BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC VINH VÕ QUỐC OAI 1.1 NGHIÊN CỨU, XÁC ĐỊNH HÀM LƢỢNG VITAMIN D TRONG NẤM BẰNG PHƢƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO (HPLC) Chun ngành: Hóa phân tích Mã số: 60.44.01.18 LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC Người hướng dẫn khoa học: TS Mai Thị Thanh Huyền Vinh, 2014 Lời cảm ơn Lu n v n c th c hi n t i ph ng th nghi m chuy n ề H a ph n t ch - Khoa H a học - trường Đ i học Vinh Tác giả xin y t l ng i t n ch n th nh v s u s c tới Trường Đ i học Vinh ph ng o t o sau i học Trung T m Th c H nh th nghi m trường Đ i học Vinh trường THPT Mai Thúc Loan v ồng nghi p nh m cộng tác nghi n cứu - phân tích vitamin D nấm Đặc i t tác giả gửi lời cảm n ch n th nh s u s c tới TS Mai Thị Thanh Huyền ã tr c ti p hướng dẫn giúp ỡ với dẫn khoa học quý giá suốt trình triển khai nghi n cứu v ho n th nh ề t i Tác giả mong nh n c s ng g p ph quý thầy cô nh khoa học ọc giả v ình n ồng nghi p MỤC LỤC Hệ thống kí hiệu viết tắt MỞ ĐẦU CHƢƠNG TỔNG QUAN 1.1 Vitamin D .8 1.1.1 Giới thi u cấu t o ph n lo i v t n gọi 1.1.2 Vai trò vitamin D ối với c thể .9 1.1.3 Nguồn cung cấp vitamin D cho c thể 11 1.2 Các phư ng pháp xác ịnh vitamin D 13 1.2.1 Phư ng pháp thử nghi m sinh học [28] [34] 13 1.2.2 Phư ng pháp quang ph 14 1.2.3 ác phư ng pháp xét nghi m miễn dịch 15 1.2.4 Phư ng pháp s c ký l ng hi u n ng cao (HPL ) 18 1.3 T ng quan nghi n cứu xác ịnh vitamin D nấm 21 1.4 Đánh giá l a chọn phư ng pháp 26 1.5 S lư c lý thuy t HPL 27 1.5.1 Giới thi u 27 1.5.2 C ch trình tách HPL 29 1.5.3 Nguy n lý ho t ộng h thống HPL 29 CHƢƠNG PHƢƠNG PHÁP THỰC NGHIỆM 31 2.1 H a chất thi t ị v d ng c 31 2.1.1 H a chất 31 2.1.2 Thi t ị v d ng c 31 2.2 Thu th p v ảo quản mẫu 32 2.3 Xử lý mẫu 33 2.4 huẩn ị dung dịch vitamin D2 cho phép o HPL 34 2.5 L a chọn v c i ặt v n h nh thi t ị HPL 35 2.6 huẩn ị máy trước ti n h nh ph n t ch 35 2.7 Khảo sát ph hấp th tia UV vitamin D2 dung dịch 36 2.7.1 Nghi n cứu ảnh hưởng th nh phần pha ộng 36 2.7.2 Nghi n cứu ảnh hưởng nhi t ộ 36 2.8 X y d ng ường chuẩn xác ịnh h m lư ng vitamin D dung dịch 36 2.9 Phư ng pháp khảo sát ánh giá 36 2.9.1 Khoảng n t nh v ường chuẩn ịnh lư ng phư ng pháp 36 2.9.2 Khảo sát ộ lặp l i 37 2.9.3 Khảo sát giới h n phát hi n (LOD) v giới h n ịnh lư ng (LOQ) phư ng pháp 38 2.9.4 Xác ịnh hi u suất thu hồi 38 CHƢƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 39 3.1 Khảo sát phư ng pháp o 39 3.1.1 Khảo sát ph hấp th tia UV vitamin D2 dung dịch 39 3.1.2 Nghi n cứu ảnh hưởng th nh phần pha ộng 39 3.1.3 Nghi n cứu ảnh hưởng tốc ộ d ng 41 3.1.4 Nghi n cứu ảnh hưởng nhi t ộ 42 3.1.5 K t khảo sát phư ng pháp o 43 3.2 Xác ịnh khoảng n t nh v ường chuẩn vitamin D2 43 3.3 Khảo sát ộ lặp l i máy 49 3.4 Xác ịnh giới h n phát hi n giới h n ịnh lư ng phư ng pháp 51 3.4.1 Giới h n phát hi n (LOD) 51 3.4.2 Giới h n ịnh lư ng(LOQ) 52 3.5 Xác ịnh ộ l ch chuẩn (SD) v ộ l ch chuẩn tư ng ối RSD( ) phép phân tích vitamin D2 tr n mẫu nấm 52 3.6 Xác ịnh hi u xuất thu hồi 53 3.7 K t ph n t ch số mẫu nấm 54 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 59 TÀI LIỆU THAM KHẢO 62 Hệ thống kí hiệu viết tắt 25(OH)D : 25-hydroxyl vitamin D 25(OH)D2 : 25-hydroxyl vitamin D2 25(OH)D3 : 25-hydroxyl vitamin D3 BHT : butylate hydroxytoluen BSTFA :N,O-bis(trimethylsilyl)trifluoroacetamide DM : Chất khô (dry matter) ECLIA : Ph n t ch miễn dịch quang h a (electro chemiluminescence immunoassay ) EtOH : Etanol FTIR : Phép phân tích Fourier hồng ngo i (Fourier transform infrared) HPLC : S c ký l ng hi u n ng cao IT : Bẫy ion ( Ion trap) IS :Chất nội chuẩn (internal standard) LC : S c k l ng (Liquid chromatography) MeOH : Metanol MS : Ph khối (Mass spectrometry) MTBE : Methyl-tert-butyl ether PFP : Pentafluorophenyl-propyl RIA : ph n t ch miễn dịch ph ng x (Radioimmunoassay) SPE : chi t pha r n (Solid Phase Extraction) UPLC : S c ký l ng hi u n ng cao UV : Tia tử ngo i DAD : Đầu d mảng diot RMSE : Độ l ch khởi ộng (root mean square error) MỞ ĐẦU L d chọn ề t i Vitamin D hay c n gọi l vitamin mặt trời l lo i vitamin ặc i t so với lo i khác Vitamin D c vai tr quan trọng với ời sống người n ng vai tr quan trọng s phát triển ho n thi n trì s n ịnh xư ng r ng n tham gia v o iều h a chức n ng số gen ngo i c n tham gia số chức n ng như: i ti t insulin hormon c n giáp h miễn dịch phát triển h sinh sản v da nữ giới Một số nghi n cứu cho thấy thi u vitamin D thai ph c thể sinh nhẹ c n s t ng trưởng ch m trẻ ch o ời ủ tháng [14],[22] Tình tr ng thi u vitamin D tr n th giới nước nhi t ới nghi m trọng [24] Theo số nghi n cứu tình hình thi u vitamin D tr n th giới l 40-50 Thái lan v Malayxia 50 c Mỹ khoảng Nh t v H n Quốc 80-90 nước c Âu v 50-70% 63% ph nữ châu Á Ở Vi t Nam theo số nghi n cứu tình tr ng thi u dinh dưỡng học sinh tiểu học h n 50 học sinh tiểu học thi u h t vitamin D Để nh n ủ vitamin D ngo i vi c cho c thể ti p xúc với ánh n ng c l i cho c thể thường xuy n cần thi t phải sung th m nguồn vitamin D từ nguồn th c phẩm n uống h ng ng y Nấm l l nguồn th c phẩm gi u vitamin D2 v dinh dưỡng c vai tr quan trọng x y d ng phần vitamin D2 h ng ng y Tuy nhi n nguồn nấm tr n thị trường a d ng chủng lo i v nguồn gốc, nhiều lo i nấm không rõ nguồn gốc không ảm ảo chất lư ng tr n lan tr n thị trường H n ánh giá giá trị dinh dưỡng chung h m lư ng vitamin D lo i nấm tr n ịa n Ngh n H T nh ang c n h n ch Vì v y vi c ph n t ch h m lư ng vitamin D2 nấm l cần thi t vừa ể x y d ng quy trình ịnh lư ng chúng nấm vừa ể g p phần ánh giá h m lư ng vitamin D2 c nấm g p phần x y d ng ảng th nh phần dinh dưỡng th c phẩm ịa phư ng nhiều phư ng pháp k thu t ánh giá h m lư ng vitamin D th c phẩm ộ nh y v phư ng pháp s c ký l ng hi u n ng cao cho phép ph n t ch với ộ chọn lọc cao Từ k t nghi n cứu vitamin D n i chung v vitamin D2 nấm n i ri ng tr n iều ki n s n c ph ng th nghi m với mong muốn x y d ng phư ng pháp ph n t ch phù h p v quy trình xử lý mẫu hi u tr n ối tư ng nấm ể ph n t ch vitamin D ã chọn ề t i “ NGHIÊN CỨU, XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG VITAMIN D TRONG NẤM BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HI U N NG C O(HPLC)” Mục ích nghiên cứu X y d ng quy trình ph n t ch vitamin D2 hi u n ng cao HPL từ ng phư ng pháp s c ký l ng xác ịnh h m lư ng chúng số mẫu nấm Mục tiêu nghiên cứu + Thi t l p c phư ng pháp ph n t ch ảm ảo ộ ch nh xác ộ hội t ộ nh y cao xác ịnh c LOD v LOQ phư ng pháp p d ng phư ng pháp ể khảo sát xác ịnh h m lư ng vitamin D2 số lo i nấm trước v sau chi u x Đối tƣ ng v h ng tia UV vi nghiên cứu ác mẫu nấm c thu th p ch tr n ịa n th nh phố Vinh H T nh v số lo i nấm t nhiên vườn quốc gia Pù Mát CHƢƠNG TỔNG QUAN 1.2 Vitamin D 1.2.1 Gi i thiệu, cấu t , h n i v tên gọi Vitamin l nh m chất cần thi t cho ho t ộng sống ất kỳ c thể n o v chúng c khả n ng nồng ộ thấp ho n th nh chức n ng xúc tác c thể sinh v t Vitamin D c x p nh m vitamin h a tan dầu éo với vitamin A, vitamin E, vitamin K Vitamin D c phát hi n n m 1922 c ph n l p n m 1932 tìm cấu trúc n m 1936 n n m 1959 c t ng h p nh n t o [11] Thu t ngữ vitamin D dùng ể nh m h p chất sterol c cấu trúc tư ng t c ho t t nh ph ng ngừa iều trị c i xư ng nhờ l m t ng khả n ng hấp thu canxi v photphat ường ruột ác h p chất ao gồm: vitamin D2 (ergocalciferol), vitamin D3 (cholecalciferol), vitamin D4, D5, D6, D7 ấu trúc d ng vitamin c trình y hình 1.1 Đối với người h p chất quan trọng nh m vitamin D vitamin D3 vitamin D2 c ưa v o c thể qua ường ti u h a v i n pháp y t khác thể c thể t ng h p vitamin D da từ cholesterol da c ti p xúc với tia UV (c ánh n ng mặt trời) th n c n c m nh danh l "vitamin ánh n ng" [18] Mặc dù vitamin D thường c gọi l vitamin theo ngh a hẹp n l vitamin thi t y u ch ộ n ởi hầu h t ộng v t c vú t nhi n ều c thể t t ng h p ủ cho c thể ti p xúc h p lý với tia n ng mặt trời Hình 1.1 Khái quát cấu trúc v chuyển hóa d ng vitamin D 1.2.2 Vai trò vitamin D ối v i thể Vitamin D ng vai tr quan trọng s phát triển xư ng Vitamin D c vai tr quan trọng với s hấp th canxi ruột m canxi cần thi t cho ho t ộng tim c p v thần kinh l th nh phần chủ y u cấu t o n n xư ng v r ng ồng thời thi u ể tham gia v o q trình ơng máu Trẻ em thi u canxi ch m lớn lùn c i xư ng xư ng i n d ng r ng khơng ều r ng dị hình chất lư ng r ng v lớn thi u vitamin D c thể dẫn n ị s u [15], [21] Người nh loãng xư ng [21] Một lư ng nh vitamin D ng y l m giảm nguy c m c nh cao huy t áp, vitamin D giúp l m t ng khả n ng miễn dịch, ngừa số nh ung 10 thư ph ung thư i n l m ch m trình phát triển ung thư ặc i t l ung thư gan, i tr c tràng [10], [12], [19] Thi u vitamin D thai kì c thể sinh nhẹ c n ặc i t n u thi u vitamin D tháng ầu thai kì, sinh ị h n ch t ng trưởng gấp ôi s thi u vitamin D thai kì g y t n thư ng não ph c hồi [30] Trẻ em n u không c cung cấp ủ vitamin D ảnh hưởng ns phát triển xư ng chất xư ng v s n không c vôi h a ầy ủ s n phát triển không ình thường l m xư ng i n d ng [30] ác tri u chứng cho i t trẻ thi u vitamin D: Thần kinh ị k ch th ch (quấy kh c ngủ không y n giấc hay gi t l trẻ tháng) hay mồ hôi trộm lúc trời l nh co gi t sốt cao c thể c c n kh thở với ti ng thở r t Nặng h n trẻ y u c v c s i n i xư ng ầu lồng ng c tay ch n c - dây ch ng v cột sống N u thi u vitamin D trẻ em ị c i xư ng; trẻ ị c i xư ng ảnh hưởng n phát triển chiều cao v tầm v c trẻ sau n y [10], [12], [15], [21] Vitamin D c ảnh hưởng hưởng n nồng ộ serotonin não g y ảnh n t m tr ng người Serotonin c n c t n gọi l ho c môn h nh phúc suy giảm serotonin n t m tr ng uồn chán dễ cáu gi n khơng thể kiểm sốt c c n ốc ồng thi u vitamin D kéo d i dễ dẫn tới trầm cảm[40] Do t ti p xúc với ánh n ng mặt trời dễ ị thi u h t vitamin quan trọng n y dù c n ch ộ l nh m nh v t p thể d c ều ặn [11] , [12] Thi u vitamin D l nh ặc hữu d nh cho người lớn Một số lư ng lớn trẻ em v thi u ni n kh e m nh thi u h t vitamin D [20], [36] Một nghi n cứu d a tr n d n số 2.972 ph nữ ộ tu i sinh ẻ Mỹ tìm thấy 42 ph nữ Mỹ gốc Phi Mỹ c mức 25(OH)D < 15 ng/ml v 12 80% ) Độ nh y phư ng pháp ã c phản ánh qua giá trị giới h n phát hi n (LOD) v giới han ịnh lư ng (LOQ) c t nh toán theo quy t c Giá trị LOD l : 3ppm; giá trị LOQ l : 66 ppm 60 Kiến nghị Ti p t c mở rộng nghi n cứu xác ịnh vitamin D2 nấm v nguồn th c phẩm khác theo hướng t ng giới h n ịnh lư ng giới h n phát hi n t ng hi u suất thu hồi n giản quy trình ph n t ch mẫu nghi n cứu nghi n cứu phư ng pháp ph n t ch vitamin D hi u khác Ph n t ch vitamin D tr n nhiều ối tư ng g p phần x y d ng ảng th nh phần th c phẩm ịa phư ng Trong trình ph n t ch số mẫu nấm khô nấm tư i c n xuất hi n nhiễu g y kh kh n cho vi c ịnh lư ng vitamin D nghi n cứu ti p theo cần theo hướng lo i nhiễu Vi c nghi n cứu xác ịnh vitamin D2 nấm sau chi u x t ầu cần phải nghi n cứu nhiều thông tin h n iều ki n tối ưu khác thời gian chi u x tối ưu ảnh hưởng cảm quan n sản phẩm từ c ề xuất ứng d ng nuôi trồng nấm ể thu c sản phẩm c giá trị dinh dưỡng cao 61 62 TÀI LIỆU THAM KHẢO T i iệu tiếng việt Ban k thu t ti u chuẩn quốc gia (2011) TCVN 8973-2011 - H nội : vi t nam Ph m Lu n (1999) sở lý thuy t ph n t ch s c ký l ng hi u suất cao Đ i học Quốc gia H Nội Nguyễn Kh c Ngh a (1997) p d ng toán học thống k ể xử lý số li u th c nghi m Đ i học Vinh T i iệu tiếng Anh AOAC 980.26, (1980), Vitamin D in multivamin Preparations - Liquid Chromatographic Method AOAC 981.17 (1982), Vitamin D in Fortified Milk and Milkpowder Liquid Chromatographic Method AOAC 982.29 (1983), Vitamin D in Mixed Feeds,Premixes,and Pet Foods - Liquid Chromatographic Method AOAC 992.26, (1995),Vitamin D3 (cholecalciferol) in ready-to-feed milk-based infant formula Liquid chromatographic method AOAC 995.05, (1995) Vitamin D in Infant Formulas and Enteral Products Liquid Chromatographic Method AOAC 2002.05, (2002), Determination of Cholecalciferol (Vitamin D3) in Selected Foods Liquid Chromatography 10 A Catharine Ross et al, (2011), Dietary Reference Intakes For Calcium And Vitamin D, National Academy of Sciences, Washington, D.C 11 Adriana S Dusso et al, (2005), Vitamin D, the American Physiological Society, Washington 63 12 Allison A Yates et al,(2009), Dietary Reference Intakes For Calcium, Phosphorus, Magnesium, Vitamin D, and Fluoride, National Academy of Sciences, Washington, D.C 13 nders Staffas et al (2003) “Determination of (Vitamin D3) in Selected Foods y Liquid holecalciferol hromatography” Journal Of AOAC International,Vol 86 14 shraf Soliman et al (2013) “ linical iochemical and radiological manifestations of vitamin D deficiency in newborns presented with hypocalcemia “ Indian Journal of Endocrinology and Meta olism Vol 17 15 tisha Pandya et al (2010) “ case series of vitamin D deficiency in mothers affecting their infants” SNL ll rights reserved , UK, Vol 16 Ball George F.M (2006) “Vitamins in Foods-Analysis Bioavailability and Sta ility” Taylor & Francis Group Vol 13 17 Christine L Taylor et al, (2010), Dietary Reference Intakes for Calcium and Vitamin D, National Academy of Sciences Washington DC 18 Clifford J Rosen , (2011) “Vitamin D Insufficiency” Massachusetts Medical Society 19 Dana Bailey et al (2013) “ nalytical measurement and clinical relevance of vitamin D3 C3-epimer” Elsevier Inc linical Biochemistry 20 Daniel E Roth et al (2005) “ re National Vitamin D Guidelines Sufficient to Maintain dequate Blood Levels in hildren?”, Canadian journal of public health, Vol 96 21 DeLuca Hector F;(2004), Overview of general physiologic features and functions of vitamin D, American Society for Clinical Nutrition, USA 22 Gernand D et al (2013)” Maternal serum 25-hydroxyvitamin D and measures of new orn and placental weight in a U.S” J lin Endocrinol Meta Vol 98 64 23 Holick et al, (2010), Vitamin D:physiology, molecular biology, and clinical applications,Humana press 24 Holick MF et al ( 2008) “Vitamin D deficiency: a worldwide pro lem with health consequences” 2008© merican Society for linical Nutrition Vol 87 25 Hollis Bruce W.(2005) “ irculating 25-hydroxyvitamin D levels indicative of vitamin D sufficiency: implications for establishing a new harleston” merican Society for Nutritional Sciences 26 Indyk et al (1985) “The determination of vitamin D in supplemented milk powders by HPLC” Incorporation of internal standard Vol 20 27 J.N Thompson et al, (1993) Determination of cholecalciferol in meat and fat from livestock fed normal and excessive quantities of vitamin D, Elsevier Ltd, Vol 46 28 Jette Jako sen et al ( 2003) “ newmethod for the determination of vitamin D3 and 25-hydroxyvitamin D3 in meat” Journal of Food omposition and Analysis, Soborg, Denmark : Elsevier 29 Jette Jako sen (2014) “Sta ility of vitamin D in food Fstuffs during cooking” Food hemistry So org Denmark : Elsevier,Vol 30 JJ annell et al (2008) “Diagnosis and treatment of vitamin D deficiency” Informa UK Ltd alifornia 31 John J annell et al (2008) “ Use of Vitamin D in linical Practice” Alternative Medicine Review, Volume 13 32 Katherine M Phillips et al (2012) “Vitamin D4 in Mushrooms lermont Universite” France ugust 2012 Vol 33 Koshy KT et al (1997) “High-performance liquid chromatographic method for the determination of 25-hydroxycholecalciferol in the bovine liver, kidney and muscle” Journal of gricultural and Food hemistry Vol 25 65 34 Liu Yang (2013) “ Investigation of vitamin d3 content in fortified fluid milk and the sta ility of vitamin d3 in milk to light exposure” Vancouve 35 Lone Hymoller et al (2011) “Vitamin D analysis in plasma y high performance liquid chromatography (HPLC) with C30 reversed phase column and UV detection – Easy and acetonitrile-free” Elsevier B.V 36 M hapuy et al (1997) “Prevalence of Vitamin D Insufficiency in an dult Normal Population” European Foundation for Osteoporosis and the National Osteoporosis Foundation, Vol 37 Markus Herrmann et al (2010) “ new quantitative L tandem mass spectrometry assay for serum 25-hydroxy vitamin D” Elsevier Inc Vol 75 38 Maximilian Wittig et al (2013) “Single-run analysis of vitamin D photoproducts in oyster mushroom (Pleurotus ostreatus) after UV-B treatment” Journal of Food Composition and Analysis, Hannover, Germany, elsevier Inc 39 Michael D Kalaras et al (2007) “Vitamin D2 Enrichment In Fresh Mushrooms Using Pulsed UV Light” Penn State University : Department of Food Science 40 Patrick et al (2014) “Vitamin D hormone regulates serotonin synthesis Part 1: relevance for autism” F SEB Vol 28 41 Sundar Rao Koyyalamudi et al (2011) “ oncentration of vitamin D2 in white utton mushrooms ( garicus isporus) exposed to pulsed UV light” Journal of Food Composition and Analysis, Elsevier Inc 42 Takeuchi et al (1984) “performance liquid chromatographic determination of vitamin D in foods, feeds and pharmaceuticals by successive use of reversed-phase and straight-phase columns” Journal of Nutritional Science and Vitaminology, Tokyo, Vol 30 43 Ulrich Krings (2014) “Dynamics of sterols and fatty acids during UVB treatment of oyster mushroom” Elsevier Food hemistry 149 66 44 Wendy L Arneson et al,( 2013) “Current Methods for Routine Clinical Laboratory Testing of Vitamin D Level” Lab Medicine, Vol 44 45 WLena Jafri et al,(2011) “Comparison of high performance liquid chromatography, radio immunoassay and electrochemiluminescence immunoassay for quantification of serum 25 hydroxy vitamin D” Karachi : Elsevier, Clinical Biochemistry 46 Wiraj J Jasinghe et al (2005) “Ultraviolet irradiation: The generator of Vitamin D2 in edible mushrooms” Elsevier, sigapore, Food Chemistry ... nấm ể ph n t ch vitamin D ã chọn ề t i “ NGHIÊN CỨU, XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG VITAMIN D TRONG NẤM BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HI U N NG C O(HPLC)” Mục ích nghiên cứu X y d ng quy trình ph n t ch vitamin. .. (ergocalciferol), vitamin D3 (cholecalciferol), vitamin D4 , D5 , D6 , D7 ấu trúc d ng vitamin c trình y hình 1.1 Đối với người h p chất quan trọng nh m vitamin D vitamin D3 vitamin D2 c ưa v o c thể... i ã c sử d ng ể ph n t ch ịnh lư ng vitamin D Trong pha r n vitamin D2 c thể c ph n i t với vitamin D3 d a v o ỉnh ph vitamin D2 t i 907 cm-1 [34] Ph FTIR ặc trưng tinh thể vitamin D2 D3 ã c mô