (ppb), hai số sau dấu phẩy Báo cáo thử nghiệm Báo cáo thử nghiệm phải ghi rõ: - Thông tin cần thiết việc nhận biết đầy đủ mẫu thử; - Phương pháp lấy mẫu sử dụng, biết; U - Phương pháp thử sử dụng, viện dẫn tiêu chuẩn này; - Các chi tiết bất thường khác ảnh hưởng tới kết thử nghiệm; - Độ lập lại phương pháp; H - Kết thử nghiệm thu THƯ MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] Zhang, Y.; Jiao, J.; Cai, Z.; Zhang, Y.; Ren, Y (2007), An improved method validation for rapid determination of acrylamide in foods by ultra-performance liquid chromatography combined with tandem mass spectrometry, Journal of Chromatography A, 1142, pp 194 – 198; [2] Zhang, Y.; Jiao, J.; Ren, Y.; Wu, X.; Zhang, Y (2005), Determination of acrylamide in infant cereal-based foods by isotope dilution liquid chromatography coupled with electrospray ionization tandem mass spectrometry, Analytica Chimica Acta, 551, pp 150 – 15 68 BIÊN BẢN GIẢI TRÌNH CHỈNH SỬA Kính gửi: - Phịng Quản lý khoa học công nghệ - Hội đồng khoa học nghiệm thu đề tài Nhóm nghiên cứu tiến hành nghiên cứu nghiêm túc nhận xét Hội đồng nghiệm thu đề tài “Xác định Acrylamide số loại thực phẩm phương pháp sắc ký lỏng khối phổ LC-MS/MS.” cảm ơn hội đồng có góp ý q báu cho chúng tơi, sau nhóm nghiên cứu xin trình bày nội dung chỉnh sửa: TT Nhận xét Hội đồng Nội dung chỉnh sửa Đã xây dựng thành quy trình đầy đủ (SOP) đưa vào phần phụ lục Đã bổ sung thêm sắc ký đồ thu phụ lục Mục tiêu xây dựng quy trình phân tích, khơng kèm theo quy H P trình đầy đủ Vì cần phải mơ tả quy trình đầy đủ theo form TCVN U Sản phẩm SOP rõ ràng đầy đủ H Bổ sung thêm liệu sắc ký đồ thu báo cáo Trong mục 3.2.5 xác định độ tái lặp phịng thí Đã bổ sung thông tin thử nghiệm viên thực khác thực nghiệm đánh giá độ tái lặp nghiệm tiến hành phân tích mẫu snack khoai tây vào ngày khác với điều kiện phịng thí nghiệm (người làm khác nhau), nhiên kết thể bảng 3.9 69 TT Nhận xét Hội đồng Nội dung chỉnh sửa chưa thể rõ kết thử nghiệm viên khác nên cần giải thích rõ Nên mở rộng đối tượng nghiên cứu sang mẫu khác Tăng số lượng phân tích mẫu khoai tây chiên Khoảng tuyến tính rộng cần cân nhắc chia khoảng phù hợp Các lỗi đơn vị hàm Vì có nhiều mẫu thực phẩm có chứa acrylamide Vì khn khổ đề tài nhóm nghiên cứu tập trung vào mẫu đại diện snack khoai tây Đây hạn chế đề tài tương lai có điều kiện, nhóm nghiên cứu tiếp tục mở rộng để áp dụng vào thực tiễn đánh giá an toàn vệ sinh thực phẩm H P Các nghiên cứu trước thường xây dựng khoảng tuyến tính 5000 pbb Vì nồng độ tối đa xây dựng đề tài để xác định khoảng tuyến tính 2500 pbb Vì nhóm nghiên cứu khơng chỉa thành khoảng nhỏ để phân tích U Đã chỉnh sửa lượng lỗi khác H 70 Hà nội, ngày tháng năm 2017 Chủ nhiệm đề tài