Nghiên cứu xác định vitamin c trong một số loại trái cây bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (hplc)

Nghiên cứu xác định Vitamin C số loại trái phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC) LỜI CẢM ƠN 664 Khóa luận thực phịng thí nghiệm Trung tâm Kiểm định An tồn Thực phẩm Mơi trường, Trường Đại học Vinh Với lịng kính trọng biết ơn sâu sắc, tơi xin chân thành cảm ơn đến cô giáo TS Đinh Thị Trường Giang – giảng viên Khoa Hóa học, Trường Đại học Vinh giao đề tài, tận tình hướng dẫn, tạo điều kiện thuận lợi suốt trình nghiên cứu hồn thành khóa luận Tơi xin chân thành cảm ơn Ths Chu Thị Thanh Lâm – tổ Hóa học, Trung tâm thực hành - Thí nghiệm, Trường Đại học Vinh tạo điều kiện thuận lợi giúp đỡ tơi q trình làm thí nghiệm, hướng dẫn cách sử dụng máy HPLC để đo mẫu Nhân dịp này, xin gửi lời cảm ơn đến thầy cơ, cán khoa Hố, trường Đại học Vinh tạo điều kiện cho học tập nghiên cứu môi trường học tập khoa học, giúp cho tơi có kiến thức vững vàng trước bước vào đời Cuối tơi xin tỏ lịng biết ơn sâu sắc tới gia đình, bạn bè động viên giúp đỡ tơi hồn thành khóa luận Vinh, ngày tháng năm 2014 Sinh viên thực Bùi Văn Bảo GVHD: TS Đinh Thị Trƣờng Giang i SVTH: Bùi Văn Bảo Nghiên cứu xác định Vitamin C số loại trái phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC) MỤC LỤC Trang LỜI MỞ ĐẦU i Lí chọn đề tài: Nhiệm vụ nghiên cứu: Đối tượng nghiên cứu: Chƣơng TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan loại trái 1.1.1 Giới thiệu loại trái 1.1.2 Phân loại 1.1.3 Tìm hiểu số loại trái nghiên cứu 1.1.3.1 Trái Khế 1.1.3.2 Trái Quýt 1.3.3 Trái Táo tây 1.1.3.4 Trái Ổi 10 1.2 Tổng quan vitamin 11 1.2.1 Khái niệm 11 1.2.2 Lịch sử vitamin 11 1.2.3 Vai trò đặc điểm chung 12 1.2.4 Nguồn vitamin 13 1.2.5 Các yếu tố ảnh hưởng đến vitamin 13 1.2.6 Phân loại 13 1.2.7 Vitamin C (Axit ascorbic) 14 1.2.7.1 Giới thiệu 14 1.2.7.2 Tính chất Vitamin C 15 1.2.7.4 Nhu cầu Vitamin C 18 1.2.7.5 Biến đổi vitamin C trình chế biến bảo quản 21 1.2.7.5.1 Biến đổi chế biến 21 1.2.7.5.2 Ảnh hưởng môi trường 22 1.2.7.5.3 Xử lý hoá chất 22 GVHD: TS Đinh Thị Trƣờng Giang ii SVTH: Bùi Văn Bảo Nghiên cứu xác định Vitamin C số loại trái phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC) 1.2.7.5.4 Phương pháp làm khô 23 1.2.7.5.5 Trong bảo quản lạnh 23 1.3 Các phương pháp xác định vitamin C 24 1.3.1 Phương pháp chuẩn độ iôt 24 1.3.1.1 Quy trình thực 25 1.3.1.2 Tính tốn nồng độ vitamin C 26 1.3.2 Phương pháp sắc kí lỏng hiệu cao 27 1.3.2.1 Cơ sở lý thuyết 27 1.3.2.2 Nguyên tắc trình sắc ký cột 28 1.3.2.3 Phân loại sắc ký ứng dụng 28 1.3.2.4 Hệ thống HPLC 29 1.3.2.5 Chọn điều kiện sắc ký 31 1.3.2.5.1 Lựa chọn pha tĩnh 31 1.3.2.5.2 Lựa chọn pha động 32 1.3.2.6 Tiến hành sắc ký 33 1.3.2.6.1 Chuẩn bị dụng cụ máy móc 33 1.3.2.6.2 Chuẩn bị dung môi pha động: 34 1.3.2.6.3 Chuẩn bị mẫu đo HPLC 34 1.3.2.6.4 Cách đo HPLC 34 Chƣơng PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU THỰC NGHIỆM 35 2.1 Phương pháp chuẩn bị dụng cụ thiết bị hóa chất 35 2.1.1 Thiết bị, dụng cụ [8] 35 2.1.2 Chuẩn bị hóa chất 36 2.2 Phương pháp chuẩn bị mẫu 37 2.2.1 Phương pháp lấy mẫu 37 2.2.2 Mẫu phân tích 37 2.2.3 Sơ đồ xử lý chất chuẩn mẫu 37 2.3 Tiến hành máy sắc ký HPLC [8] 38 2.4 Đánh giá phương pháp 39 GVHD: TS Đinh Thị Trƣờng Giang iii SVTH: Bùi Văn Bảo Nghiên cứu xác định Vitamin C số loại trái phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC) 2.4.1 Khảo sát giới hạn phát (LOD) giới hạn xác định (LOQ) phương pháp 39 2.4.2 Khảo sát độ lặp 39 2.5 Đánh giá hiệu suất thu hồi 40 Chƣơng KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 41 3.1 Xác định khoảng tuyến tính đường chuẩn Vitamin C [4] 41 3.2 Kết định lượng hàm lượng vitamin C mẫu trái 42 3.3 Đánh giá phương pháp [9] 42 3.1 Xác định độ lặp lại phương pháp 42 3.3.2 Đánh giá tính tốn giới hạn phát giới hạn định lượng 44 3.3.3 Xác định hiệu suất thu hồi 45 Các sắc đồ phân tích vitamin C chuẩn mẫu trái 45 4.1 Sắc đồ dung dịch chuẩn Vitamin C 45 3.4.2 Sắc đồ mẫu thử xác định Vitamin C 47 KẾT LUẬN 49 TÀI LIỆU THAM KHẢO 50 GVHD: TS Đinh Thị Trƣờng Giang iv SVTH: Bùi Văn Bảo Nghiên cứu xác định Vitamin C số loại trái phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC) DANH MỤC CÁC BẢNG Trang Bảng 1.1 Hàm lượng vitamin C có số thực vật 14 Bảng 1.2 Hàm lượng vitamin C có số động vật 15 Bảng 1.3 Lượng vitamin C cần theo độ tuổi 19 Bảng 3.1 Diện tích peak vitamin C tương ứng với nồng độ chuẩn 41 Bảng 3.2 Kết phân tích hàm lượng vitamin C mẫu 42 Bảng 3.3 Kết trung bình, độ lệch chuẩn, hệ số biến thiên mẫu khế, ổi, quýt, táo tây 43 Bảng 3.4 Giá trị LOD LOQ 43 GVHD: TS Đinh Thị Trƣờng Giang v SVTH: Bùi Văn Bảo Nghiên cứu xác định Vitamin C số loại trái phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC) DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ Trang Hình 1.1 Hình ảnh trái khế trái quýt Hình 1.2 Hình ảnh trái ổi táo tây 10 Hình 1.3 Hình ảnh khơng gian cấu trúc vitamin C 16 Hình Hình ảnh máy sắc ký lỏng hiệu cao HPLC phịng thí nghiệm 35 Hình 3.1 Đường chuẩn biểu thị mối quan hệ diện tích pic thu nồng độ chuẩn vitamin C 41 Hình 3.2 Sắc đồ mẫu chuẩn có nồng độ 19ppm 45 Hình 3.3 Sắc đồ mẫu chuẩn có nồng độ 76ppm 46 Hình 3.4 Sắc đồ mẫu chuẩn có nồng độ 456ppm 46 Hình 3.5 Sắc đồ mẫu khế 47 Hình 3.6 Sắc đồ mẫu ổi (pha loãng lần) 47 Hình 3.7 Sắc đồ mẫu quýt (pha loãng lần) 48 Hình 3.8 Sắc đồ mẫu táo tây 48 GVHD: TS Đinh Thị Trƣờng Giang vi SVTH: Bùi Văn Bảo Nghiên cứu xác định Vitamin C số loại trái phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC) DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU VÀ CHỮ CÁI VIẾT TẮT HPLC: Sắc ký lỏng hiệu cao LOD (Limit of detection): Giới hạn phát LOQ (Limit of quality): Giới hạn định lượng hay giới hạn xác định UV – VIS ( ultraviolet – spectrophotometer): quang phổ tử ngoại khả kiến DRI (Dietary Reference Intakes): thuật ngữ chung cho tập giá trị tham chiếu sử dụng để lập kế hoạch đánh giá lượng chất dinh dưỡng người khoẻ mạnh hay khuyến nghị nhu cầu chất dinh dưỡng cho chế độ ăn hàng ngày UL ( Tolerable Upper Intake Level): số lượng cao chất dinh dưỡng thu nhận hàng ngày mà không gây tác dụng có hại cho sức khỏe UI ( Unit International): đơn vị quốc tế dùng để định lượng vitamin, thuốc môt số chất sinh học khác SPE (Solid phase extraction) Chiết pha rắn RSD (relative standard deviation) Độ lệch chuẩn tương đối 50 IU = µg L- ascorbic acid GVHD: TS Đinh Thị Trƣờng Giang vii SVTH: Bùi Văn Bảo Nghiên cứu xác định Vitamin C số loại trái phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC) LỜI MỞ ĐẦU Lí chọn đề tài: Vitamin nhóm chất hữu có phân tử lượng lớn tính chất lý, hố học khác Tác dụng chúng thể sinh vật khác cần thiết cho sống sinh vật, người động vật So với nhu cầu chất dinh dưỡng protein, lipit, gluxit nhu cầu vitamin thấp Có khoảng 40 vitamin khống chất cần thiết cho người Vitamin cung cấp vào thể người để đáp ứng nhu cầu dinh dưỡng giúp thể khỏe mạnh Trong nhiều kỉ, thiếu số vitamin gây nên bệnh khác như: - Thiếu vitamin A: gây bệnh mắt, nhiễm khuẩn đường hơ hấp đường tiêu hóa; chậm phát triển chiều cao - Thiếu vitamin B1: dễ bị phù, viêm dây thần kinh, suy tim; - Thiếu vitamin C: dễ gây chảy máu da niêm mạc, làm giảm sức đề kháng thể với bệnh tật, đặc biệt bệnh nhiễm khuẩn; - Thiếu vitamin K: dễ bị xuất huyết, đặc biệt xuất huyết não, màng não; - Thiếu vitamin D canxi: chậm tăng chiều cao; đau xương tăng trưởng, Nhiều năm qua, nhà khoa học nghiên cứu nhiều đối tượng vitamin loại chế phẩm thực phẩm khác Trong vitamin C quan tâm đáng kể Vitamin C có nhiều dược phẩm, thực phẩm tự nhiên loại thực phẩm qua chế biến Trong thực phẩm viamin C có nhiều loại rau tươi nước cam, chanh, quít, có hàm lượng cao rau xanh, đặc biệt cải xanh, tiêu, khoai tây, cải brussel, rau cải, cà chua, cam, quýt, chanh, bưởi Có thể xác định vitamin C phương pháp chuẩn độ i ốt, sắc kí,… Nhưng vitamin C hợp chất hữu thuộc đối tượng khó phân tích tồn trạng thái tan nước Do cần phải lựa chọn phương pháp phân tích mang lại hiệu cao Chúng tơi chọn phương pháp sắc kí lỏng hiệu cao(HPLC), phương pháp đại cho ta biết kết nhanh xác, tiết kiệm thời gian lượng mẫu cần dùng Với lý nên chúng tơi lựa chọn đề tài nghiên cứu ”Nghiên cứu GVHD: TS Đinh Thị Trƣờng Giang SVTH: Bùi Văn Bảo Nghiên cứu xác định Vitamin C số loại trái phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC) xác định vitamin C số loại trái phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC)” Nhiệm vụ nghiên cứu: Trong khóa luận này, thực nhiệm vụ sau: - Nghiên cứu tính chất vật lý, hóa học phương pháp xác định vitamin C - Tách vitamin C mẫu ổi, khế, quýt, táo tây - Định lượng vitamin C phương pháp HPLC - Kết thực nghiệm Đối tƣợng nghiên cứu: Mẫu ổi, khế, quýt, táo tây thu thập từ quày hàng chợ Bến Thủy, thành phố Vinh Mỗi mẫu lấy theo dạng ngẫu nhiên, đựng vào túi nilông Mẫu lấy vào ngày 7/10/2013 ngày 29/10/2013 GVHD: TS Đinh Thị Trƣờng Giang SVTH: Bùi Văn Bảo Nghiên cứu xác định Vitamin C số loại trái phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC) GVHD: TS Đinh Thị Trƣờng Giang SVTH: Bùi Văn Bảo Nghiên cứu xác định Vitamin C số loại trái phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC) f Máy lọc hút chân không g Màng lọc 13mm, 0.45m (PTFE) h Dụng cụ thủy tinh loại: pipet định mức 1ml, ống đong, erlen, bình định mức, pipet, phễu chiết 2.1.2 Chuẩn bị hóa chất a Nước cất hai lần khử ion b Chuẩn vitamin C Vitamin C acid ascorbic 98.5% Bảo quản: Chuẩn gốc bảo quản -184oC, hạn sử dụng dựa theo khuyến cáo nhà sản xuất Tất dung dịch chuẩn phải chuẩn bị trước phân tích Dung dịch chuẩn gốc: Cân 11,4mg (±0,1mg) chất chuẩn Vitamin Vitamin C (acid ascorbic) vào bình định mức 25 ml, hịa tan định mức đến vạch nước đề ion Dung dịch H3PO4( pH3 ) lọc qua lọc dung môi đuổi hết bọt khí bể siêu âm + Lấy 11,4mg chuẩn gốc chuẩn đến vạch định mức bình 25ml nồng độ chuẩn 1: 456ppm + Lấy 1ml nồng độ chuẩn (456ppm) pha loãng làm lần ta nồng độ chuẩn 2: 76ppm + Lấy 1ml nồng độ chuẩn (79ppm) pha loãng làm lần ta nồng độ chuẩn 3: 19ppm Lắc 30 phút siêu âm phút Lọc dung dịch thu qua màng lọc dung môi 13mm - 0,45μm Thu dịch lọc vào vial dùng cho HPLC, tiêm vào máy Có ghi ký hiệu mẫu chuẩn c Acid phosphoric tinh khiết phân tích Cách tiến hành Lấy vài mẫu Acid phosphoric dạng tinh thể cho vào cốc 500ml, sau cho từ từ nước cất lần vào để hòa tan Acid phosphoric từ dạng rắn sang dạng lỏng dùng máy đo PH để đưa dung dịch Acid phosphoric pH =3 d Methanol, HPLC Pha động dùng phân tích vitamin C bao gồm Acid phosphoric methanol với tỷ lệ pha trộn Methanol: Acid phosphoric (60:40) GVHD: TS Đinh Thị Trƣờng Giang 36 SVTH: Bùi Văn Bảo Nghiên cứu xác định Vitamin C số loại trái phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC) 2.2 Phƣơng pháp chuẩn bị mẫu 2.2.1 Phƣơng pháp lấy mẫu Các mẫu trái như: Ổi, khế, quýt, táo tây lấy cách ngẫu nhiên quầy hàng chợ Bến thủy, thành phố Vinh vào ngày 7/10/2013 29/10/2013 Các mẫu Ổi, khế, quýt, táo tây bảo quản nơi khô ráo, tránh ánh sáng mặt trời 2.2.2 Mẫu phân tích Để xác định hàm lượng vitamin C mẫu Ổi, khế, quýt, táo tây ta cần phải xử lý mẫu bơm vào máy HPLC - Xử lý mẫu sơ bộ: mẫu Ổi, khế, quýt, táo tây nghiền nhuyễn sau đem cân khối lượng mẫu cho vào bình định mức 100 ml, định mức đến vạch nước đề ion Lắc kỹ, cho vào bể siêu âm, siêu âm mẫu 30 phút Lọc dung dịch thu giấy lọc, sau lọc hút chân khơng với mục đích làm mẫu Dung dịch sau lọc tiếp tục lọc qua màng lọc 13mm 0,45μm Thu dịch lọc vào vial dùng cho HPLC, tiêm vào máy 2.2.3 Sơ đồ xử lý chất chuẩn mẫu - Chất chuẩn Vitamin C (acid ascorbic) Mẫu bơm vào HPLC Cân xác 11,4mg Màng lọc GVHD: TS Đinh Thị Trƣờng Giang Định mức pha động Cho vào bình dịnh mức 25ml Lọc hút chân không 37 Ly lâm 5000v/p (5p) Siêu âm 30 phút SVTH: Bùi Văn Bảo Nghiên cứu xác định Vitamin C số loại trái phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC) - Mẫu: Ổi, khế, táo tây Mẫu bơm vào HPLC Màng lọc Định mức pha động Cho vào bình dịnh mức 100ml Cân xác 15g Mẫu : ổi, khế, táo tây Lọc hút chân không Ly lâm 5000v/p (5p) Siêu âm 30 phút - Mẫu: quýt Lấy 5ml dịch Vắt lấy nước Mẫu quýt Mẫu bơm vào HPLC Màng lọc Siêu âm 30 phút Lọc hút chân không 2.3 Tiến hành máy sắc ký HPLC [8] Điều kiện sắc ký: - Cột sắc ký: cột sắc ký pha đảo RP-18e (150x4.8; 5μm ) cột bảo vệ - Tốc độ dòng: 0,7 ml/phút - Pha động: methanol:H3PO4 (60:40) - Nhiệt độ lị cột: nhiệt độ phịng - Bước sóng cài đặt cho đầu dò UV: 254 nm Điều kiện Detectơ: Detectơ UV bước sóng 254 nm Loại detectơ cho phép ghi phổ hấp thụ UV-VIS vitamin C tách sắc ký đồ Với trợ giúp máy tính, liệu phổ lưu trữ sau đem so sánh với phổ hấp thụ chất GVHD: TS Đinh Thị Trƣờng Giang 38 SVTH: Bùi Văn Bảo Nghiên cứu xác định Vitamin C số loại trái phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC) chuẩn, nhờ cho phép khẳng định phần cấu trúc vitamin C đánh giá độ pic 2.4 Đánh giá phƣơng pháp 2.4.1 Khảo sát giới hạn phát (LOD) giới hạn xác định (LOQ) phương pháp Giới hạn phát (LOD) định nghĩa nồng độ nhỏ chất phân tích mà có tín hiệu sắc ký lớn gấp lần tín hiệu đường Đây thơng số đặc trưng cho độ nhạy phương pháp LOD = tín hiệu chiều cao pic/nhiễu đường ≥ Giới hạn định lượng (LOQ) nồng độ chất phân tích mà cho tín hiệu gấp 10 lần tín hiệu đường Cơng thức tính : 3*Sy 10*LOD LOD = LOQ = a a hồi quy a hệ số góc phương trình Độ lệch chuẩn Sy: Σ( Xi – Xtb )2 Sy = ΣXi Xtb = n-1 n 2.4.2 Khảo sát độ lặp n-1 n Độ lặp lại dùng để đánh giá định lượng độ phân tán kết Đại lượng đặc trưng cho độ gần giá trị trung bình hai hay nhiều phép đo nhận điều kiện giống Đánh giá độ lặp dựa độ lệch chuẩn tương đối (RSD) Cơng thức tính Xtb = n x n i 1 n s GVHD: TS Đinh Thị Trƣờng Giang  (x i 1 i  xtb ) n 1 39 SVTH: Bùi Văn Bảo Nghiên cứu xác định Vitamin C số loại trái phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC) 2.5 Đánh giá hiệu suất thu hồi Công thức H= Trong đó: Ctc - Cm x 100% Cc Ctc : Nồng độ vitamin C có mẫu thêm chuẩn Cm: Nồng độ vitamin C mẫu trước thêm chuẩn Cc: Nồng độ chuẩn vitamin C thêm vào mẫu GVHD: TS Đinh Thị Trƣờng Giang 40 SVTH: Bùi Văn Bảo Nghiên cứu xác định Vitamin C số loại trái phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC) Chƣơng KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Xác định khoảng tuyến tính đƣờng chuẩn Vitamin C [4] Dãy chuẩn vitamin C khảo sát có nồng độ sau:19ppm; 76ppm; 456ppm Phân tích chuẩn nói xác định phương trình hồi quy tuyến tính dựa vào diện tích pic Bảng 3.1 Diện tích peak vitamin C tƣơng ứng với nồng độ chuẩn Nồng độ chuẩn Diện tích píc 19 147,82509 76 823,73474 456 6422,27002 A B R2 14,494 -197,44 0,9995 Sử dụng chương trình Microsoft Excel để xây dựng đường chuẩn, ta có phương trình đường chuẩn xác định hàm lượng vitamin C sau: Phương trình hồi qui đường chuẩn theo diện tích peak có dạng: y = 14,494x – 197,44 x nồng độ vitamin C y tích pic Hệ số hồi quy tuyến tính R2 =0,9995 Hình 3.1 Đƣờng chuẩn biểu thị mối quan hệ diện tích pic thu đƣợc nồng độ chuẩn vitamin C GVHD: TS Đinh Thị Trƣờng Giang 41 SVTH: Bùi Văn Bảo Nghiên cứu xác định Vitamin C số loại trái phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC) 3.2 Kết định lƣợng hàm lƣợng vitamin C mẫu trái Từ giá trị diện tích peak đo ta tính hàm lượng C (ppm) - Sau ta tính hàm lượng vitamin C (ppm) có mẫu ổi, khế, qt, táo tây tính theo cơng thức: C = (C0/ m) Vdm.f Trong đó: C : nồng độ vitamin C có mẫu tính ppm Co: nồng độ vitamin C dịch chiết tính từ đường chuẩn, tính theo ppm Vdm: Thể tích bình định mức mẫu ml f :hệ số pha lỗng (nếu có) m :khối lượng mẫu g Bảng 3.2 Kết phân tích hàm lƣợng vitamin C mẫu Khối Mẫu Các mẫu Diện tích pic C (ppm) 159,47372 475,10959 197,92050 526,28844 26,80916 191,13196 517,25178 72,72385 856,61951 968,81170 807,53284 923,69493 68,80408 799,80627 916,59335 94,06880 1156,98279 376,27520 1379,92004 435,31392 105,45236 1330,98657 421,80944 23,62631 145,33595 157,56125 103,67512 138,54558 91,88188 133,12099 C0 (ppm) lương mẫu (g) 24,62493 Khế Ổi Quýt Táo tây 27,27753 69,33716 108,82848 20,77491 5,183 15,013 5ml 14,995 19,96149 3.3 Đánh giá phƣơng pháp [9] 3.1 Xác định độ lặp lại phương pháp Theo lý thuyết thống kê, đại lượng đặc trưng cho độ lặp lại độ lệch chuẩn SD hệ số biến thiên CV% (RSD) GVHD: TS Đinh Thị Trƣờng Giang 42 SVTH: Bùi Văn Bảo Nghiên cứu xác định Vitamin C số loại trái phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC) Mỗi mẫu đo lập lại lần để tính độ lệch chuẩn tương đối (CV%) Độ lặp lại phương pháp đánh giá qua độ lệch chuẩn tương đối (RSD) Dựa vào nồng độ tương ứng tính kết trung bình tính độ lệch chuẩn hệ số biến thiên theo cơng thức đây: Bảng 3.3 Kết trung bình, độ lệch chuẩn, hệ số biến thiên mẫu khế, ổi, quýt, táo tây Mẫu Khế Mẫu Ổi Mẫu Quýt Mẫu táo tây Khối Nồng độ Khối Nồng độ Thể Nồng độ Khối Nồng độ lượng (ppm) lượng (ppm) tích (ppm) lượng (ppm) 5,183 475,10959 15,013 968,81170 5,0 376,27520 14,995 157,56125 5,183 526,28844 15,013 923,69493 5,0 435,31392 14,995 138,54558 5,183 517,25178 15,013 916,59335 5,0 421,80944 14,995 133,12099 TT Xtb 506,21660 942,36666 411,13285 143,07594 S 27,31657 29,25950 30,93355 12,83451 5,39622% 3,10490% 7,52398% 8,97042% CV (%) Giá trị LOD LOQ phương pháp qua lần tiêm mẫu mẫu thêm chuẩn 1ml nồng độ 456ppm ta thu kết bảng sau: Bảng 3.4 Giá trị LOD LOQ Giá trị Mẫu (ppm) LOD 0,01060 LOQ 0,03533 Qua bảng số liệu ta thấy phương pháp có khoảng giới hạn phát khoảng định lượng nhỏ chứng tỏ thiết bị có độ nhạy cao, phát hàm lượng vitamin C dạng vết có mẫu phân tích GVHD: TS Đinh Thị Trƣờng Giang 43 SVTH: Bùi Văn Bảo Nghiên cứu xác định Vitamin C số loại trái phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC) 3.3.2 Đánh giá tính tốn giới hạn phát giới hạn định lƣợng - Giá trị trung bình hàm lượng vitamin C mẫu khế là: Xtb = n  x = 506,21660 n i 1 n s  (x i 1 i  xtb ) = 27,31657 n 1 27,31657 S  100 =  100 = 5,39622% 506,21660 xtb Độ lệch chuẩn tương đối: CV(%) = - Giá trị trung bình hàm lượng vitamin C mẫu ổi là: Xtb = n  x = 942,36666 n i 1 n  (x s Độ lệch chuẩn: Độ lệch chuẩn tương đối: CV(%) = i 1 i  xtb ) n 1 = 29,25950 29,25950 S  100 =  100 = 3,10490% 942,36666 xtb - Giá trị trung bình hàm lượng vitamin C mẫu quýt là: Xtb = n  x = 411,13285 n i 1 n  (x i 1 Độ lệch chuẩn: s Độ lệch chuẩn tương đối: CV(%) = i  xtb ) = 30,93355 n 1 30,93355 S  100 =  100 = 7,52398% 411,13285 xtb - Giá trị trung bình hàm lượng vitamin C mẫu táo tây là: Xtb = n  x = 143,07594 n i 1 n Độ lệch chuẩn: s  (x i 1 Độ lệch chuẩn tương đối: CV(%) = GVHD: TS Đinh Thị Trƣờng Giang i  xtb ) n 1 = 12,83451 12,83451 S  100 =  100 = 8,97042% 143,07594 xtb 44 SVTH: Bùi Văn Bảo Nghiên cứu xác định Vitamin C số loại trái phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC) 3.3.3 Xác định hiệu suất thu hồi Để xác định hiệu suất thu hồi tiến hành lựa chọn mẫu ngẫu nhiên để tiến hành Mẫu chọn mẫu khế có nồng độ ban đầu Cm Cho 1ml dung dịch chuẩn vitamin C có nồng độ 456ppm vào mẫu ( Cc) Sâu thêm dung dịch chuẩn vào mẫu, xử lý mẫu sau xác địnhlại máy HPLC ta nồng độ Ctc Sau ta tính hàm lượng vitamin C (ppm) có mẫu tính theo cơng thức: C= Co Vdm.f m Ta tiếp tục tính hiểu suất thu hồi H= Trong đó: Ctc - Cm x 100% Cc Ctc : Nồng độ vitamin C có mẫu thêm chuẩn Cm: Nồng độ vitamin C mẫu trước thêm chuẩn Cc: Nồng độ chuẩn vitamin C thêm vào mẫu Ctc = 45,26956 Co Vdm.f = 100 = 886,24826 m 5,108 H= 886,24826 - 506,21660 100% = 83,34% 456 Các sắc đồ phân tích vitamin C chuẩn mẫu trái 4.1 Sắc đồ dung dịch chuẩn Vitamin C Hình 3.2 Sắc đồ mẫu chuẩn có nồng độ 19ppm GVHD: TS Đinh Thị Trƣờng Giang 45 SVTH: Bùi Văn Bảo Nghiên cứu xác định Vitamin C số loại trái phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC) Hình 3.3 Sắc đồ mẫu chuẩn có nồng độ 76ppm Hình 3.4 Sắc đồ mẫu chuẩn có nồng độ 456ppm GVHD: TS Đinh Thị Trƣờng Giang 46 SVTH: Bùi Văn Bảo Nghiên cứu xác định Vitamin C số loại trái phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC) 3.4.2 Sắc đồ mẫu thử xác định Vitamin C Hình 3.5 Sắc đồ mẫu khế Hình 3.6 Sắc đồ mẫu ổi (pha loãng lần) GVHD: TS Đinh Thị Trƣờng Giang 47 SVTH: Bùi Văn Bảo Nghiên cứu xác định Vitamin C số loại trái phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC) Hình 3.7 Sắc đồ mẫu qt (pha lỗng lần) Hình 3.8 Sắc đồ mẫu táo tây GVHD: TS Đinh Thị Trƣờng Giang 48 SVTH: Bùi Văn Bảo Nghiên cứu xác định Vitamin C số loại trái phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC) KẾT LUẬN Qua q trình nghiên cứu thực nghiệm chúng tơi có kết đạt sau: Đã thiết lập điều kiện đo sắc ký - Tốc độ dòng: 0,7 ml/phút - Pha động: methanol: H3PO4 (60:40) - Nhiệt độ lò cột: nhiệt độ phòng Đã tiến hành xử lý chất chuẩn mẫu trái để phân tích vitamin C HPLC Đã tiến hành xây dựng đường chuẩn xác định vitamin C với độ tuyến tính cao Với R2 = 0,9995 Y = 14,494x – 149,44 Dã tiến hành định lượng vitamin C mẫu trái cây: ổi, khế, quýt, táo tây Với kết phân tích là: + Mẫu Khế : 506,21660ppm + Mẫu Ổi : 942,36666ppm + Mẫu Quýt : 411,13285ppm + Mẫu Táo tây: 143,07594ppm Đã tiến hành đánh giá phương pháp thông qua tính tốn độ lặp lại, giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng hiệu suất thu hồi Kết là: - Độ lặp lại vitamin C mẫu khế với độ lệch chuẩn tương đối: CV(%) = 5,39622% - Độ lặp lại vitamin C mẫu ổi với độ lệch chuẩn tương đối: CV(%) = 3,10490% - Độ lặp lại vitamin C mẫu quýt với độ lệch chuẩn tương đối: CV(%) = 7,52398% - Độ lặp lại vitamin C mẫu táo tây với độ lệch chuẩn tương đối: CV(%) = 8,97042% - Đã xác định giới hạn phát LOD phương pháp 0,01060ppm - Đã xác định giới hạn xác định phương pháp LOQ = 0,03533ppm - Hiệu suất thu hồi phương pháp H = 83,34% GVHD: TS Đinh Thị Trƣờng Giang 49 SVTH: Bùi Văn Bảo Nghiên cứu xác định Vitamin C số loại trái phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC) TÀI LIỆU THAM KHẢO Hoàng Kim Anh (2006), Hóa học thực phẩm, NXB Khoa học kỹ thuật Hoàng Minh Châu, Từ Vọng Nghi, Từ Văn Mặc (2002), Cơ sở hóa học phân tích, NXB Khoa Học Kỹ Thuật Th.S Trần Phương Chi, Giáo trình Đại cương cơng nghệ rau quả, Trường Đại học vinh PGS.TS Nguyễn Khắc Nghĩa (2000), Xử lí số liệu thống kê, Đại học Vinh Phạm Luân (1999), Cơ sở lý thuyết phân tích sắc ký lỏng hiệu suất cao, Đại học quốc Nguyễn Hữu Nhân (2005), Dinh dưỡng học, NXB Nông nghiệp Hà Nội Phạm Văn Sổ, Bùi thị Như Thuận (1991), Kiểm nghiệm lương thực, thực phẩm, Khoa hóa học thực phẩm, trường đại học Bách khoa Hà Nội Đào Hữu Vinh, Nguyễn Xuân Dũng cộng (1985), Các phương pháp sắc ký NXB Khoa Học Kỹ Thuật PGS.TS Trần Thị Xơ (2007), Hóa sinh I , Trường ĐH Bách khoa Khoa hóa ĐH Đà Nẵng Trang web 10 http://vi.wikipedia.org/wiki/T%C3%A1o_t%C3%A2y 11 http://vi.wikipedia.org/wiki/%E1%BB%94i 12 http://dc183.4shared.com/doc/yfSSxheZ/preview.html 13 http://www.pgrvietnam.org.vn/?lang=vi&tab=news&pid=21&cid=21&pages=4 14 http://tusach.thuvienkhoahoc.com 15 http://www.hoahocvietnam.com 16 http://www.hoahoc.org 17 http://www.chemvn.net 18 http://www.khoahoc.com.vn/doisong/ung-dung 19 http://www.thaythuoccuaban.com/vithuoc/quyt.htm 20 http://monaco.vn/baiviet/chitiet.xhtml?id=54 GVHD: TS Đinh Thị Trƣờng Giang 50 SVTH: Bùi Văn Bảo ... Bảo Nghiên c? ??u x? ?c định Vitamin C số loại trái phương pháp s? ?c ký lỏng hiệu cao (HPLC) GVHD: TS Đinh Thị Trƣờng Giang SVTH: Bùi Văn Bảo Nghiên c? ??u x? ?c định Vitamin C số loại trái phương pháp s? ?c. .. lựa chọn đề tài nghiên c? ??u ? ?Nghiên c? ??u GVHD: TS Đinh Thị Trƣờng Giang SVTH: Bùi Văn Bảo Nghiên c? ??u x? ?c định Vitamin C số loại trái phương pháp s? ?c ký lỏng hiệu cao (HPLC) x? ?c định vitamin C số loại. .. Văn Bảo Nghiên c? ??u x? ?c định Vitamin C số loại trái phương pháp s? ?c ký lỏng hiệu cao (HPLC) 2.5 Đánh giá hiệu suất thu hồi C? ?ng th? ?c H= Trong đó: Ctc - Cm x 100% Cc Ctc : Nồng độ vitamin C có mẫu